Valutazioni e analisi di tumore fetta espianti come prerequisito per la prova diagnostica

Sommario

Forniamo un metodo per la generazione, la coltivazione e l'analisi sistematica delle fette organotipiche derivate da tumori del polmone murino. Inoltre descriviamo come ottimizzare per spessore della fetta e come selezionare le concentrazioni di farmaco per il trattamento di fette di tumore.

Abstract

Colture organotipiche primario del tessuto espianto, che includono fette di taglio di precisione, rappresentano l'architettura tridimensionale (3D) del tessuto come pure le interazioni multicellulari di tessuto nativo. Fettine di tessuto tagliati immediatamente da appena resecati tumori conservano aspetti spaziali di intratumor eterogeneità, rendendoli così utili surrogati di biologia in vivo . Un'attenta ottimizzazione delle condizioni di coltivazione e preparazione fetta dei tessuti è fondamentale per il potenziale diagnostico predittivo di tumore fetta espianti. A questo proposito, modelli murini sono preziosi, come questi forniscono un flusso costante di materiale del tumore per eseguire esperimenti riproducibili e replicare. Questo protocollo descrive la coltura delle fettine di tessuto tumore-derivato di polmone murino utilizzando un'unità rotante di incubazione, un sistema che permette l'esposizione intermittente dei tessuti di ossigeno e sostanze nutritive. Il nostro lavoro precedente ha mostrato che l'uso di incubazione unità rotanti migliora la vitalità del tessuto rispetto ad altri metodi di coltura, particolarmente galleggiante fette e stagnante filtro supporta. Qui, più ulteriormente indichiamo che spessore fetta influenza la vitalità delle fette coltivate, suggerendo che l'ottimizzazione dello spessore fetta dovrebbe essere fatto per diversi tipi di tessuto. Pronunciata ITH in rilevanti funzioni oncogeniche, come segnalazione di attività, l'infiltrazione delle cellule stromal o espressione di marcatori di differenziazione, rende necessaria la valutazione delle fette del tessuto adiacente per l'espressione di marcatori alterata dal trattamento farmacologico o coltivazione di sé. In sintesi, questo protocollo descrive la generazione di fette di tumore del polmone murino e la loro cultura su un'unità di incubazione rotante e viene illustrato come fette dovrebbero essere sistematicamente analizzate per l'espressione di marcatori tessuto eterogeneo, come prerequisito prima gli studi di reazione di droga.

Introduzione

Tessuti del tumore solido, compreso il cancro polmonare, esibiscono eterogeneità fenotipica e genetica e porto complesso microambienti^1,2. L'interazione tra le cellule del tumore e la loro influenza di microambiente circostante il farmaco sensibilità e resistenza meccanismi³. Ciò evidenzia la necessità di modelli preclinici che può modellano accuratamente la complessità biologica e funzioni agendo nei tumori nativi. Precisione di taglio fette immediatamente derivate da tumori freschi forniscono una risorsa unica, come hanno una capacità principale per rappresentare in vivo biologia, almeno per un breve lasso di tempo, tra cui fenotipi spazialmente distribuiti in un singolo tumore. I tumori resecati clinici sono uno dei pochi esemplari personalizzati che possono essere ottenuti da un paziente di cancro, e loro uso diagnostico merita un esame.

La storia di date culture organotipiche torna all'all'inizio 19^° secolo, quando i tumori intracranici umani erano mano-ha tagliato in pezzi di tessuto e coltivate utilizzando il cosiddetto appeso metodo drop. Frammenti di tessuto sono stati associati un vetrino coprioggetto e immerga in plasma umano eparinizzato, dopo di che i coprioggetti erano invertiti, sigillati e coltivati per diverse settimane⁴al. Tagliare manualmente tumore pezzi sono state coltivate utilizzando una varietà di altri metodi, come ad esempio su coaguli plasma⁵, mezzi liquidi⁶, o il 0,45 µm poro dimensione filtri⁶. Il termine "organotipiche" è stato utilizzato nel 1954, in uno studio sulla differenziazione della retina del pulcino embrione occhio⁷. Ciò è stata seguita da studi che hanno utilizzato il polmone e cuore espianti di tessuto derivate da embrioni di pulcino⁸ed espianti cervello di ratti adulti⁹.

Vari metodi per affettare sono stati choppers descritto, vale a dire manuale^10,11, Krumdieck tessuto affettatrice^12,13e vibratomes^{11,14,15, 16}. L'affettatrice di tessuto Krumdieck genera nuclei cilindrici del tessuto, che vengono tagliati in fettine di tessuto circolare utilizzando un microtomo. Un vibratomo, d'altra parte, utilizza un microtomo lama vibrante. In uno studio su fette del fegato, è stato dimostrato che la Leica vibratome genera più fette risultati riproducibili e coerenti rispetto affettatrice Krumdieck¹⁵. Sono stati utilizzati fetta spessori che variano da 250 a 500 µm, e studi riportano il mantenimento della vitalità e caratteristiche morfologiche anche fino a 16 giorni^14,10,17,18. Tuttavia, i tumori hanno variabili profili metabolici che possono influire sulle esigenze nutrizionali e parametri quali la composizione del tessuto di rigidità e matrice possono influire sull'aerazione e flusso dei nutrienti. È quindi probabile che ogni tipo di tessuto richiede l'ottimizzazione delle condizioni di affettare e cultura.

Metodi di coltivazione differenti sono stati usati per sostenere le culture della fetta: io) cultura interfase stazionario, anche detta cultura supporto stagnante in cui fette sono collocati sulla sommità di un inserto di membrana semi-porosa immerso nel terreno di coltura. In questo, la parte superiore delle fette è esposto all'aria, mentre la parte inferiore è completata con nutrienti attraverso l'inserto poroso^14,19; II) il metodo di cazzuola, originariamente sviluppato per organi interi cultura o fette di tessuto embrionale. In questo, fette sono collocati sopra un foglio di cotone o filtro supportato da una griglia metallica, e il filtro è imbevuto nel terreno di coltura. Per mantenere i tessuti umidi, un sottile strato di mezzo viene aggiunto in cima il fette^20,21,22. Questi primi due sono i cosiddetti culture interfase del aria-liquido; III) rullo tubo culture, in cui fette sono posizionati all'interno la parte piatta di un tubo di plastica contenente mezzo, tubo lenta rotazione garantisce che il tessuto è coperto con il mezzo durante la prima parte di un ciclo, o aerato durante il secondo²³; IV) unità di incubazione, in cui fette sono esposti in modo intermittente a mezzo con le sostanze nutrienti e aerazione rotanti. Diverso dal rullo di tubi, in questo metodo fette sono collocati in cima titanio poroso griglie posizionati in piastre da 6 pozzetti con terreno di coltura²⁴.

