Articolo metodologico

Istituzione del modello murino TK-NOG dualizzato per la patogenesi del fegato associata all'HIV

DOI:

10.3791/58645

⸱

11 settembre 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Experimental Neuroscience, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Pathology and Microbiology, University of Nebraska Medical Center

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo fornisce un metodo affidabile per stabilire topi umanizzati sia con il sistema immunitario umano che con le cellule epatiche. I topi immunodeficienti contemporanei ricostituiti ottenuti tramite iniezione intrasplessica di epotociti umani e CD34- cellule staminali ematopoietiche sono suscettibili di infezione da virus immunodeficienza umana-1 e ricapitolano i danni al fegato osservati pazienti affetti da HIV.

Abstract

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Nonostante l'aumento dell'aspettativa di vita dei pazienti infettati da virus dell'immunodeficienza umana-1 (HIV-1), la malattia epatica è emersa come una causa comune della loro morbilità. L'immunopatologia epatica causata dall'HIV-1 rimane sfuggente. Piccoli modelli animali di xenotrapianto con epatociti umani e sistema immunitario umano possono ricapitolare la biologia umana della patogenesi della malattia. In questo caso, viene descritto un protocollo per stabilire un modello murino dual eumanizzato attraverso epatociti umani e CD34- trapianto di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche (HPG), per studiare l'immunopatologia epatica osservata nei pazienti affetti da HIV. Per ottenere la doppia ricostituzione, il TK-NOG maschile (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic) topi sono iniettati intraperitonealmente con ganciclovir (GCV) dosi per eliminare le cellule epatiche transgeniche del topo, e con treosulfan per nonmieloalativi, entrambi i quali facilitare l'innesto di epatociti umani (HEP) e lo sviluppo del sistema immunitario umano (HIS). I livelli di albumina umana (ALB) sono valutati per l'innesto epatico, e la presenza di cellule immunitarie umane nel sangue rilevate dalla citometria di flusso conferma la creazione del sistema immunitario umano. Il modello sviluppato utilizzando il protocollo qui descritto assomiglia a molteplici componenti del danno al fegato da infezione da HIV-1. La sua istituzione potrebbe rivelarsi essenziale per gli studi sulla coinfezione del virus dell'epatite e per la valutazione di farmaci antivirali e antiretrovirali.

Introduzione

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Dall'avvento della terapia antiretrovirale, c'è stata una sostanziale diminuzione delle morti legate alla monoinfezione dell'HIV-1. Tuttavia, la malattia epatica è emersa come una causa comune di morbilità nei pazienti affetti da HIV1,2. Le coinfezioni dei virus dell'epatite con infezione da HIV-1 sono più comuni, rappresentando il 10% - 30% delle persone infettate dall'HIV negli Stati Uniti3,4,5.

La specificità ospite dei virus HIV-1 ed epatite limita l'utilità di piccoli modelli animali per studiare le malattie infettive specifiche dell'uomo o per studiare molteplici aspetti della patogenesi epatica associata all'HIV-1. I topi immunodeficienti che permettono l'innesto di cellule umane e/o tessuti (definite modelli murini umanizzati) sono modelli animali accettabili per studi preclinici6,7,8. Dall'introduzione di topi umanizzati nei primi anni 2000, molteplici studi preclinici sulla tossicità del fegato umano colestatico, patogeni specifici dell'uomo, tra cui HIV-1 e disturbi neurocognitivi associati all'HIV, virus Epstein Barr, epatite e altri malattie infettive, sono state studiate in questi topi6,9,10,11. Sono stati sviluppati da tempo molteplici modelli murini per CD34- HSPC e/o trapianti di epatociti umani e sono migliorati nel tempo per studiare la patogenesi patogena del virus dell'epatite B associata al virus dell'epatite B (HBV)12, 13 del sistema , 14.Diversi modelli per il trapianto di HSPC e epatocito umano (HEP) si basano su ceppi, noti come NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15, Balb/C-Rag2--- s-c -/- (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J)12, e fah-/- NOD rag1-/- il2 -rnull mouse16. Tuttavia, ogni modello ha i propri vantaggi e limitazioni; ad esempio, il doppio effetto di topi umanizzati AFC8 per HEP e cellule staminali umane (HSC) su un fondo AFC8 -C-Rag2-/-c -/- consente il successo dell'innesto di cellule immunitarie e HSC, ma vi è l'assenza di un risposta in questo modello12. Le principali preoccupazioni nella ricostruzione di topi umanizzatidoppiincludono l'innesto non ottimale, la mancanza di modelli adatti per supportare diversi tessuti, condizioni non corrispondenti, il rigetto immunitario o la malattia innesto contro l'ospite (GVHD) e la malattia difficoltà, come manipolazioni rischiose con neonati e alti tassi di mortalità a causa di anomalie metaboliche13.

