Transdermico misurazione del tasso di filtrazione glomerulare in topi

L'uso di transcutanea GFR monitor nei topi in primo luogo è stato segnalato da Schreiber e colleghi nel 2012 ed è stato validato confrontando misure di GFR ottenute utilizzando questa tecnica, con i risultati ottenuti tramite la misura diretta della clearance del bolo FITC-sinistrin da campioni di sangue di serie¹. Fin qui, ci sono stati 35 pubblicazioni peer-reviewed in cui transcutanea GFR monitor sono stati utilizzati nei ratti e nei topi (un elenco regolarmente aggiornato degli articoli di giornale e abstract di conferenze in cui è stato utilizzato il monitor GFR preclinico può essere trovato presso il MediBeacon sito Web²). Misurazioni di GFR transdermico nei ratti e nei topi è stato descritto in un certo numero di pubblicazioni^1,3,4,5, e un video tutorial che dimostrano il suo uso nei ratti è stato pubblicato⁶. Tuttavia, la misura in topi presenta ulteriori sfide tecniche. Qui, forniamo la prima guida pratica dettagliata per l'utilizzo di monitor GFR transdermico in topi.

Ci sono una serie di motivi perché gli investigatori stanno iniziando a favorire l'utilizzo di monitor GFR transdermico per valutare la funzione renale nei modelli del roditore. Misurazione transcutanea della clearance di FITC-sinistrin ha dimostrato di fornire una misura più sensibile e accurata della funzione renale rispetto ai tradizionali parametri di funzione renale come siero della creatinina e sangue urea azoto (BUN)^{7, 8}. Mediante l'implementazione di un algoritmo di valutazione migliore, Friedemann e colleghi hanno dimostrato che il sistema raggiunge una precisione paragonabile al gold standard, la tecnica dell'infusione costante per GFR misura³. Recenti studi hanno dimostrato anche analisi sequenziale utilizzando transcutanea GFR monitor può essere utilizzato per studiare i cambiamenti in anticipo nella funzione renale come pure il recupero funzionale dopo induzione di danno renale acuto (AKI) senza interferire con il sangue degli animali volume o emodinamica, poiché il test non richiede sequenziale sangue campionamento^9,10. La capacità di misurare GFR con alta precisione e sensibilità ripetutamente nello stesso animale rende questa tecnica per una varietà di discipline di ricerca diversi. Transdermico GFR monitor sono stati utilizzati da aziende farmaceutiche per valutare la tossicità di nuovi composti, così come nelle Università per la ricerca di base e traslazionale.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati realizzati conformemente agli orientamenti locali nel Regno Unito e Stati Uniti. Esperimenti condotti presso l'Università di Liverpool sono stati eseguiti sotto una licenza conferita ai sensi della legge di animali (procedure scientifiche) UK 1986 e sono stati approvati dal comitato di etica Università di Liverpool. Tutti gli esperimenti su animali condotti presso la Vanderbilt University Medical Center sono stati approvati dal comitato di uso e cura degli animali istituzionale di Vanderbilt.

1. preparare la FITC-sinistrin

1. Preparare FITC-sinistrin 40 mg/mL in tampone fosfato salino (PBS).
   Nota: Aliquote possono essere conservate a-20 ° C per diversi mesi con nessuna diminuzione notevole nella qualità; Tuttavia dovrebbero essere evitati più cicli di gelo-disgelo. FITC-sinistrin è sensibile alla luce - tenere il tubo al riparo dalla luce.
2. Calcolare il volume di FITC-sinistrin necessaria per ogni mouse:
   1. Pesare ogni mouse ogni giorno di misura.
   2. La dose raccomandata è di 0,15 mg FITC-sinistrin per grammo di peso corporeo.

2. preparazione di Mouse

1. Preparare le gabbie separate per i topi mentre sottoposti a misure di GFR. Forniscono gli asciugamani di carta assorbente e pochi pellets di cibo.