Fettine di tessuto derivato da tumori solidi resecati logicamente presenti un modello attraente ex vivo in cui verificare la risposta al trattamento di agenti anti-cancro, perché permettono la valutazione della vitalità, mirate attività di via e profili molecolari di un tumore specifico in presenza di suo microambiente tumorale nativo. Tuttavia, per valutare se le risposte di droga misurate in fette di tumore sono predittive di risposte in situ , è importante valutare in quale misura tessuto fette preservare tumore-specifiche funzioni biologiche quali la proliferazione cellulare, differenziazione delle cellule di istopatologia specifici o attività oncogena di segnalazione. L'impatto dello stress meccanico ha suscitato durante la preparazione di fetta, fetta imballaggio o adattamenti indotti da cultura sulla qualità e funzioni biologiche delle fette del tessuto sono domande fondamentali, strettamente legate alla capacità di implementare tumore-derivato fette per la diagnostica funzionale.

Il nostro progetto di consorzio finanziato dall'IMI PREDECT (http://www.predect.eu) propone di sistematicamente indirizzo queste domande fondamentali, attraverso lo studio di espianti di fetta da una varietà di fonti. Usando le fette derivate da modelli di cancro al seno, della prostata e del polmone, questo sforzo congiunto utilizzato qualitative letture così come ematossilina quantitativa e letture di eosina (H & E) - basata per dimostrare al fabbisogno di ossigeno atmosferico e stagnante filtro supporti per sostenere la vitalità delle fette coltivate fino a 72 h. Inoltre, analisi immunohistochemistry (IHC) su fette coltivate ha rivelato le sfumature di attuabilità intra-fetta, dimostrate come le sfumature di necrosi in fette derivate da cancro del polmone murino non a piccole cellule (NSCLC), ricevitore dell'estrogeno (ER), HIF1α e γH2AX sfumature in fette di cancro al seno, o sfumature di espressione del recettore (AR) dell'androgeno nel carcinoma della prostata sezioni²⁵. È interessante notare che, intra-fetta gradienti di attuabilità nelle colture di 24 h di NSCLC murino furono salvati da coltivazione in un'unità di incubazione rotante, e il nostro studio recente ha mostrato che la redditività è stata estesa a 72 h²⁶. In particolare il lato superiore è rimasto più praticabile²⁶, sostenendo che le analisi di risposta di droga su fette migliori siano effettuate su questo lato del tessuto.

Anche se rimane una questione di come lontano fettine di tessuto possono riepilogare funzioni di tumore in situ , sono stati ampiamente utilizzati per testare le risposte agli agenti anti-cancro, tra cui farmaci mirati, anticorpi monoclonali e gli agenti di chemioterapia ^{10,11,13,14,18,27}. Recentemente abbiamo mostrato che murini fette NSCLC mostrano cambiamenti dinamici nella proliferazione e oncogeno segnalazione attività seguendo coltivazione rispetto a 0 h tagliato di fresco fette²⁶. Questo indica che è importante indagare se le funzioni biologiche mirati in situ sono conservate in modo appropriato durante la coltivazione, prima gli studi di perturbazione. Nonostante questi risultati, abbiamo mostrato che fette di tumore possono modello spaziale risposta a terapie mirate, mezzo droga rimangono trattamenti brevi (24 h) e vengono avviati all'inizio della coltura²⁶. Il seguente protocollo descrive importante convalida aspetti rilevanti per l'istituzione e l'analisi delle culture di fetta di tumore, prima della loro applicazione in farmacologica della droga.

Protocollo

Tutti gli esperimenti del mouse descritti in questo studio sono stati effettuati seguendo le linee guida dal Consiglio nazionale finlandese di sperimentazione animale e sono stati approvati dal comitato di animale sperimentale dell'Università di Helsinki e la provinciale di stato Ufficio della Finlandia meridionale (licenza numero ESAVI/9752/04.10.07/2015).

1. preparati prima di affettare

1. Tenere pronti i seguenti materiali: vibratome portacampioni, vibratome tampone vassoio, piastra di coltura di 10 cm, piastra a 24 pozzetti, pipetta da 10 mL, pipetta boy, sacchetto di rifiuti, 70% EtOH in una provetta da 50 mL per disinfettare gli strumenti e colla del tessuto.
2. Preparare il vibratome: pulire il supporto della lama con 70% EtOH, allegare una nuova lama ed eseguire un vibrocheck secondo le istruzioni fornite nel manuale (http://photos.labwrench.com/equipmentManuals/10103-3895.pdf).
   Nota: È importante eseguire il passo di vibrocheck, minimizza la deviazione verticale della lama e garantisce fette di buona qualità.
3. Riempire ogni bene della piastra a 24 pozzetti con 1 mL di Hanks bilanciato sale soluzione (HBSS) completati con 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina (HBSS + P/S); tenere la piastra sul ghiaccio.
4. Preparare il terreno di coltura F12 completato con 100 U/mL penicillina, 100 µ g/mL di streptomicina, glutamax 2 mM, 22 mM glucosio e 10% siero bovino fetale (FBS).
   Nota: I supplementi di terreno di coltura e fattore di crescita di fetta di tumore possono variare a seconda del tessuto del tumore²⁵.
5. Preparare la quantità necessaria di F12 medio per trattamento farmacologico, utilizzando la stessa composizione come descritto al punto 1.4, ma omettendo il FBS.
   Nota: Poiché i fattori di crescita nel siero possono influenzare segnalazione oncogeno in fette coltivate, medium senza siero è consigliabile per studi a breve termine di perturbazione droga sulle fette di tumore. Se a più lungo termine fetta culture vengono analizzate, è importante innanzitutto valutare l'effetto del medium senza siero sulla fattibilità del tessuto e dell'espressione dei marker di tumore-specific nelle culture della fetta non trattati.

