Misurazione della temperatura corpo del mouse utilizzando il termometro a infrarossi durante passiva anafilassi sistemica e la valutazione di allergia alimentare

Sommario

Qui vi presentiamo un nuovo metodo per misurare con precisione le differenze di temperatura del corpo in passivo anafilassi sistemica (PSA) e modelli di mouse allergia alimentare utilizzando un termometro a infrarossi. Questa procedura è stata duplicata con precisione nei precedenti risultati di PSA.

Abstract

Misurazione di temperatura del corpo del mouse è di fondamentale importanza per indagare le allergie e sintomi di reazioni anafilattiche. Sonde rettali per letture di temperatura è comune, e hanno dimostrati di essere preciso e prezioso in questo senso. Tuttavia, questo metodo di misurazione della temperatura richiede i topi di essere anestetizzato per inserire la sonda senza pregiudizio per l'animale. Questo limita la capacità di osservare altri fenotipi del mouse contemporaneamente. Al fine di indagare altri fenotipi durante la misurazione della temperatura, sonde rettali non sono ideali, e un altro metodo è desiderato. Qui, presentiamo un metodo non invasivo di misurazione della temperatura che rinuncia il requisito per l'anestesia del mouse mantenendo affidabilità pari alle sonde rettali nella misurazione della temperatura corporea. Usiamo un termometro a infrarossi che rileva la temperatura del corpo a compresa tra 2 e 150 mm. Questo metodo di misurazione di temperatura del corpo è riuscito a replicare in modo affidabile le tendenze di cambiamento di temperatura durante gli esperimenti di anafilassi sistema passivo in topi. Indichiamo che la temperatura del corpo è circa 2,0 ° C inferiore a misurazioni di sonda rettale, ma il grado di abbassamento della temperatura segue lo stesso andamento. Inoltre, usiamo la stessa tecnica per osservare i topi in un modello di allergia alimentare per valutare i livelli di temperatura e attività contemporaneamente.

Introduzione

Misurazione della temperatura corporea è stata una parte essenziale del monitoraggio degli effetti dei sintomi di reazioni anafilattiche in animale modelli^1,2. Differenze di temperatura sono stati tradizionalmente misurate da termometri sonda rettale in topi^3,4. Con queste misure, gli investigatori hanno ritratto in modo affidabile le differenze di temperatura tra variabili; Tuttavia, questo metodo è una procedura che richiede tempo e causa l'afflizione ai topi, che possono aumentare la temperatura interna del corpo. Sonda rettale può anche causare lacerazioni e infezione della mucosa³. Inoltre, i topi dovrebbero essere anestetizzati per umanamente inserire la sonda rettale per misurare la temperatura³. Si tratta di un processo lento, e vieta la misurazione delle temperature successive entro un breve periodo di tempo. Inoltre, topi attività fenotipi non possono essere osservati durante questo tempo fino a quando l'anestetico è portato completamente fuori, che è un altro processo che richiede tempo. Più recentemente, altri metodi affidabili per misurare la temperatura corporea sono usate Tag transponder infrarosso passivo impiantato per via sottocutanea o trasmettitori radio che includono un sensore di temperatura^3,5,6. Anche se essi vengono riconosciuti da alcuni ricercatori come la pratica ideale, questi metodi non sono ampiamente utilizzati a causa di alti costi iniziali e l'afflizione di topi, dovuto l'impianto chirurgico di un sensore di temperatura sotto la pelle o un'altra parte del corpo.

Al fine di dimostrare che una differenza di temperatura è una riflessione accurata dei sintomi in un modello di malattia^1,2, topi devono essere sveglio durante la misurazione di temperatura ed essere in grado di tornare alla loro normale attività fenotipica immediatamente prima e dopo la misurazione. A tal fine, abbiamo cercato un metodo con cui questo potrebbe essere realizzato.

Il nostro obiettivo era di preciso ed economico misurare temperatura corporea del mouse, senza la necessità di anestesia e senza restrizioni all'attività, per consentire l'osservazione dei fenotipi comportamentali durante e dopo il tempo di misurazione della temperatura. Per raggiungere questo obiettivo, era evidente che una tecnica meno invasiva rispetto alla temperatura rettale standard sonde è stato richiesta. Termometri a infrarossi sono stati utilizzati per decenni nella medicina clinica, soprattutto in pediatria, per ottenere letture accurate della temperatura. È stato un metodo alternativo che ha permesso ai medici di rapidamente e con precisione ottenere misure di temperatura in infanti ed in bambini disordinati che sono attivamente mobili. Abbiamo implementato questa stessa tecnica in topi e hanno sviluppato un metodo efficace per ottenere temperature senza anestesia. D'importanza, ci indicano che questo metodo è in grado di replicare i risultati di anafilassi sistemica passiva affermata sui cambiamenti di temperatura, essendo anche in grado di osservare l'attività del mouse durante la misurazione. Inoltre, usiamo lo stesso metodo per valutare le temperature del corpo di cibo-allergica topi, mentre contemporaneamente indaga su altri sintomi, per dimostrare che la temperatura corporea è infatti una riflessione accurata del livello di attività e fenotipo complessiva della mouse.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato di uso dell'Istituto La Jolla e cura degli animali per l'allergia e immunologia.