3. rimozione dei peli dal Mouse (1-2 giorni prima della misura di GFR)

1. Anestetizzare il mouse con isoflurano 3% e una volta che il mouse è addormentato, mantenere l'anestesia con isoflurano 1,5 – 2%, a seconda del tasso di respirazione del mouse. Posizionare il mouse incline su una piastra di calore.
2. Utilizzare un rasoio elettrico, andando contro la direzione del pelo, per rimuovere la maggior parte della pelliccia da un lato della parte posteriore del mouse. La barba dalla parte superiore delle zampe posteriori fino al collo e attraverso le costole.
3. Applicare uno strato sottile di Crema depilazione dell'area rasata usando un batuffolo di cotone (Figura 1A). Spostare il batuffolo di cotone contro la direzione della pelliccia per garantire che la crema viene applicata più vicino alla pelle possibile.
4. Rimuovere la crema dopo 1 – 3 min da lavare via con acqua tiepida e tamponi di cotone. Non eseguire la misurazione se la pelle appare molto rossa e irritata dopo la misurazione e non ripetere depilazione entro 72h per evitare di danneggiare la pelle.

4. preparazione del Monitor GFR transdermico

1. Utilizzare una delle due dimensioni delle patch disponibili. Il primo è 2,5 x 3 cm² dimensioni e può essere utilizzato direttamente per le misurazioni in topi. Le altre patch sono 6 x 3 cm² dimensioni e sono destinate ad essere utilizzati nei ratti o animali più grandi, ma possono essere tagliate a una dimensione inferiore per uso in topi.
2. Staccare il rivestimento un lato della patch e attaccare il dispositivo GFR sul lato adesivo, i LED di posizionamento esattamente sopra la finestra trasparente.
3. Tagliare il cerotto adesivo in eccesso per adattarsi alle dimensioni della batteria e attaccare un lato della patch alla batteria.

5. fissaggio del Monitor GFR transdermico

1. Anestetizzare il mouse con isoflurano come descritto al punto 3.1 e posizionare il mouse incline su una piastra di calore. Anestetizzare topi solo per il posizionamento del monitor transcutaneo GFR e iniezione di FITC-sinistrin; garantiscono il recupero dall'anestesia per la misurazione del decadimento FITC.
2. Pulire la pelle pre-rasata con etanolo al 70%. Mettere circa 12 cm di nastro di seta ipoallergenico sotto il mouse (Figura 1B; la larghezza del nastro deve essere ridotto a 1,5-2 cm in modo che non è troppo ampia per il mouse).
3. Posizionare il nastro in modo che è solo circa 2 cm sul lato destro del mouse, e il resto è sulla sinistra. Piegare su un bordo del lato destro del nastro per il facile posizionamento e rimozione dopo la misurazione. Le istruzioni di sinistra-destra ai punti 5.3 e 5.6 sono per il posizionamento del dispositivo sul lato destro dell'animale e possono essere scambiate per il posizionamento del dispositivo sul lato sinistro dell'animale, se necessario.
4. Collegare la batteria al dispositivo, rimuovere la protezione dalla batteria e posizionarlo saldamente sopra il dispositivo. Il dispositivo è pronto all'uso e acquisizione dati inizia quando i blu diodi emettitori di luce (LED) iniziano a lampeggiare.
5. Rimuovere il rivestimento dal dispositivo e posizionare sulla pelle rasata. Posizionare il dispositivo in modo che la finestra esponendo i LED è sopra le costole – non è troppo vicino alla colonna vertebrale o degli arti (Figura 1).
6. Fissare il dispositivo con il nastro bianco. Fissare il lato destro prima (Figura 1), avvolgendolo strettamente intorno a tutti i bordi del dispositivo, quindi avvolgere il lato sinistro intorno il mouse e il dispositivo (Figura 1E). Idealmente, il lato sinistro del nastro copre solo il dispositivo, e il lato destro finisce sotto l'addome del mouse.
7. Fissate il nastro premendo lungo la circonferenza del corpo del mouse. Il nastro deve essere fissato saldamente, ma non strettamente. Se è troppo largo quindi il dispositivo si muoverà intorno troppo e causare artefatti di movimento. Tuttavia, non dovrebbe essere così stretto che limita la respirazione o movimento o mette troppa pressione sulla pelle.
8. Lasciare invariato il dispositivo per 3 minuti prima dell'iniezione di FITC-sinistrin per consentire uno sfondo costante lettura per essere preso. In questo tempo, caldo la coda con un termoforo o guanto riempito con acqua calda per preparare per iniezione della vena della coda (se si utilizza questa rotta).