2. raccolta dei polmoni del tumore-cuscinetto

1. Eutanasia di un mouse del tumore-cuscinetto di dislocazione cervicale quando mostra sintomi di respiro affannoso e perdita di peso corporeo.
   Nota: CO₂-mediata eutanasia è conosciuto per indurre condizioni di ipossia nei polmoni, che possono avere un effetto sulla redditività di fetta o attività oncogena via suscitando una risposta ipossica.
2. Estendere il mouse eutanasizzato su un coperchio di polistirolo inserendo aghi 30 G in tutti i quattro zampe, in modo che il petto è esposto.
3. Tagliare aperto la pelle dall'addome verso il petto e fino alla regione del collo. Aprite la gabbia toracica e quindi il diaframma per esporre il polmone e il cuore. Tenere le forbici in una posizione angolata per evitare danni ai tessuti.
4. Sezionare i polmoni del tumore-cuscinetto insieme cuore e inserirli in una provetta da 50 mL contenente 30 mL di gelida HBSS + P/S; tenere il tubo ghiacciata e procedere al passaggio successivo più rapidamente possibile.
   Nota: Ritardi nel trattamento dei tumori del polmone possono alterare oncogeniche funzioni, ad esempio attività di via di segnalazione.

3. generazione del tumore del polmone di precisione di taglio fette

1. Trasferire i polmoni del tumore-cuscinetto in HBSS + P/S in una piastra di coltura del tessuto di 10cm conservata all'interno di una cappa laminare. Separare i lobi del polmone usando pinze e forbici sterili e selezionare i lobi con tumori sulla superficie per affettare.
   Nota: Tumori > 3 mm di dimensioni adatte per affettare. Dal tessuto polmonare normale che circondano i compromessi di grande tumore l'affettamento a causa delle differenze nella rigidità dei tessuti, tessuto del tumore in fase di taglio deve essere separato dal tessuto normale, tale che una regione di tumore sgomberati affronta la lama del vibratome.
2. Generare una superficie del pezzo di tessuto piatto da parte di taglio del tessuto polmonare normale che circonda il tumore con un bisturi sterile e immergere il vetrino piatto in una goccia di adesivo cianoacrilato. Montare questo lato quest'esemplare del vibratome così che il tumore sia rivolto verso la lama in posizione verticale. Lasciate che la colla secca per 2 – 3 min.
   Nota: Il tessuto polmonare normale incollato al titolare del campione non interferisce con il tumore del tessuto affettare e affettare viene interrotta prima che venga raggiunto il tessuto normale. Il tessuto del tumore si piega a volte a causa della struttura spugnosa del tessuto polmonare normale incollato al portacampioni, compromettere la sua posizione verticale. Se questo accade, incollare un pezzo di tessuto di supporto aggiuntive polmonare normale accanto al tessuto polmonare normale pre-montato per mantenere il tumore in posizione verticale (Figura 1A iii).
3. Inserire il vassoio di metallo buffer il portacampioni e riempirlo con freddo HBSS + P/S fino a quando il tessuto è immerso nel buffer. Mettere il vassoio di metallo buffer sul bagno bianco ghiaccio e aggiungere ghiaccio così per mantenere il tessuto fresco mentre affettare.
4. Collegare il bagno di ghiaccio bianco del vibratome. Selezionare le impostazioni appropriate per affettare: ampiezza compresa tra 2,5-2,8, affettare velocità tra 0,10-0,14 ms e uno spessore di taglio compreso tra 160-250 µm.
   Nota: Per affettare impostazioni devono essere regolati secondo la durezza del tessuto. Tessuto duro è più facile da affettare di tessuto più morbido e più morbidi tessuti richiede affettare con velocità inferiore (0,1 – 0,12 ms) e maggiore ampiezza (2.6-2.8). Un grande tumore di 4 – 5 mm fornisce in genere 15-20 fette di spessore di 200 µM. Per la coltivazione a breve termine, tumori murini possono essere affettati in condizioni semi-sterile di fuori della cappa laminare. Tuttavia, i tumori clinici dovrebbero essere affettati sempre all'interno di una cappa di laminare di classe II biosicurezza per evitare l'esposizione a possibili agenti infettivi nel tessuto umano.
5. Utilizzando pinze sterili, raccogliere le fette in 1ml di HBSS in pozzetti separati di una piastra a 24 pozzetti tenuta sul ghiaccio, strettamente mantenendo traccia dell'ordine in cui fette sono affettati. Contrassegnare ogni bene della piastra a 24 pozzetti secondo il piano sperimentale. Ad esempio, pozzetti di una piastra di 24 pozzetti sequenziale mark come momenti di cultura o come h 0, controllo del veicolo (C), droga trattata (T) (Figura 1B ii).
   Nota: Non disturbare o tirare il tessuto del tumore durante la raccolta di una fetta, in quanto ciò modificherà orientamento del tumore rispetto all'angolo della lama, che conduce a incongruenze negli spessori delle sezioni successive.
6. Quando vengono raccolte tutte le fette, trasferirli su griglie di titanio (2-3 fette per griglia) inseriti in una piastra a 6 pozzetti contenenti 2,5 mL di terreno di coltura per pozzetto. Assicurarsi che nessun bolle d'aria si formano tra la griglia di titanio ed il mezzo.
   1. Per caricare una fetta a griglia, mantenere la piastra a 6 pozzetti in posizione angolata, in modo che una parte del mezzo copre la griglia e posizionare la fetta nel medio sulla griglia; usare pinze per allargare la fetta se si arriccia. Caricare le piastre 6 pozzetti sull'unità di incubazione rotante posizionata all'interno di un incubatore a 37 ° C con aria di 95% e 5% CO₂e avviare il ciclo di rotazione (Figura 1 , i-ii).
      Nota: Griglie metalliche e la piastre da 6 pozzetti devono essere accuratamente peso equilibrato prima di accendere l'unità rotante. È importante posizionare le fette al centro della griglia affinché essi completamente alternativo tra le fasi liquide durante i cicli di rotazione e di aria. Fette che vengono inseriti troppo bassa o troppo alta non sono esposti in modo appropriato a ossigeno o sostanze nutritive (Figura 1 io), che possono compromettere la vitalità del tessuto. È importante seguire la posizione della fetta sulla griglia durante la coltivazione, come la fetta occasionalmente può scivolare giù. Se questo accade all'interno di 1 – 2 h dell'inizio di cultura, correggere la sua posizione e annotare che in questo esempio potrebbe essere danneggiato. Fette che sono mispositioned per un periodo prolungato di tempo dovrebbero essere scartati, perché la vitalità del tessuto è significativamente influenzato da improprio ossigenazione e l'apporto nutritivo.
7. Raccogliere una fetta del tessuto adiacente le fette coltivate come un h 0, incolto, riferimento. Raccolta di riferimento almeno tre sezioni per rappresentare alto, medio e al centro del tessuto viene affettato. Difficoltà le fette di 0 h immediatamente e il processo come descritto in 5.1.
   Nota: Se il numero di fette è limitato, ad esempio, se sono fatte più trattamenti composti o repliche del Museo tecnici, comparazioni di ogni campione trattato con relativo campione 0 h vicini possono essere difficile. In tali casi, è possibile utilizzare la fetta 0 h più vicina (almeno 400 – 600 µm apart) per valutare la redditività relativa del tessuto o espressione degli indicatori pertinenti all'inizio di cultura.
8. Per la coltivazione a lungo termine, ricostituire il terreno di coltura ogni giorno. Sollevare la griglia contenente le fette di tessuto usando pinze sterili e posizionarlo in un pozzetto vuoto della piastra 6 pozzetti; sostituire il 70% del mezzo con terreno di coltura fresco e posizionare la griglia indietro nel mezzo. Continuare il ciclo di rotazione come spiegato al punto 3.6.