1. misurazione di temperatura del corpo Mouse durante amputate

1. Posizionare il mouse in una scatola di induzione di anestesia. Anestetizzare tramite flusso di 1 L/min di ossigeno con isoflurano 5%.
   Nota: Amputate è confermata quando il mouse smette di movimento volontario ed è stato immobile per più di 30 s. in alternativa, la frequenza respiratoria di monitor, e una volta topi stanno respirando a 1 respiro per ogni 2 s o più, viene confermata amputate.
2. Tenere il mouse per la nuca con un dito indice e pollice e tenere la coda con un dito mignolo al fine di esporre la parte inferiore dell'addome.
3. Posizionare il sensore del termometro a infrarossi sotto l'addome più basso tenendo il mouse con il suo corpo parallelo al suolo.
   Nota: La superficie esterna piana del termometro (non la superficie del sensore) dovrebbe essere circa 2 – 5 mm di distanza dalla superficie dell'addome. Questa replica risultati delle temperature misurate mentre topi non sono anestetizzati (descritto nella sezione 2). È importante determinare il sito di destinazione dell'addome. Che mira tra due capezzoli superiore consente risultati coerenti.
4. Tenere premuto il grilletto per misurare la temperatura. Garantire la tenuta stabile del mouse e termometro.

2. Mouse misurazione di temperatura del corpo senza anestesia

1. Sollevare il mouse entro la metà della coda.
2. Esporre l'addome del mouse.
   1. Consentire il mouse per tenere di una superficie di retti, come il labbro di una gabbia aperta o gabbia-top con le zampe anteriori.
      Nota: Questo permette il mouse allungare il suo corpo superiore ed esporre l'addome.
   2. In alternativa, permette il mouse per mantenere il bordo superiore dritto, del termometro e mettere il mouse a sedersi sulla superficie esterna piana del termometro con suo addome appena sopra il sensore a infrarossi.
      Nota: In qualsiasi momento che le zampe posteriori sono a riposo sulla superficie del termometro, assicurarsi che i piedi non ostruiscano il sensore dalla superficie addominale. Termometri con piede ostruzione misurerà una temperatura inferiore a quella dell'addome.
3. Tenere premuto il grilletto per misurare la temperatura.
   Nota: Topi tendono a muoversi; prendersi cura in misura costantemente la stessa posizione del corpo prendendo le misure di temperatura quando i topi sono relativamente meno mobili.

3. passivo anafilassi sistemica⁷

1. Giorno 0: Sensibilizzare con l'immunoglobulina E (IgE).
   1. Preparare 200 µ l (per topo) di IgE anti--dinitrophenyl (DNP) ad una concentrazione di 100 µ g/mL in PBS.
   2. Intraperitonealmente iniettare 200 µ l di IgE anti--dinitrophenyl (DNP) preparato solo in passo 3.1.1 o PBS (solo PBS è il controllo negativo). Utilizzare un ago da 26 G per iniezione. Eseguire le iniezioni solo laterale alla linea mediana, approssimativamente fra i due capezzoli più inferiori.
2. Giorno 1: Indurre anafilassi con DNP-HSA.
   1. Preparare 100 µ l (per topo) di DNP-HSA ad una concentrazione di 10 mg/mL a 0,9% NaCl.
   2. Anestetizzare i topi come descritto al punto 1.1.
   3. Misurare la temperatura corporea utilizzando la tecnica descritta nel passaggio 1.
   4. Iniettare per via endovenosa 100 µ l di DNP-HSA preparata al punto 3.2.1. Utilizzare un ago 30g per iniezione. Eseguire le iniezioni il seno venoso retroorbital. Inserire l'ago sul lato mediale dell'occhio un angolo poco profondo, con l'obiettivo dietro l'occhio.
   5. Dopo l'iniezione, posizionare i topi in gabbie individuali. Garantire che i topi recupero dall'anestesia. Osservare che si risvegliano e diventano volontariamente mobile.
   6. Misurare la temperatura corporea con il termometro a raggi infrarossi e osservare la loro attività ogni 10 min per 70 min.

4. Mouse modello di cibo allergia^8,9

Nota: Lo schema elettrico è mostrato in Figura 2.