Anche se i topi umanizzati sono stati utilizzati per la ricerca sull'HIV per molti anni17,18,19, l'uso di topi umanizzati per studiare i danni al fegato causati dall'HIV-1 è stato limitato20. In precedenza abbiamo riferito l'istituzione di un modello murino TK-NOG dualizzato e la sua applicazione nella malattia epatica associata all'HIV8. Questo modello mostra il robusto innesto di fegato e cellule immunitarie e riassume la patogenesi dell'infezione da HIV. Questa discussione presenta un protocollo dettagliato, che include i passaggi più critici nel trapianto di epatociti umani. Viene inoltre presentata una descrizione degli HSPC necessari per un innesto di successo degli HEP e la creazione di un sistema immunitario funzionale nei topi TK-NOG. L'uso di questi topi per studiare l'immunopatogene epatica associata all'HIV è dettagliato. Vengono utilizzati topi maschi TK-NOG che trasportano un virus simplex specifico del fegato di tipo 1 della chinasi di timina (HSV-TK). Le cellule del fegato di topo che esprimono questo transgene possono essere facilmente ablate dopo una breve esposizione a una dose non tossica di GCV. Cellule epatiche umane trapiantate sono stabilmente mantenute all'interno del fegato di topo senza farmaci esogeni21. I topi sono anche precondizionati con dosi non mieloablative di treosulfan per creare una nicchia nel midollo osseo del topo per le cellule umane8. I topi immunodeficienti TK-NOG vengono iniettati intrasplenalmente con HEP e HSPC multipotenti. I topi sono quindi regolarmente monitorati per la ricostituzione del sangue e del fegato mediante immunofenotipizzazione del sangue e misurazioni dei livelli di siero uomo-albumina, rispettivamente. I topi con una ricostituzione di successo di oltre il 15% sia per le cellule immunitarie umane che per gli HEP vengono iniettati intraperitonealmente con HIV-1. L'effetto dell'HIV sul fegato può essere valutato già da 4 - 5 settimane dopo l'infezione. È fondamentale notare che, poiché viene utilizzato l'HIV-1, tutte le precauzioni necessarie devono essere prese durante la gestione del virus e l'iniezione nei topi.

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Protocollo

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Questo protocollo è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Centro Medico dell'Università del Nebraska.

NOT: Ottenere l'approvazione dall'IACUC locale prima di eseguire esperimenti sugli animali.