4. trattamento di tumore fette con piccole molecole inibitrici

1. Preparare le necessarie concentrazioni dei composti nel mezzo di trattamento. In genere, per ottenere l'inibizione di destinazione in fettine di tessuto è necessaria una maggiore concentrazione di farmaco 10 volte rispetto ai IC50s misurata nelle colture cellulari. Per evitare la citotossicità aspecifiche, testare un intervallo di concentrazioni da ottenere minimamente efficace concentrazione per ciascun composto. Qui, abbiamo testato 0,1 – 1 µM del dactolisib di inibitore di PI3K/mTOR e 0.05 – 0,5 µM della selumetinib di inibitore MEK sulle fette di NSCLC murini.
2. Aggiungere 2,5 mL di media con il farmaco diluito o DMSO o un altro controllo del veicolo nella piastra 6 pozzetti. Posizionare le griglie di titanio nei pozzetti.
3. Sistemare le fettine di tessuto sulle griglie come descritto al punto 3.6.
4. Eseguire trattamenti di veicolo o farmaco per 24 h. procedere con il fissaggio del tessuto e la trasformazione delle fette in blocchetti di paraffina come descritto nella sezione 5.
   Nota: La durata del trattamento farmaco può essere ottimizzata in funzione obiettivo dell'esperimento, prendendo in considerazione la capacità delle fette del tessuto di conservare in situ le funzioni dei tessuti analizzate durante il periodo di coltura.

5. la fissazione e l'elaborazione delle fette del tessuto

1. Sollevare con cautela il riferimento incolto h 0 o fetta coltivata su una carta da filtro imbevuta di PBS.
   1. Per effettuare questa operazione, aggiungere 2-3 mL di PBS in un piatto di 10 cm, lasciare che il galleggiante di fetta in PBS e 'pesce' sollevando la fetta sulla carta da filtro con un paio di pinze.
   2. Trasferire la carta da filtro in un histocassette e aggiungere una goccia di ematossilina diluito (1:1 in acqua deionizzata) sopra la fetta di tessuto visibilmente segnare la posizione della fetta durante le fasi di lavorazione successive (Figura 1).
   3. Chiudere la cassetta e trasferirlo nella soluzione al 4% formalina neutra tamponata. Difficoltà i tessuti durante la notte a 4 ° C.
      Nota: Durante l'inserimento la fetta sopra la carta da filtro, assicurarsi che la sezione superiore della fetta è rivolto verso l'alto; Questo è necessario seguire il top, middle e parte inferiore di una fetta durante il sezionamento e l'analisi come descritto al punto 6.3.
2. Il giorno successivo, trasferire le cassette in 70% EtOH e immediatamente procedere con la fase di lavorazione del tessuto inclusione in paraffina.
3. Prima della lavorazione del tessuto, lavare il histocasettes in 100% EtOH 2 x per 10 minuti ciascuno. In questo caso, utilizzare una stazione di forno a microonde per l'elaborazione del tessuto. Selezionare il programma utilizzato per 1 mm di spessore del tessuto e seguire le istruzioni fornite nel manuale (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf).
   Nota: Quando si utilizza altre macchine di lavorazione del tessuto, usare il programma adatto per campioni di tessuto sottile.
4. Per inclusione in paraffina, aprire un histocassette e utilizzare un bisturi per sollevare con cautela la fetta dalla carta da filtro. Scartare la carta da filtro e trasferire la fetta in uno stampo contenente paraffina liquida.
   1. Premere il tessuto contro il fondo dello stampo che utilizza, per esempio con un peso piatto, affinché anche il sezionamento. Posizionare la parte inferiore del histocasette sopra lo stampo, lasciare raffreddare la muffa su un pate di freddo per 30 min e separare lo stampo dal blocco di paraffina.
      Nota: In alternativa all'incorporamento orizzontale, è possibile incorporare la fetta di tumore verticalmente posizionando la fetta in posizione verticale. Sezioni verticali facilmente consentono un'analisi dei gradienti nell'attuabilità o espressione di marcatori funzionali su una singola sezione ²⁵. Analisi di pendenza con fette orizzontalmente incorporato richiede paraffina sezionamento come descritto al punto 6.2.