1. Giorno 0: Sensibilizzare i topi con ovuli/allume.
   1. Preparare 100 µ l (per topo) di OVA (0,5 mg/mL) e allume (10 mg/mL) insieme in PBS. Vortice sull'impostazione bassa per 30 min.
   2. Anestetizzare i topi come descritto al punto 1.1.
   3. Utilizzando un ago da 26 G, intraperitonealmente iniettare ogni mouse con 100 µ l della miscela OVA/allume preparata al punto 4.1.1.
      Nota: Vortice la miscela di ovuli/allume ancora una volta, brevemente prima di ogni iniezione, al meglio garantire una miscela omogeneizzata. Vedere il punto 3.1.3 per i dettagli sul sito di iniezione.
   4. Dopo l'iniezione, topi posto indietro nelle loro gabbie originale. Garantire che i topi recupero dall'anestesia. Osservare che si risvegliano e diventano volontariamente mobile.
2. Giorno 14: Eseguire una seconda sensibilizzazione con ovuli/allume.
   1. Ripetere i passaggi da 4.1.1, 4.1.2 e 4.1.3.
3. Giorni 28-46: sfidare i topi con ovuli ogni altro giorno.
   1. Preparare 100 µ l (per topo) di OVA ad una concentrazione di 250 mg/mL in PBS.
      Nota: La miscela deve avvenire tramite dolcemente dondolandosi avanti e indietro a mano piuttosto che con un vortice per ridurre al minimo la formazione di bolle.
      1. Se usando gli inibitori di allergia alimentare, preparare l' inibitori⁹. Preparare 100 µ l (per topo) di inibitore ad una concentrazione di 1 mg/mL in PBS. Questo permette una consegna di 100 µ g di inibitore per ogni mouse.
         Nota: Non superare 100 µ l di inibitore per topo, come i topi sono solo in grado di gestire 200 µ l di volume totale mediante sonda gastrica durante il giorno una sfida. In 100 µ l sono necessari per la sfida di OVA pure, 100 µ l è il massimo volume per l'utilizzo dell'inibitore raccomandato.
   2. Anestetizzare i topi come descritto al punto 1.1.
   3. Oralmente mediante sonda gastrica ogni mouse con 100 µ l della soluzione OVA (25 mg di ovuli in 100 µ l di PBS gavaged per topo) che è stata preparata al punto 4.3.1.
      1. Se usando gli inibitori, utilizzano le stesse tecniche descritte di seguito per l'alimentazione mediante sonda gastrica di inibitore (o controllo PBS) preparata al punto 4.3.1.1 30 minuti prima della sfida di ovuli. Dopo 30 min, passare al passaggio successivo.
      2. Utilizzare un ago sonda gastrica con una siringa da 1 mL. Prendere 100 µ l di ovuli nella siringa.
      3. Inserire l'ago in bocca; quindi, puntando l'ago verso il lato sinistro o destro della gola, far scorrere delicatamente l'ago attraverso l'esofago. Iniettare 100 µ l di ovuli.
         Nota: Per assicurarsi che l'ago non è nella trachea, osservare attivo di respirazione prima di iniettare il OVA. L'inserimento dell'ago sarà anche essere resistito all'inizio se ha inserito la trachea anziché l'esofago.
   4. Posizionare i topi nelle loro gabbie individuali. Per l'osservazione facile della qualità delle feci, utilizzare gabbie senza biancheria da letto.
   5. Garantire il recupero dall'anestesia. Osservare che i topi risvegliano e diventano volontariamente mobili.
   6. Misurare la temperatura corporea dei topi a punti temporali 10, 20, 40 e 60 min utilizzando la tecnica descritta nella sezione 2.

Risultati

Anafilassi sistemica passiva: per iniezione iv, 10 settimana vecchi topi BALB/c femminili sono stati anestetizzati. Prima dell'iniezione, abbiamo misurato la loro temperatura corporea (Video 1) come descritto nel passaggio 1. La figura 1 Mostra l'andamento della temperatura di entrambe le popolazioni dopo iniezione iv. Il mouse di IgE sensibilizzati ha mostrato un calo di temperatura massima di 3,0 ° C a 20 min, mentre il mouse di controllo P...

Discussione

Il protocollo descritto è stato istituito con l'obiettivo di misurare la temperatura corporea senza l'uso dell'anestesia. Nonostante la sua relativa facilità con quale temperatura letture possono essere ottenute, ci sono diversi avvertimenti che ospitare questa tecnica, oltre agli effetti più evidenti come la gestione dello stress e presenza di differenti temperature.

In primo luogo, al fine di mantenere costante la temperatura letture in tutto l'esperimento, la posizione dove viene misurata l...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Termometro a infrarossi senza contatto	SinoPie	DT-8861
Anti-dinitrofenile (DNP) IgE	Sigma Aldrich	D8406-.2MG
PrecisionGlide 30 G ago	BD	305128
PrecisionGlide 26 G ago	BD	305111
siringa da 1 mL	BD	309659
Dinitrofenil - albumina sierica umana	Biosearch Technologies	D-5059-10
Ovoalbumina da albume d'uovo di gallina	Sigma Aldrich	A5503-50G
Imject Alum	ThermoFisher Scientific	77161
Aghi per alimentazione animale, usa e getta	Fisher Scientific	01-208-87