Saggio di microfluidic per la valutazione di adesione del leucocita alle cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC-ECs)

L'infiammazione svolge un ruolo fondamentale in molte patologie, tra cui cardiovascolari e patologie neurodegenerative, sepsi e risposte avverse al farmaco (ADR). Le cellule endoteliali (ECs) svolgono un ruolo essenziale nella regolazione della risposta infiammatoria attraverso l'induzione di pro-adesivo recettori, quali E-selectina, intercellulare di adesione molecule-1 (ICAM-1) e vascolare delle cellule adesione molecule-1 (VCAM-1) sulla loro superficie ^{1 , 2}. ECs microvascolare in tessuti differenti sono noti per presentano eterogeneità nelle risposte infiammatorie^3,4. Inoltre, il background genetico o certe condizioni genetiche potrebbero comportare le differenze nelle risposte infiammatorie tra individui; Pertanto è importante avere accesso a ECs da individui diversi. Più recentemente, umane pluripotenti indotte cellule staminali (hiPSCs)⁵, che possono essere derivate da praticamente qualsiasi individuo, sono stati indicati per servire come una fonte affidabile e rinnovabile di ECs^{6,7,8, 9}. Pertanto, la valutazione delle risposte infiammatorie e reclutamento leucocitario in hiPSC-ECs è preziosa, non solo per la modellazione di alcune malattie genetiche, ma anche a fornire indicazioni della variabilità inter-individuale e da utilizzare come uno strumento per in futuro la medicina personalizzata.

Analisi di flusso forniscono uno strumento utile per studiare l'interazione leucocita-endoteliali. Advances in dispositivi microfluidici consente la riproduzione di condizioni di flusso del fluido fisiologico con un controllo preciso dei livelli di sollecitazione di taglio specifiche del letto vascolare. Live imaging consente il monitoraggio della cascata di eventi di acquisizione del leucocita, rotolamento, strisciando, adesione e trasmigrazione. Sono stati sviluppati diversi saggi di flusso per studiare l'interazione leucocita-endoteliali, tuttavia, utilizzano primaria ECs^10,11,12,13. Qui, descriviamo in dettaglio il test per la valutazione di adesione del leucocita umano hiPSC-ECS sotto flusso fisiologico. In questa procedura, si descrivono condizioni ottimizzate di stimolazione hiPSC-CE con stimoli pro-infiammatori, come il fattore di necrosi tumorale alfa (TNFα), dissociazione, semina in un chip microfluidico con otto canali paralleli. Descriviamo un protocollo passo-passo per la perfusione di hiPSC-ECs con la sospensione di leucociti fluorescente contrassegnati nel chip microfluidici, cella immagini dal vivo e automatizzato di conteggio dei leucociti aderenti.

Questo protocollo è utile per la valutazione delle risposte infiammatorie in hiPSC-ECs in screening di stupefacenti, modellazione di malattia e medicina rigenerativa personalizzata.

1. preparazione di soluzioni e reagenti

1. Preparare completo supporto di Human Endothelial-SFM (CE-SFM pieno) con l'aggiunta di siero plasma-derivato della piastrina-poveri (1%), fattore di crescita di base del fibroblasto (bFGF, 20 ng/mL) e fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF, 50 ng/mL) a Human Endothelial-SFM (Vedi tabella di Materiali). Filtrare il mezzo attraverso un filtro da 0,22 µm a poro e conservarla a 4 ° C fino a 2 settimane.
2. Preparare il terreno RPMI completo con l'aggiunta di siero bovino fetale (10%), 2-mercaptoetanolo (0,05 nM), L-Glutammina (1%), penicillina-streptomicina (25 U/mL) per medium RPMI (Vedi Tabella materiali). Conservare a 4 ° C fino a 3 settimane.

2. rivestimento di Microfluidic chip

1. Inserire un biochip sterile in una capsula di Petri sterile 10cm.
2. Preparare soluzione di lavoro di fibronectina mediante ricostituzione la soluzione di riserva in tampone fosfato salino (PBS) senza Ca^{2 +}/Mg^{2 +} a una concentrazione finale di 50 µ g/mL. Stima 80 µ l di soluzione di lavoro per biochip.
3. Iniettare 10 µ l di soluzione di lavoro di fibronectina in ciascun canale del biochip. Utilizzare una pipetta con piccole punte di 10 µ l e assicurarsi che formare un contatto stretto tra l'imbocco del canale e la punta della pipetta (Figura 1, sinistra).
4. Chiudere il coperchio del piatto Petri contenente il biochip e posizionarlo in una camera umidificata (Figura 2B). Conservare la camera a 4 ° C durante la notte. Umidificare la camera, mettere una velina pulita nella parte inferiore della camera umidificata e aggiungere 5 mL di sterile H₂O.
5. Giorno successivo, prima del saggio, pre-riscaldare il biochip a 37 ° C nell'incubatore.

3. preparazione del hiPSC-ECs

Nota: Nel protocollo descritto qui, hiPSC-ECs erano differenziati, purificata, crioconservati e scongelato come descritto in precedenza⁸.