1. Elaborazione del sangue di cordone ombelicale e isolamento degli HSPC umani

  1. Eseguire tutte le fasi del protocollo in condizioni sterili negli archivi di flusso laminare.
  2. Prendere il sangue del cordone ombelicale (CB) raccolto in tubi eparinizzati e rendere il volume fino a 35 mL aggiungendo salina tamponata da fosfati (PBS). Sovrapporre il campione sopra il mezzo di separazione dei linfociti (LSM) come illustrato nella Figura 1 e centrifugare l'LSM con la CB stratificata a 400 x g per 35 min a 4 gradi centigradi senza freni.
    NOTA: Diluire il sangue con attenzione e delicatamente per evitare la miscelazione all'interfaccia.
  3. Rimuovere con attenzione il superiore LSM e lo strato di plasma e trasferire l'interfaccia bianca del cappotto di bufala in un nuovo tubo utilizzando una pipetta di trasferimento.
  4. Risospendere il buffy coat in 30 - 40 mL di tampone ghiacciato (PBS - 0.5% bovine serum albumin [BSA] - 2 mM di acido etilenediamineatraacetic [EDTA]). Utilizzando una pipetta, unire 20 .
    NOT: Utilizzare buffer ghiacciato in tutte le fasi, in quanto aiuta a mantenere le cellule vitali.
  5. Centrifugare le cellule a 300 x g per 10 min a 4 gradi centigradi e aspirare con attenzione il supernatante. Quindi, aggiungere 300 l di tampone ghiacciato.
  6. Aggiungete 100 l di recettore umano dell'Fc che blocca il reagente e 100 -L di microsfere CD34 anti-umane monoclonali per un massimo di 1 x 108 cellule (vedere la Tabella dei Materiali). Incubare per 30 min a 4 gradi centigradi, aggiungere 10 mL di tampone ghiacciato per lavare le cellule e centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
    NOT: Scala questo in base al numero di cella se sono presenti più di 1 x 108 celle.
  7. Rimuovere con cura il supernatante, rispendere il pellet in 500 l di tampone, e procedere con la fase di separazione magnetica per arricchire gli HPC.
  8. Inserire una colonna LS di selezione positiva (vedere la Tabella dei materiali) nel campo di ordinamento delle celle magnetico attivato e passarla con 3 mL di buffer.
  9. Caricare il campione nella colonna LS che può intrappolare i microbi legati all'uomo CD34 in campioni e permettergli di fluire sotto l'influenza della gravità nel tubo di raccolta.
  10. Lavare la colonna 3x con buffer e raccogliere la elute nello stesso tubo di raccolta del CD34- frazione di cellule.
  11. Immergere la colonna con 5 mL di buffer per eluire lecellule CD34 - in un nuovo tubo di raccolta. Ripetere la procedura per ottenere una purezza di >90%.
  12. Contare il CD34 eluito: cellule utilizzando colorante blu trypan in un emocitometro. Dopo aver contato, centrifugare il CD34- cellule a 300 x g per 5 min e scartare il supernatale.
  13. Risospendere il CD34- cellule in 25 : L di PBS per un'iniezione da utilizzare immediatamente nel trapianto o crioconservare le cellule ad una concentrazione di 1-2 milioni/mL nel mezzo di congelamento (Roswell Park Memorial Institute medium [RPMI 1640 medio] siero bovino (FBS) - 10% di zolfo dimetilo [DMSO]) per un ulteriore uso nel trapianto.
    NOT: Riconteggio sempre delle cellule vitali prima di utilizzarle nei trapianti.
  14. Per verificare la purezza del CD34 eluire, prendere 50 ll della sospensione e incubarla con 10 l di anti-umano anti-umano anti-uomo anti-uomo anticorpo per 30 min a 4 gradi centigradi. Dopo l'incubazione dell'anticorpo, lavare le cellule macchiate con PBS, ravvivarle in 100 gradi di PBS, quindi procedere all'esecuzione della citometria di flusso. Aggiungere un ulteriore tubo di cellule senza anticorpi per progettare il cancello nel citometro di flusso.
  15. Dopo l'acquisizione, analizzare i dati selezionando l'area di interesse in un grafico a dispersione in avanti (FSC) e a dispersione laterale (SSC), seguito dalla gatting per singole celle nei grafici ad area FSC e in altezza FSC. Cancello delle celle CD34-positive su singole celle nel canale PE e nella stampa dell'area SSC.

2. Preparazione degli epatociti umani per i trapianti

  1. Rimuovere gli epatociti crioconservati dall'azoto liquido, immergere rapidamente la fiala nel bagno d'acqua e scongelare per circa 90 - 120 s.
  2. Togliere il tappo della fiala e versare gli epatociti sconfusi nel tubo conico da 50 mL del mezzo di scongelamento riscaldato.
  3. Sospendere le celle dondolando a mano il tubo da 50 mL per alcuni secondi.
    NOT: Non vorticare il tubo.
  4. Pellet le cellule a 100 x g per 8 min a temperatura ambiente. Lavare le celle pellete in PBS con 0,1% BSA e metterle in comune con HSPC freschi o sconnati (rapporto 10:1) in PBS in un volume finale di 80 gradi centigradi.