6. elaborazione ed analisi di formalina-fisso e paraffina (FFPE) tessuti

1. Preparare 4 µm di sezioni sottili di blocchi di fetta di tessuto FFPE utilizzando un microtomo. Durante il taglio, regolare l'angolo del blocco in modo che la superficie del blocco è orientata orizzontalmente rispetto alla lama; Ciò è necessario per ottenere sezioni anche in tutto il tessuto.
2. Per consentire l'acquisizione di una pendenza potenziale redditività indotta da cultura, migrazione delle cellule attraverso le fette, o gradienti in espressione di biomarcatore attraverso fette coltivate, raccogliere le sezioni dagli strati superiore, inferiore e centro di ogni fetta il tessuto su vetrini oggetto come spiegato di seguito.
3. Raccogliere le sezioni di tessuto sequenziale della fetta tessuto paraffina-incastonato in primo luogo sulla parte superiore le diapositive di vetro. Continua a raccogliere le sezioni degli strati più profondi del tessuto a metà seguita dalla parte inferiore delle diapositive di vetro (Figura 1E).
   Nota: Per ospitare tre sezioni su un vetrino, tagliare via l'eccesso di paraffina che circonda la fetta di tessuto incorporato.
4. Consentire le sezioni per asciugare durante la notte a 37 ° C e procedere con H & E macchiatura o immunohistochemistry come descritto di seguito.
   Nota: Perdita di antigenicità può verificarsi quando le sezioni FFPE sono memorizzate a temperature elevate o per lunghi periodi di tempo. Sezioni della paraffina sono raccomandate per essere conservato a 4 ° C, e IHC analisi devono essere effettuate entro 6 mesi dopo il sezionamento.
   1. Per la colorazione H & E, deparaffinizzare e reidratare le sezioni di paraffina come segue: xilene 3 x per 5 min, 100% EtOH 3 x per 1 min, 96% EtOH 2 x per 1 min, 70% EtOH 1 x 1min e acqua deionizzata 2 x per 1 min.
   2. Incubare le sezioni in soluzione di ematossilina appena filtrata per 10 min e lavare sotto acqua corrente per 5 min, Dip le sezioni in alcool acido (1% HCl in 70% EtOH) per 2 volte e lavare sotto acqua corrente per 5 min seguita da incubazione con eosina 0,5% per 2 m a.
   3. Seguendo il passo di eosina, disidratare le sezioni immergendo i vetrini in alcool e xilene soluzioni, come segue: 96% EtOH 2 x per 15 s, 100% EtOH 3 x per 30 s, xilene 3 x per 1 min. Infine, incorporare le sezioni in un mezzo di montaggio a base di xilene.

7. analisi dei Biomarker espressione e vitalità del tessuto

1. Acquisire immagini ad alta risoluzione generando scansioni intera diapositiva di vetrini colorati utilizzando uno scanner. Per valutare la vitalità del tessuto, scattare istantanee da scansioni dei tessuti che rappresentano le sezioni superiore, medio e inferiore delle fette.
   1. Utilizzando software di manipolatore foto, disegnare manualmente maschere sulle aree necrotiche dei tessuti, seguiti dalla quantificazione delle regioni necrotiche con MATLAB.
   2. Calcolare la redditività relativa delle fette coltivate per intervalli di tempo differenti rispetto alla più vicina sezione h 0 come fatto nel nostro precedente studio (Närhi et al., Figura S2B e C)²⁶. Allo stesso modo, valutare gradienti di redditività potenziale intra-fetta quantificando vitalità nella sezione superiore, medio e inferiore di una fetta colta e calcolare la redditività relativa di ogni sezione a sua fetta 0 h più vicino.
      Nota: Mentre la mera coltivazione delle fette NSCLC murini induce la morte necrotica delle cellule, risposte biologiche per le condizioni di coltura ex vivo variano a seconda del tessuto del tumore. Ad esempio, pendenze in HIF1α, ER e macrofagi segnati da F4/80 sono state rilevate nelle culture di filtro-supportato fetta derivate da un modello di cancro al seno²⁵. Di conseguenza, H & E - così come analisi di IHC-basate di fette coltivate devono essere considerati per ogni tipo di tessuto.
2. Eseguire IHC su sezioni di paraffina. Il seguente protocollo IHC è un punto di partenza e richiede ulteriore ottimizzazione per altri anticorpi. Brevemente, deparaffinizzare e reidratare le sezioni di paraffina come segue: xilene 3 x per 5 min, 100% EtOH 3 x per 1 min, 96% EtOH 2 x per 1 min, 70% EtoH 1 x per 1 min e acqua deionizzata 2 x per 1 min.
   1. Per esporre gli epitopi antigenici, eseguire il recupero di calore-mediata antigene utilizzando acido citrico 10 mM a pH 6 in un modulo di PT, seguito bloccando con 1% di sieroalbumina bovina (BSA) e 10% di siero di capra normale (NGS) in PBS 1X per 30 min a temperatura ambiente (21-23 ° C).
   2. Incubare l'anticorpo primario diluito in BSA 1% e 5% NGS in PBS 1X, sia per 1 – 2 h a temperatura ambiente. Incubare con l'anticorpo secondario anti-coniglio, per 30 min a temperatura ambiente, seguita da rilevamento utilizzando 3, 3 '-diaminobenzidina (DAB).
   3. Sezioni sono controcolorati con ematossilina (diluito a 01:10 in acqua deionizzata) per 30 s e lavare sotto acqua corrente per 5 min, seguita da disidratazione immergendo i vetrini in alcool e xilene soluzioni, come segue: 70% EtOH 1 x, 96% EtOH 2 x, 100% EtOH 3 x, xilene 3 x ( 1 min ogni passo). Infine, incorporare le sezioni in un mezzo di montaggio a base di xilene.
3. Acquisire scansioni intera diapositiva di vetrini colorati IHC, esportarle come immagini TIFF in un rapporto di ingrandimento di 1:4 mediante l'utilizzo di un visualizzatore di immagini ed eseguire le quantificazioni usando ImageJ.
   Nota: come alternativa allo scanner, immagini microscopiche alle X 20 o 40 ingrandimenti possono essere acquisite per quantificazioni. Ingrandimento dell'immagine possa essere scelti a seconda il marcatore da quantificare; immagini di alto ingrandimento sono consigliate per la macchiatura nucleare, mentre citoplasmatici o marcatori di membrana possono essere quantificati utilizzando 20 immagini X.
   1. Per la quantificazione dei marcatori nucleari, in questo caso NKX2-1 espressione, convertire ogni immagine in immagini a 16 bit utilizzando Fiji-ImageJ e caricare immagini per analisi di immagine.
   2. Personalizzare la pipeline di analisi di immagine in base all'analisi. In questo protocollo, è necessario utilizzare la pipeline seguente per la quantificazione dei nuclei positivi NKX2-1: identificare oggetti primari | Misurazione dell'intensità dell'oggetto | Filtrare gli oggetti (valore minimo = 0,0025) | Calcolare Math. I risultati sono rappresentati come percentuali di DAB-ha macchiato i nuclei del numero totale dei nuclei.