6. FITC-sinistrin iniezione

1. Preparare una siringa da insulina con la quantità calcolata di FITC-sinistrin necessaria per l'iniezione (questo può essere arrotondato alla più vicina 10 μL).
2. Amministrare FITC-sinistrin vena caudale o iniezione retro-orbitale. FITC-sinistrin deve essere somministrato in un bolo liscio ma rapido per evitare picchi multipli sulla curva di liquidazione. È preferibile somministrare solo una dose parziale di to hanno molteplici tentativi di amministrare la FITC-sinistrin.

7. misurazione del GFR

1. Posizionare il mouse in una gabbia sul proprio per il recupero dall'anestesia isoflurano e per tutta la durata del periodo di misurazione.
2. Osservare il mouse nella gabbia per 1,5 h e quindi rimuovere il dispositivo. Rimozione del dispositivo dal mouse cosciente è veloce, efficiente e generalmente ben tollerato dal mouse, ma nuovi utenti potrebbero preferire anestetizzare il mouse per questo passaggio.
   1. Come un'opzione, anestetizzare il mouse con isoflurano.
   2. Come l'altra opzione, è possibile posizionare il mouse sopra la griglia sopra la gabbia, permettendo il mouse per afferrare le barre di metallo, mentre il dispositivo viene rimosso.
3. Togliere il nastro di intonaco bianco da sotto la pancia con un movimento rapido, liscio e rimuovere il dispositivo e gesso nero dalla pelle. Fare attenzione che la batteria non si disconnette dal dispositivo ancora.
4. Tornare il mouse alla sua gabbia a casa.

8. lettura e valutazione dei dati

1. Staccare con cautela la batteria dal dispositivo
2. Collegare il dispositivo al cavo USB e quindi collegare il cavo al computer
3. Aprire il software di lettura (Sensor_ctrl_app.exe)
4. In ordine, fare clic su "connect", "leggere", "re-name" e "Salva", quindi chiudere il programma
5. Elaborare e valutare i dati nel software di analisi come descritto nel rispettivo manuale

In questa sezione vi presentiamo i risultati rappresentativi dell'uso del monitor transcutaneo GFR. Il monitor transcutaneo è stato utilizzato in una varietà di diversi ceppi di topi e modelli di AKI e CKD2.

Figura 2 Mostra rappresentante FITC-sinistrin liquidazione curve in topi BALB/c maschili, prima e dopo l'ischemia e riperfusione (IRI) con il nephrectomy controlaterale simultaneo. FITC-sinistrin scompare rapidamente dalla circolazione in topi sani (Figura 2A), ma la liquidazione è drammaticamente in ritardo in topi con AKI (Figura 2B, C). In topi con AKI molto grave, potrebbe non esserci alcun cambiamento nella fluorescenza FITC-sinistrin durante il periodo di misurazione di 90 minuti, che indica un'assenza completa di filtrazione glomerulare (Figura 2).

Misura di GFR transdermico è minimamente invasivo e può essere utilizzato per monitorare i cambiamenti nella funzione renale nei topi stessi su più punti di tempo. Figura 3 raffigura le modifiche della GFR determinato tramite le misure di liquidazione sequenziale transdermica FITC-sinistrin alla linea di base e 1, 2 e 4 giorni dopo l'induzione IRI (ischemia unilaterale con nefrectomia controlaterale simultaneo). I dati indicati includono Half-Life di FITC-sinistrin liquidazione (Figura 3A) e GFR (Figura 3B) calcolato dall'emivita di liquidazione FITC-sinistrin misurato, come descritto da Schreiber et al.1.

Nella Figura 4, malattia renale cronica (CKD) è stata indotta in topi BALB/c maschi eseguendo prolungata IRI unilaterale seguito dal nephrectomy controlaterale in ritardo, come descritto11. GFR è stato valutato da clearance transdermico FITC-sinistrin il giorno 26 dopo l'iniziale IRI. L'aumento nell'emivita di FITC-sinistrin (Figura 4A) e conseguenza la diminuzione della GFR (Figura 4B), indica la funzione renale alterata in questi topi. Questi dati dimostrano che la misurazione transcutanea di GFR può essere utilizzato per misurare i cambiamenti nella funzione renale nei topi con CKD.