3. Gestione degli animali, screening, genotipizzazione e trattamento per il trapianto di HSPC ed epatite umano

  1. Manipolazione degli animali
    1. Come risultato di una grave immunodeficienza, allevare, a casa e gestire topi TK-NOG in condizioni asettiche.
    2. Indossare sempre un cappotto da laboratorio, guanti, copriscarpe, e una maschera per prevenire l'infezione da microrganismi potenzialmente patogeni.
    3. Utilizzare guanti e strumenti sterili per la chirurgia e gestire gli animali in modo apricato durante l'intervento chirurgico.
  2. Selezione dei mouse TK-NOG per l'esperimento
    1. Mantenere la colonia di ceppi TK-NOG allevando topi TK-NOG femminili con cucciolate maschili non-TK-NOG e selezionare la prole transgenica mediante genotipizzazione.
      NOT: Eseguire la genotipizzazione (vedere il passaggio 3.3) per determinare la presenza o l'assenza del transgene nei topi maschi e femmine al momento dello svenare.
    2. Selezionare i maschi a 6 - 8 settimane di età per il trapianto a causa della loro elevata sensibilità all'esaurimento mediato da GCV di HSV-TK transgene-espressione epatociti21.
    3. Etichettatura dell'orecchio dei topi al momento dello svasamento o dell'intervento chirurgico per facilitare l'identificazione. Annotare il peso e lo stato di salute degli animali.
  3. Genotipizzazione per la presenza del transgene HSV-TK utilizzando la reazione quantitativa a catena di polimerasi in tempo reale
    1. Eseguire la genotipizzazione al momento dello svasamento (di solito a 3 - 4 settimane di età). Per la genotipizzazione, tagliare un pezzo dell'orecchio del topo in un mobile di sicurezza biologico a flusso laminare per mantenere la sterilità ed estrarre il DNA genomico utilizzando un kit di isolamento genomico del DNA.
    2. Amplifica il DNA genomico estratto dal primo elemento in una miscela di reazione da 20 litri allo schermo per il transgene HSV-TK sotto il controllo del promotore di albumina umana aggiungendo 1 -L di primer in avanti 5'-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3', 1 l di primoministro inverso 5'-TAAGTTGCAGGCGCGTC-3', 0.5L di Sonda FAM 5- FAM-AATCGCCCCCGCGCGCGC-MGB-3', e 10 -L di master mix su uno strumento di reazione a catena di polimerasi in tempo reale22.
    3. Impostare le impostazioni PCR in tempo reale come segue: 60 s per 30 s (fase prelettura), 95 C per 10 min (fase di attesa), 40 cicli di 95 s per 15 s e 60 C per 1 min (fase PCR) e 60 s per 30 s (fase post-lettura).
      NOT: Un ciclo di soglia (Ct) al di sotto di 22 è considerato positivo per il transgene HSV-TK.
  4. Trattamento con ganciclovir e treosulfan
    1. Utilizzando 27 G ago, iniettare i topi TK-NOG con iniezioni intraperitoneali di GCV (6 mg/kg) 2 volte al giorno al giorno 7 e al giorno 5 in 100 - L di salina prima dell'intervento chirurgico per esaurire le cellule parenchymal transgeniche dei topi (come mostrato nella strategia sperimentale in Figura 2)23 .
    2. Nei giorni 3, 2 e 1 prima dell'intervento, topi precondizionati con dosi intraperitoneali non mioeloablative di treosulfan (1,5 g/kg/giorno) in 100 gradi di salina, utilizzando un ago da 27 G.
    3. Un giorno prima dell'intervento, disegnare da due a tre gocce di sangue dalla vena submandibolare pungente con una lancetta da 5 mm, e isolare il siero centrifugando (1.500 x g per 10 min a 4 gradi centigradi) per il saggio di amtransferase alnina (ALT) per valutare il degr danno al fegato.