Risultati

Figura 1 rappresenta il flusso di lavoro per la generazione, la coltivazione e l'analisi precisione di taglio delle fette del tessuto derivate da tumori murini di NSCLC. Per questa dimostrazione, abbiamo utilizzato i tumori da un modello di topo geneticamente (GEMM) che harboring attivazione condizionale di Kras^G12D insieme con la perdita di Lkb1 (noto anche come serina/treonina chinasi 11), in prosieguo denominato KL. L'inizio del tumore del polmone e allevamento mouse è stata eseguita come descritto nel^26,di²⁸. Figura 2A viene illustrato l'effetto di spessore fetta del tessuto sull'attuabilità delle fette coltivate per 24 h utilizzando un'unità di incubazione rotante. I risultati mostrano che 160 µm fette sottili contengono ampie aree necrotiche in tutta la fetta. Inoltre, 250 µm fette sottili mostrano una necrosi gradienti in tutta la sezione rispetto alla 200 µm fette sottili. È probabile che la scarsa vitalità generale del più sottile 160 µm è causata dalla gestione tecnica durante il posizionamento delle fette in cima le griglie, in quanto questi sono fragili e tendono ad arricciarsi. D'altra parte, quando le sezioni sono troppo spesse, che possono diventare soggetti a carenze di ossigeno o diffusione dei nutrienti attraverso le fette, che nel NSCLC murino espianti è evidenziato come morte necrotica gradiente²⁵. Tuttavia, dovrebbe essere notato che le fette con spessore variabile possono essere generati da un tumore, malgrado uso del vibratome identiche impostazioni. Si raccomanda pertanto di analizzare più replicati da campioni differenti del tumore. Cosa importante, ogni tipo di tessuto richiede l'ottimizzazione di spessore di fetta per ottenere la massima redditività, come la struttura del tessuto e la durezza può influenzare l'ossigenazione e il flusso dei nutrienti. Figura 2B -2C illustra analisi quantitative di IHC di espressione NKX2-1, un marcatore dell'adenocarcinoma bene-differenziato del polmone (AC) in campioni coltivati fino a 72 h e abbinati fette 0 h. I risultati mostrano che espressione NKX2-1 non è significativamente alterata in fette coltivate rispetto a 0 ore fette incolte, suggerendo che il processo di coltivazione non pregiudica apertamente lo stato di differenziazione del tessuto del tumore AC. Figura 2D dimostra l'utilità delle fette del tessuto del tumore per valutare l'efficacia di farmaci mirati. Recentemente abbiamo mostrato quel Kras mutante murino ACs esibire un'alta espressione di fosforilata ERK1/2 (marcatura aumentata attività di via MAPK) rispetto ai tumori adenosquamous (ASC), mentre l'espressione di 4EBP1 fosforilato (mTOR attività di marcatura ) allo stesso modo si esprime nei tumori sia AC e ASC. Per verificare se queste vie possono essere efficacemente mirate su fettine di tessuto, fettine di tessuto KL AC sono stati trattati con DMSO o titolato quantità di composti, cioè 0,1 – 1 µM dactolisib per indirizzare il mTOR o 0,05 – 0,5 µM selumetinib per indirizzare la via di MAPK. Risultati mostrano che dactolisib 1 µM o 0,5 µM di selumetinib sono efficaci nell'inibire la fosforilazione di ERK1/2, o di 4EBP1 rispettivamente. Inoltre, l'inibizione dose-dipendente delle fosfoproteine mirati indica che fettine di tessuto possono essere utilizzati anche per convalidare la fosforilazione di specifici anticorpi.

Figura 1: rappresentazione schematica del flusso di lavoro per creazione e analisi di murini espianti di tumore-derivato fetta NSCLC. (A) schema che descrive la raccolta e la preparazione dei polmoni del tumore-cuscinetto per affettare. I lobi del polmone sono raccolte da un mouse e tessuto del tumore è dissecato dal tessuto normale. La punta di freccia nera e asterisco indicano circa 4 mm e 1 mm tumori, rispettivamente. La punta della freccia bianca indica il tessuto polmonare incollato sulla superficie del portapreparato. La freccia rossa punta a un ulteriore pezzo di tessuto di sostegno del polmone normale per mantenere il tumore in posizione verticale. (B) Vibratome affettamento e raccolta delle fette del tessuto. Freccia bianca indica la direzione per affettare. Raccolta di fette sequenziale in una piastra a 24 pozzetti contenenti freddo HBSS + P/S. Le fette possono essere coltivate per intervalli di tempo differenti (qui, 24 – 72 ore) per valutare l'espressione di marcatori tumore-specifici durante la coltivazione (riga superiore), o possono essere utilizzate per eseguire trattamenti farmacologici. C: controllo del veicolo, t: trattamento farmacologico. (C) mettere la fetta di tessuto per coltivazione utilizzando gruppi rotanti di incubazione. Inclinare la piastra a 6 pozzetti in modo che qualche mezzo copre la parte superiore della griglia, mettete la fetta di tessuto al centro della griglia in cima il mezzo e diffondere la fetta usando il forcipe. Assicurarsi che la piastre da 6 pozzetti sono peso bilanciato per un ciclo di rotazione liscio. X: indica errato, e : indica il corretto posizionamento della fetta. (D) fotografia del blocco FFPE di una fetta del tumore. Punti di freccia nera alla fetta di tessuto paraffina-incastonato colorate con ematossilina. (E) schemi mostrando l'ordine taglio delle fette in blocchi FFPE; Queste sezioni possono essere elaborate per valutare la vitalità del tessuto e l'espressione di biomarcatore del tumore-specifici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: valutazione di attuabilità e istotipo specifico dell'espressione dei marker e trattamento farmacologico mirato su fettine di tessuto NSCLC. (A) rappresentante H & E immagini di fette di NSCLC AC degli spessori indicati coltivati per fette sottili di 24 h. 200 µm mantengono vitalità migliore rispetto a 160 µm o 250 µm fette sottili. Blu scuro rappresenta H & E macchiato il tessuto vitale, e rosa indica pseudocolored regioni necrotiche. Luce blu indica le regioni escluse dall'analisi, sia per la qualità scadente del tessuto o la presenza di stroma fibroso. T1 e T2 rappresentano replicati biologici derivati da due tumori diversi. Barra della scala = 500 µm. (B) IHC rappresentante immagini di espressione NKX2-1 in AC fette coltivate per i punti di tempo indicato. Freccia indica l'area mostrata a maggiore ingrandimento. Risultati mostrano che l'espressione NKX2-1 non è alterata nelle fette coltivate rispetto alle fette 0 h. Barra della scala = 500 µm e 50 µm per ingrandimenti di bassi e alti, rispettivamente. (C) la quantificazione dei dati illustrati in (B). (D) rappresentante IHC immagini di 4EBP1 fosforilati o espressione pERK1/2 in 0 h fette, o fette trattati con DMSO o titolato quantità di dactolisib (dact, riga superiore) o fosforilato espressione pERK1/2 in 0 h fetta, o fette trattati con DMSO o selumetinib (sel, riga inferiore). Scatole quadrate nere indicano nelle aree indicate nel più alto ingrandimento. Barra della scala = 1 mm o 50 µm per ingrandimento basso o alto, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Sono stati sviluppati vari complessi in vitro modelli del tumore, tra cui 3D culture e organoids, ricapitolando l'architettura e le funzioni oncogeniche di in vivo del tumore del tessuto^29,30. Tuttavia, la creazione del 3D culture o organoids implica la dissociazione dei tessuti e la crescita selettiva di un tipo di cella singola o co-coltura di un selezionare alcuni tipi di cellule in un ambiente artificiale. Di conseguenza, tali modelli catturano in modo incompleto la complessità delle interazioni tumore-stroma ed eterogeneità del tumore. Fette di tumore organotipiche, d'altra parte, mantengono le complessità di architettura e biologico del tessuto del tumore in situ , senza manipolazione estesa. Questa capacità di fettine di tessuto alle cellule del tumore di modello nel loro microambiente nativo li rende particolarmente attraenti per gli studi preclinici. Precedentemente abbiamo segnalato un flusso di lavoro ottimizzato per la creazione e l'analisi delle fette di taglio di precisione del tumore, e ha dimostrato che, rispetto al filtro supporta, un'unità di incubazione rotante migliorare la redditività a breve termine murino NSCLC fetta culture^{25 , 31}. Tuttavia, la coltivazione su unità rotanti è tecnicamente impegnativo e richiede un monitoraggio costante. Qui presentiamo un protocollo per tumore del tessuto fetta generazione e utilizzo pratico di una rotazione unità di incubazione per la loro cultura, nonché metodi per monitorare la capacità delle fette di catturare in situ biologia del tumore, un prerequisito prima droga di accompagnamento test di risposta.