Figura 5A Mostra che FITC-sinistrin Half-Life correla strettamente con la valutazione semi-quantitativa istologica della lesione tubolare sopra le misurazioni gamma completo di GFR nei topi illesi e nei topi con diversi livelli di gravità di AKI IRI-indotta. Al contrario, siero della creatinina e sangue dell'azoto ureico (BUN) hanno mostrato un positivo ma più debole correlazione con FITC-sinistrin clearance (figura 5B, C), che indica che le misure di GFR transcutanea forniscono una misura più affidabile di renale lesioni (segni di lesione tubolare) seguito indotta da IRI AKI rispetto sia della creatinina sierica o BUN.

Figura 1: collegare il monitor GFR transdermico. Fotografie di rimozione dei capelli (A), posizionamento del nastro sotto il mouse (B), il posizionamento del dispositivo sulla pelle (C) il mouse e fissare il dispositivo di avvolgimento del nastro intorno il mouse e il dispositivo (D-E), per favore clicca qui per Mostra una versione più grande di questa figura.

Figura 2: esempio FITC-sinistrin curve di liquidazione in topi BALB/c maschi prima e dopo l'ischemia e riperfusione (IRI) con il nephrectomy controlaterale simultaneo. Curve di liquidazione al basale (A) e un giorno dopo chirurgia IRI (B) il mouse stesso, che indica la funzione renale in questo mouse alterata. (C) Clearance della curva da un mouse più gravemente ferito un giorno dopo l'intervento chirurgico IRI. Non c'era nessun gioco di FITC-sinistrin durante il periodo di misura, che indica l'indebolimento renale. Punti neri dati rappresentano dati grezzi, linee blu rappresentano la misura 3-vano e linee verdi rappresentano gli intervalli di confidenza del 95%. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: 8-10 settimane di età di topi BALB/c maschio, ha subito l'ischemia unilaterale con nefrectomia controlaterale simultaneo (n = 5). GFR era valutati al basale e nei giorni 1, 2 e 4 dopo chirurgia e rispetto ai topi falsità-azionati di controllo (n = 5). FITC-sinistrin Half-Life in (A) è stato utilizzato, insieme con il peso corporeo dei topi, per calcolare il GFR (B). Punti dati rappresentano singoli animali e barre di errore rappresentano media e l'errore standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: età di topi BALB/c maschio 8-10 settimane ha subito ischemia unilaterale con nefrectomia controlaterale in ritardo al giorno 8 (n = 5). GFR è stata valutata tramite il giorno 26 e venivano paragonati ai topi sani di pari età di controllo (n = 5). FITC-sinistrin Half-Life in (A) è stato utilizzato, insieme con il peso corporeo dei topi, per calcolare il GFR (B). Punti dati rappresentano singoli animali e barre di errore rappresentano la media e deviazione standard. Lesione tubolare è stato segnato 0-50 in base al grado di formazione di necrosi e cast da un osservatore cieco (L.R.) su sezioni di rene acido periodico-Schiff-macchiate. Questo metodo è stato adattato da Wang e colleghi12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: correlazione di tre misure di funzione/danno renale (valutazione istologica della lesione tubolare (n = 39), la creatinina del siero (n = 30) e dell'azoto ureico (BUN) del sangue (n = 30)) con FITC-sinistrin clearance (emivita). Topi BALB/c maschili ha subito vari periodi di bloccaggio del pedicle renale unilaterale (25 – 45 min) o interventi chirurgici di sham, con il nephrectomy controlaterale simultaneo per indurre la severità differente dell'AKI, e l'istopatologia e parametri di funzione renale sono stati valutati al giorno 4 dopo IRI. Il Punteggio di lesione tubolare ha mostrato una forte correlazione positiva con FITC-sinistrin clearance (A; R2 = 0,88), mentre la creatinina del siero (B) e BUN (C) entrambi hanno mostrato positivo ma più debole correlazione con FITC-sinistrin liquidazione (R2 = 0,64 e 0,52, rispettivamente). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

D S-K, JF e YS sono dipendenti alle MediBeacon GmbH il produttore e distributore del monitor transcutaneo GFR.
D S-K e JF sono inventori su brevetti e domande di brevetto per la tecnologia presentata.