  5. Preparazione per l'intervento chirurgico
    1. Utilizzare i clipper per radere la pelliccia del topo che circonda il sito di incisione (a sinistra della parete peritoneale) prima dell'intervento chirurgico.
    2. Regolare il flusso di ossigeno a 1 L/min e il flusso di isoflurane al 3% - 5% in una camera di induzione utilizzando una macchina per anestesia del topo. Posizionare un topo alla volta nella camera di induzione per l'anestesia.
    3. Fissare l'estremità di un tubo di estensione sterile (con una capacità di tenuta di 550 l di sospensione; vedere la Tabella dei Materiali per le specifiche) a un ago da 30 G e l'altra estremità a una siringa da 1 mL.
    4. Riempire la siringa con la sospensione (80 litri/mouse) di HEP e HPC in pool (vedere la sezione 2), inserire la siringa nella tacca di una pipetta di erogazione ripetitiva e regolare l'erogatore per erogare 10 gradi in ogni stampa.
    5. Una volta che i topi sono anestesizzati (di solito dopo 3 - 4 min), passare il flusso di isoflurane al cono del naso e ridurre la portata dell'isoflurane al 2% - 3%.
  6. Trapianto intrasplenico di HSPC umani ed epatociti nei topi
    1. Eseguire tutte le fasi chirurgiche in un armadio a flusso laminare in condizioni sterili.
    2. Posizionare un drappo sterile pulito sulla superficie di lavoro e strofinare il lato sinistro del corpo di ogni topo con il 10 % di povidone-iodio seguito dal 70 % di alcool isopropile, prima di fare un'incisione.
    3. Fare una piccola incisione (1 - 1,5 cm di lunghezza e 5 mm di profondità) nella pelle, nel muscolo e nel peritoneo a sinistra della parete peritoneale con le forbici tipo di Vanna per entrare nella cavità peritoneale circa 5 mm sotto il bordo inferiore della gabbia toracica.
    4. Individuare la milza, tirarla leggermente con pinze all'area di funzionamento per un facile accesso e inserire l'ago da 30 G nel polo inferiore della milza.
    5. Sbloccare lo stantuffo della pipetta erogante e erogare 10 l di volume alla volta, con un limite di 60 - 80 l per milza. Ritrarre lentamente l'ago e ritagliare la milza con clip leganti utilizzando un appliere di legatura.
    6. Spingere la milza nella cavità del corpo con applicatori con punta di cotone bagnati con PBS sterile.
    7. Chiudere lo strato muscolare della parete addominale utilizzando un modello di sutura interrotta di sutura assorbibile (non continuo). Raggiungi la chiusura della pelle con un modello di sutura interrotto utilizzando suture non assorbibili.
    8. Utilizzare pastiglie circolari di acqua calda per proteggere i topi dall'ipotermia dopo l'intervento chirurgico.
    9. Rimuovere le suture non assorbibili 10-14 giorni dopo l'intervento chirurgico.
  7. Cura postoperatoria
    1. Quando l'animale trapiantato si sveglia, iniettare la buprenorfine analgesica (0,1 mg/kg) per via intraperitonele, 2 volte al giorno per 3 giorni consecutivi.
    2. Osservare gli animali almeno 1 volte al giorno fino al loro ritorno alle normali condizioni fisiche.
      NOT: Controllare il peso corporeo di ogni animale, dal momento che alcuni topi possono perdere peso dopo l'operazione chirurgica. I topi in genere riacquistano il loro peso originale in 1 o 2 settimane.