Diversi passaggi critici nel protocollo di garantiscono l'integrità del tessuto e l'attuabilità delle fette del tumore. Se il tessuto polmonare normale circonda il tumore, del vibratome può generare fette con spessore incoerente o danneggiare le fette, a causa delle differenze nella struttura e rigidezza tra tessuti normali e tumorali. Così è importante rimuovere il tessuto polmonare normale circostante prima del tumore affettare. Un altro punto critico è lo spessore per affettare, che dovrebbe essere attentamente ottimizzato per ogni tipo di tessuto. Inoltre, una volta affettato, è fondamentale che la fetta si trova circa al centro della griglia, così per assicurare precisi intermittente immergendo nel terreno di coltura e di esposizione all'ossigeno. Infine, è importante seguire la posizione di una fetta durante il suo periodo di rotazione, come una fetta può cadere in al supporto; Se questo accade, ulteriori azioni possono essere assunto come spiegato al punto 3.6 del protocollo.

Oltre che il tessuto movimentazione per garantire l'integrità, ci sono anche passaggi critici nell'analisi IHC per interpretare come la fetta è simile al tessuto nativo. Il nostro studio precedente ha mostrato che i tumori murini NSCLC esibiscono eterogeneità spaziale pronunciate intra-tumorale in oncogeno segnalazione attività²⁶. Ciò significa che l'uso di tessuto spazialmente distinti fette per i controlli o campioni di droga trattato possono influenzare l'interpretazione dei dati sperimentali affidabili, e pertanto è opportuno utilizzare fette strettamente adiacenti come controlli e campioni di prova. Abbiamo ulteriormente indicato che mentre proliferazione o espressione di oncogeni fosfoproteina in fette appena tagliata incolto h 0 erano simili ai tumori in situ , fette coltivate ha mostrato l'espressione alterata della fosfoproteina oncogeno, specificatamente alterata p4EBP1 e pSRC, come pure alterata proliferazione analizzati da Ki67 IHC. P4EBP1 alterata espressione allo stesso modo è stata rilevata in 24h NSCLC umano e del carcinoma della prostata fetta culture (Narhi et al., complementare figura S3B-S3C, S5 e S7)²⁶. Questi risultati approvare che il confronto delle fette coltivate con la loro fetta di incolto 0 h più vicina è fondamentale per valutare la conservazione delle funzioni di tumore in situ a fette coltivate.

Nonostante migliorando la redditività di organotipiche fette²⁵, ci sono limitazioni con il sistema di rotatore in termini di tecnicismi. Mettere le fette di tessuto su griglie di titanio è più impegnativo rispetto per filtrare inserti, e un'unità di incubazione rotante potrebbe non essere disponibile. In alternativa, supporta filtro stagnante può essere utilizzato, ma in tal caso solo il lato aria-esposti delle fette dovrebbe essere analizzato, come a-filtro dell'aria gradienti in vitalità e ipossia misurato dall'espressione HIF1α rapidamente sono formati in fetta filtro-supportato culture (Davies et al., figura 5 e figura 7A-7B)²⁵. Inoltre abbiamo dimostrato che colture di fetta di tumore possono esibire alterata proliferazione e attività di segnalazione oncogenica rispetto a loro tumori nativo²⁶, possibilmente a causa di risposte di cicatrizzazione o adattamento metabolico delle fette di ex vivo culture³². Anche se lorda caratteristiche morfologiche dei tumori murini NSCLC sono state mantenute durante la coltivazione di 72h, indotta da cultura proliferative modifiche possano influire sulla classificazione accurata delle fette coltivate. Così, fettine di tessuto dovrebbero essere utilizzati solo per studi funzionali a breve termine.