4. Innegazione Convalida del Fegato Umano da eLISA e il Sistema Immunitario Umano da Flusso Citometria

NOT: Valutare la ricostituzione del fegato umano e del sistema immunitario mensilmente, a partire da 1 mese di posttrapianto per saggio immunosorbent legato agli enzimi (ELISA) e citometria di flusso, rispettivamente.

  1. Raccogliere campioni di sangue dalla vena submandibolare utilizzando lancette in tubi EDTA, e centrifugare a 1.500 x g per 10 min a 4 gradi centigradi. Isolare il siero per controllare i livelli di albumina umana per valutare l'efficienza di innesto del fegato di topo per gli epatociti umani trapiantati, utilizzando un set di quantificazione ELISA album umano (vedi Tabella dei materiali) seguendo il gruppo di quantificazione del produttore Istruzioni.
    NOT: Non scartare il pellet e utilizzare le cellule pellettate per un'analisi della citometria a flusso per valutare la ricostituzione del sistema immunitario umano.
  2. Risospendere il pellet cellulare senza siero in 35 ll di tampone FACS (PBS - 2% FBS) e macchiato con 5 l di CD45 specifico del mouse (concentrazione 0,5 mg/mL), 5 anticorpi specifici per l'uomo CD45 (0,1 mg/mL), CD3 (0,2 mg/mL), CD8 (0,1 mg/mL) e CD19 (0,5 mg/mL) , e 20 gradi centigradi di CD4 (0,25 mg/mL) e CD14 (0,25 mg/mL) ciascuno per 30 min a 4 gradi centigradi, per controllare lo sviluppo di un sistema immunitario funzionale da CD34- HSPC.
    NOT: Considerare l'aggiunta di un tubo aggiuntivo di cellule non colorate per determinare l'gating delle cellule colorate.
  3. Dopo l'incubazione, trasferire la sospensione macchiata (100 dollari l) in un tubo di citometria a scarico in polistirolo rotondo e utilizzare 2 mL di 1x buffer di lisi (vedi tabella dei materiali) diluindo 1 parte del buffer di lisi 10x con 9 parti di acqua distillata e incubando 10 - 15 min per lasi globuli rossi.
    NOTA: Osservare la torbidità per valutare la lisi dei globuli rossi. Una volta che il campione diventa chiaro, la lisi è completa.
  4. Dopo la lisi, aggiungere 3 mL del tampone FACS nel tubo e centrifugare a 300 x g a 4 gradi centigradi per 5 min per ottenere un pellet. Ripetere il lavaggio aggiungendo 3 mL di tampone FACS al pellet e centrifugare a 300 x g a 4 gradi centigradi per 5 min.
  5. Fissare le cellule in appena fatto 1% paraformaldeide (PFA) e acquisire le cellule macchiate sul citometro di flusso, analizzato con il software di flusso.
  6. Per l'analisi, selezionare i linfociti gating su un grafico FSC/SSC, seguito da gating a cella singola sull'altezza FSC-area/FSC.
  7. Inoltre, porta per il CD45 (hCD45) specifico dell'uomo sulla popolazione unicellulare e includere CD45 (mCD45) specifico del mouse per l'esclusione di cellule di origine murina. Strategia di gating della popolazione macchiata basata sul gating di cellule incontaminate.
  8. Cancello hCD45- cellule per determinare la frequenza delle cellule CD3e T e CD19- B. Portare le celle T per determinare i sottoinsiemi di CD4 e CD8. Per valutare i monociti, passare su hCD45 per determinare CD14e monociti.

5. Infezione da HIV di topi TK-NOG e il suo effetto sul fegato umano e sul sistema immunitario

  1. Gestire il virus HIV-1 e tutti i topi infetti in una struttura designata di livello 2 di biosicurezza.
    ATTENZIONE: Autoclave e scartare tutti i rifiuti infettati da HIV in sacchetti a doppio rischio biologico. Per motivi di sicurezza, indossare guanti resistenti al taglio mentre si consegnano topi infettati dall'HIV.
  2. Indossare attrezzature di protezione personale (PPE), tra cui un abito coverall usa e getta, copriscarpe, una maschera per il viso, e doppi guanti in ogni momento durante la lavorazione con il virus.
  3. Selezionare i topi con una ricostituzione di oltre il 15% dellecellule CD45 umane (testate al punto 4.7) e con una presenza di albumina umana nel siero per l'infezione da HIV-1 (testata al punto 4.1).
  4. Iniettare i topi con 1 x 103 a 104 dosi infettive di coltura tissutale 50 (TCID50) HIV-1ADA in un volume di 100 - 200 L per topo, intraperitonealmente.
  5. Eutanasia i topi siergiati dall'HIV 5 settimane dopo l'infezione utilizzando l'isoflurane (con una concentrazione di vapore isoflurano di >5%).
  6. Dopo l'eutanasia dei topi, raccogli il sangue nei tubi EDTA mediante una foratura cardiaca per l'isolamento del siero, per vedere l'effetto dell'HIV-1 sul fegato valutando i livelli di albumina specifici dell'uomo da parte di ELISA (vedi passo 4.1) e le cellule del sangue per verificare la presenza di cambiamenti nel sistema immunitario umano cellule che utilizzano la citometria di flusso (vedere i passaggi da 4.2 - 4.8).
    NOT: Valutare il carico virale periferico 5 settimane di postinfezione su un bioanalizzatore per confermare se i topi sono infetti.
  7. Dopo aver estratto il sangue, ascise il fegato dai topi eutanasia.
  8. Per l'escissione epatica, esporre la cavità addominale facendo un'incisione di 1,5 - 2 cm di lunghezza e 0,5 cm di profondità nella pelle, nei muscoli e nel peritoneo, dallo xifoide. Fare un taglio perpendicolare alla colonna vertebrale tra il fegato e il diaframma. Sollevare il fegato e recidere eventuali membrane che lo attaccano allo stomaco e all'intestino.
  9. Raccogliere e fissare il fegato in 4% paraformaldeide durante la notte e seguire un protocollo immunohistochimico standard per valutare l'effetto dell'HIV su CK18- epatociti utilizzando anticorpo CK18 specifico dell'uomo8.

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Risultati

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La creazione di un modello murino duale umanizzato con fegato umano e cellule immunitarie può essere facilmente monitorato ad ogni passo con ELISA molto semplice e citometria di flusso, rispettivamente. La citometria di flusso viene eseguita regolarmente per valutare lo sviluppo di un sistema immunitario funzionale e per vedere l'effetto dell'infezione da HIV sulle cellule immunitarie. Nei topi dualizzati, lo sviluppo di cellule immunitarie funzionali può variare dal 15% al 90% della port...

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Discussione

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Il fegato è compromesso e danneggiato nei pazienti affetti da HIV24. Modelli sperimentali di piccoli animali per lo studio delle malattie epatiche umane in presenza di HIV-1 è estremamente limitata, nonostante la disponibilità di alcuni modelli animali cotrapiantati con CD34- HSPC ed epatociti7,12, 25. Negli esperimenti in vitro, gli epatociti hanno dimostrato di avere infezione da HIV-1 di ba...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione dell'Istituto Nazionale di Sanità R24OD018546 (a L.Y.P. e S.G.). Gli autori desiderano ringraziare Weizhe Li, Ph.D., per l'aiuto nelle procedure chirurgiche, Amanda Branch Woods, B.S., Yan Cheng per l'immunohistologia, UNMC flow cytometry ricercatori membri Direttore Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, B.S., e Samantha Wall, B.S., membri avanzati della struttura di microscopia UNMC Janice A. Taylor, B.S. e James R. Talaska, B.S., per il supporto tecnico. Gli autori riconoscono i dottori Mamoru Ito e Hiroshi Suemizu della CIEA per aver fornito topi TK-NOG e il dr. Joachim Baumgart per la fornitura di treosulfan. Gli autori ringraziano il Dr. Adrian Koesters, UNMC, per il suo contributo editoriale al manoscritto.