Uso di un'unità di incubazione rotante salva almeno parzialmente intra-fetta attuabilità o biomarcatore sfumature di espressione, specialmente durante le prime 24 ore di cultura. Una volta convalidato l'integrità e la funzione, questo fornisce materiale tissutale per studi funzionali, come ad esempio studi di trattamento della droga. Oltre droga risposta profilatura, espressione di destinazione alterata dopo trattamento farmacologico può beneficiare anche convalida dell'anticorpo. Ciò è particolarmente rilevante per la rilevazione degli epitopi murini con anticorpi monoclonali di topo, in quanto questi tendono a dare alta priorità bassa colorazione. Inoltre, ben convalidati gli anticorpi necessari per ottenere dati affidabili e riproducibili nelle impostazioni di diagnostiche e cliniche. Così, modulazione dell'abbondanza o fosforilazione degli epitopi rilevanti dopo trattamento farmacologico in fette di tessuti fornisce una comoda applicazione pratica nella convalida dell'anticorpo. Dei principali vantaggi di culture della fetta del tumore è la capacità di funzioni del modello spazialmente distribuiti, tra cui attività oncogena di segnalazione o risposta ai farmaci nel tumore o le cellule stromali, che li rende un modello attraente ex vivo . Tuttavia, fette ruotano durante la coltivazione, e il processo di coltivazione possa più ulteriormente danneggiare il tessuto particolarmente ai bordi. È pertanto difficile al proprio overlay le immagini IHC macchiato di biomarcatore di fette 0 h con le regioni necrotiche rilevate in fette coltivate, che compromette la capacità di collegare precisamente attività spaziali biomarcatore di risposta ai farmaci. Inoltre, le risposte necrotiche del tumore intrinseco, indotta da cultura e farmaco-indotta sono indistinguibili almeno in fettine di tessuto NSCLC murini, compromettere la quantificazione accurata delle risposte farmacologiche spaziale. Infine, l'uso di colture di fetta del tumore permette un ricercatore alla prova più composti sul tumore stesso, senza la necessità di trattare gli animali, così raffinazione, la riduzione e la sostituzione di esperimenti su animali da laboratorio.

Come una futura applicazione, il protocollo descritto può essere adottato per i campioni clinici tumore solido. Ulteriori modifiche a seconda del tipo di tessuto o ottimizzazioni sono probabilmente necessari, a partire con aggiustamenti per le impostazioni di vibratome tra cui velocità di vibrazione e spessore fetta per ottimizzare questi per tumore texture o rigidità. Inoltre, requisito di nutrienti e fattori di crescita può variare per i tessuti differenti del tumore. Ad esempio, fette di cancro al seno hanno stati coltivati con insulina completato nella media^13,18. Dato che il materiale tissutale limitata ottenuta durante un intervento chirurgico o biopsia, ottimizzazione delle culture fetta paziente-derivato del tumore può essere difficile a causa della difficoltà nel reperire un numero sufficiente di campioni replicati. Inoltre, riproducibilità dei dati anche è sfidato da pronunciata eterogeneità di campione del paziente--paziente, particolarmente nella percentuale delle cellule del tumore contro regioni fibrotiche o stromal si infiltra in, nonché componenti del tessuto necrotico. Infine, applicazione di fette di tumore in impostazioni di diagnostica richiederebbe indagine della misura alla quale farmaco responses in espianti di fetta di biopsie pre-trattamento corrisponde alle risposte di post-trattamento in vivo .

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Hank' s Soluzione salina bilanciata (HBSS)	Sigma	H6648
Penicillina Soluzione di streptomicina	Thermo Fischer Scientific	15140-122
Ham's F-12 medium	Thermo Fischer Scientific	21765-037
Glucosio	VWR	101174Y
FBS	Thermo Fischer Scientific	10270-106
Glutammina 200mM	Thermo Fischer Scientific	25030-024
Adesivo cianoacrilato (GLUture)	Abbott	32046-90-1
Leica VT1200 S Microtomo a lama vibrante	Leica Biosystems	14048142066
Lama per affettare	VWR	PERS60-0138
Griglie in titanio	Albamma Ricerca e sviluppo	MA0036
Incubazione a fette unità	Albamma Ricerca e Sviluppo	MD2500
Piastra per coltura tissutale da 10 cm	Sarstedt	83.1802
Piastra da 24 pozzetti	Sarstedt	83.1836
Piastra da 6 pozzetti	Sarstedt	83.1839
Aghi ipodermici Neolus	Terumo Neolus	NN2525R
provetta per falco da 50 ml	Greiner
PBS	Lonza	BE17-517Q
Formaldeide	Fisher	F/1501/PB08
Trifold histo cassetta carta	Cancer Diagnostics	DX26280
Histo cassette	VWR	720-2199
KOS Il processatore tissutale multifunzionale a microonde	Milestone SRL	CAT307EN-003
Microtomo	Thermo Fischer Scientific	HM355S
Superfrost Ultra plus vetrini	VWR	631-0099
BSA	Sigma	A2153
NGS	Thermo Fischer Scientific	16210-064
Acido citrico	Sigma	C1909
PT-Module	Thermo Fischer Scientific	A80400012
ematossilina per H& Colorazione E	Merck	1.09249.0500
Ematossilina per controcolorazione	Dako	S3309
Eosin	Sigma	E4382
NKX2-1 anticorpo	Abcam	ab133638	Numero di lotto: GR98031-12
pERK 1/2 anticorpo	Tecnologie di segnalazione cellulare	CST 4370	Numero di lotto: 17
p4EBP1 anticorpo	Segnalazione cellulare Tecnologie	CST 2855	Numero di lotto: 20
BrightVision poly-HRP Anticorpo secondario anti-coniglio	di capra ImmunoLogic	VWRKDPVR-110HRP
Montaggio medicum pertex	VWR	MEDT41-4021-00
DAB	ImmunoLogic	VWRKBSO4-110
Dactolisib (NVP BEZ-235)	Selleckchem	S1009
Selumetinib (AZD2644)	Selleckchem	S1008
Pannoramic 250 scansione di vetrini	3DHISTECH
MATLAB	MathWorks		https://se.mathworks.com/ products/matlab.html
3DHISTECH VISUALIZZATORE PANNORAMICO	3DHISTECH		https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer
Adobe Photoshop CS6	Adobe		https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&mv=search&s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s
Fiji-ImageJ	ImageJ		https://imagej.net/Fiji
CellProfiler	Software di analisi delle immagini cellulari CellProfiler	http://cellprofiler.org/