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Materiali


Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
27 aghi G1/2" BDbiosciences305109
aghi 30 G1/2"BD biosciences305106
5 mL di polistirene a fondo tondo 12 mm x 75 mm stileCorning352054
BD 1 mL Siringa di tubercolina senza agoBD biosciences309659
BD FACS array bioanalyzer BD Biosciences Per ilcontrollo della purezza delle cellule CD34+ eluite 
BD FACS software di arrayBD BiosciencesSoftware per l'analisi di cellule CD34+ acquisite su array FACS
Vacutainer Tubo di Plastica per la Raccolta del SangueBD biosciencesBD 367874Per raccogliere il sangue del cordone ombelicale
Siero Bovino Albumina Sigma-aldrichA9576
BuprenorfinaSostanza controllata e antidolorifico
CD14-PEBD Biosciences555398Specifico per l'uomo
CD19-BV605BD Biosciences562653Specifico per l'umano
CD34 MicroBead Kit, umanoMiltenyi Biotec130-046-702Per l'isoazione di    CD34+ HSPC
CD34-PE, umanoMiltenyi Biotec130-081-002Anticorpo utilizzato per il controllo della purezza delle cellule CD34+ eluite 
CD3-AF700BD Biosciences557943Specifico per l'uomo
CD45-PerCPCy5.5BD Biosciences564105Specifico per l'uomo
CD4-APCBD Biosciences555349Specifico per l'uomo
CD8-BV421BD Biosciences562428Specifico per l'uomo
Vetrini per il conteggio delle celluleBio-rad1450015
ChargeSwitch gDNA Mini Tissue KitThermofisherCS11204per l'estrazione del DNA genomico dall'auricolare
Cobas Amplicor system v1.5 BioanalizzatoreRoche Molecular Diagnostics
Applicatori con punta in cotone   McKesson24-106-2S
Citocheratina-18 (CK18)DAKOM7010Specifico per l'uomo
DMSO (Dimetil solfossido)Sigma-aldrichD2650-5X5ML
Set di estensione Microbore Slide Clamp(s) Maschio fisso Luer Lock. L: 60 pollici L: 152 cm PV: 0,55 mL Percorso del fluido SterileBD biosciences30914Attaccato al pippet di dispensazione e al carico con sospensione HSPC e HEP
FACS Diva versione 6Software del citometro a flusso BD Biosciences necessario per l'acquisizione del campione Siero
Software di analisi per citometria a flusso
GanciclovirAPP Pharmaceuticals, Inc.315110Farmaco di prescrizione
Greiner MiniCollect EDTA TubesGreiner bio-one450475
Terreno di scongelamento degli epatociti Laboratori di ricerca TriangleMCHT50
Horizon Open Ligating Clip ApplicatoriTeleflex537061Per tenere le clip di legatura
Hospira Acqua sterile per iniezioneACE surgical supply co. Inc.001-1187Per la diluizione di Buprenorfina (antidolorifico)
Set di quantificazione ELISA per albumina umanaBethyl laboratoriesE80-129Per la valutazione dei livelli di albumina umana nel siero di topo
Laboratori di ricerca sul triangolodegli epatociti umaniHUCP1  Epatociti umani crioconservati, qualificati per induzione 
Forbici per iris, TedPella, Inc.13295
LancettaMEDIpointVerga d'oro 5 mm
colonne LS Miltenyi Biotec130-042-401Utilizzato per intrappolare CD34+ microsfere (selezione positiva)
Terreno di separazione dei linfociti (LSM)MP Biomedicals50494Per l'isolamento di    linfociti dal sangue periferico
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303contiene il separatore Qudro MACS e le colonne LS
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring ScissorsRoboz Surgical Instrument Co.RS-5605Utilizzato per praticare un'incisione sulla pelle per esporre la milza
Micro Dissecting PinzeRoboz Surgical Instrument Co.RS-5157 per trattenere ed estrarre la milza dalla cavità peritoneale
topo CD45-FITCBD Biosciences553080
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato))SeparatoreQudro SH30256.02
QudroMiltenyi Biotec130-090-976contiene quattro colonne LS
RPMI 1640 mediumGibco11875093
StepOne Plus Real Time PCR Applied BiosystemsStrumento utilizzato per genotipo
Pipetta per dispensazione ripetitiva serie Stepper 1 mlDYMAX CORPT15469Utilizzato per erogare Suzione HSPC e HEP in modo controllato
Suturevet PGA sutura sintetica assorbenteHenry Schein Animal Health41178Sutura della pelle e del peritoneo
TaqMan Gene Expression Master MixThermofisher scientific4369016
TC20 contatore cellulare automatizzatoBio-rad1450102
topi TK-NOG Fornito dall'Istituto Centrale per gli Animali da Sperimentazione (CIEA, Giappone; Dott. Mamoru Ito e Hiroshi Suemizu)
TreosulfanMedac GmbHFornito da  Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) 
Trypan BlueBio-rad1450022
Micro forbici tipo Vannas, dritte, 80 mm LTed Pella, Inc.1346Utilizzato per praticare un'incisione sulla pelle per esporre la milza
Weck emoclip clip tradizionali in titanio Clip di legaturaEsuture523700Per legare la milza dopo l'iniezione
BD FACS soluzione di lisi BD Biosciences 349202 Per lisare i globuli rossi BD LSR II BD Biosciences Strumento per l'acquisizione di campioni di citometria a flusso BD  scientifico per misurare la carica virale fetale bovino (FBS)Gibco 10438026 software di analisi FLOWJO v10.2 FLOWJO,LLC specifico per topo MACS

Riferimenti

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