1. Disgelo e piastra hiPSC-ECs in completa CE-SFM pieno in uno 0,1% rivestite con gelatina T75 matraccio, tre o quattro giorni prima del dosaggio.
2. La notte prima del dosaggio, stimolare hiPSC-ECs con TNFα aggiungendo CE-SFM pieno addizionata di 10 ng/mL TNFα e incubare pernottamento (~ 12 h) a 37 ° C, come descritto in precedenza ⁷.

4. hiPSC-ECs dissociazione e il Seeding in Chip microfluidico

1. Il giorno del test, è necessario prendere la fiaschetta di hiPSC-ECs dall'incubatrice ed esaminare le cellule sotto il microscopio. Assicurarsi che hiPSC-ECs sono 80 – 100% confluenti e hanno una morfologia tipica di CE-come.
2. Trasferire il pallone nel cofano cultura cellulare.
3. Aspirare il mezzo dal pallone di hiPSC-ECs.
4. Lavare brevemente la coltura delle cellule con l'aggiunta di 10 mL di PBS senza Ca^{2 +}/Mg^{2 +}. Aspirare il PBS.
5. Aggiungere 4 mL per fiaschetta di enzima di dissociazione di 1x. Incubare per 5 min a temperatura ambiente (TA) (Figura 1B).
6. Fermare la reazione di dissociazione aggiungendo 8 mL di terreno di Human Endothelial-SFM per fiaschetta. Delicatamente staccare e raccogliere la hiPSC-ECs in sospensione in una provetta conica da 15 mL utilizzando una pipetta da 5 mL.
7. Contare il numero totale delle cellule in sospensione.
8. Centrifugare le cellule a 300 x g per 3 minuti a TA.
9. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in CE-SFM pieno a una concentrazione finale di 1.5 x 10⁷ cellule/mL.
10. Togliere la capsula di Petri con il biochip dall'incubatrice e trasferirlo alla cappa di cultura cellulare.
11. Aspirare la soluzione di fibronectina da tutti i canali del chip microfluidici.
12. Iniettare 6 µ l di sospensione cellulare in ogni canale utilizzando una pipetta con una punta piccola e 10 µ l (Figura 1, medio). Assicurarsi che la sospensione cellulare viene mescolata bene prima dell'iniezione ed evitare la precipitazione di cella.
13. Esaminare il biochip sotto il microscopio e assicurarsi che le celle sono distribuite uniformemente, e la densità cellulare è alta (Figura 2).
14. Incubare il biochip per 15 min a 37 ° C.
15. Aggiungere 40 µ l di CE-SFM pieno nei serbatoi medi da entrambi i lati di ogni canale.
16. Incubare il biochip per 1h a 37 ° C (Figura 1, destra).
17. Aggiungere un altro 50 µ l di CE-SFM pieno nei serbatoi da entrambi i lati di ogni canale.

5. preparazione dei leucociti umani

Nota: Nel protocollo descritto qui, una linea cellulare monocytic commercialmente disponibile (THP-1) è stata utilizzata. In alternativa, possono essere utilizzati cellule mononucleari del sangue periferico o neutrofili. Isolamento dei monociti del sangue periferico e dei neutrofili può essere eseguita utilizzando la procedura standard¹¹. Eseguire tutti i passaggi descritti in questo paragrafo in una cappa di cultura cellulare.

1. Raccogliere i leucociti in una provetta conica da 50 mL.
2. Lavare i leucociti con 10 mL di PBS senza Ca^{2 +}/Mg^{2 +}. Centrifugare le cellule a 300 x g per 3 min a RT (Figura 1).
3. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PBS con tintura DiOC6 (λ_ex = 485 nm, λ_em = 501 nm) (1:5, 000). Incubare le cellule al buio per 10 minuti a TA.
4. Lavare i leucociti con 10 mL di PBS senza Ca^{2 +}/Mg^{2 +}. Centrifugare le cellule a 300 x g per 3 min a RT. Ripetere la fase di lavaggio ancora una volta.
5. Contare il numero totale delle cellule in sospensione.
6. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in terreno RPMI completo a una concentrazione finale di 2,5 x 10⁶ cellule/mL.

6. preparazione della pompa microfluidica

1. Montare la pompa di microfluidica con il collettore di 8 canali.
2. Collegare la pompa ad un PC con il software di gestione installato.
3. Avviare il software di microfluidica e caricare il protocollo cliccando Open Protocol e navigare sul PC per selezionare il protocollo di microfluidica.
4. Collegare la pompa e il software selezionando la cartella di installazione e facendo clic su Esegui analisi passo.
5. Per definire la geometria dei canali per il controllo della corretta portata: selezionare la Geometria di aggiornamento nella cartella di Installazione di geometria e fare clic su Esegui analisi passo.
   Nota: Assicurarsi che i dettagli di geometria corrispondano la siringa e canali da utilizzare (geometria ID = 1, numero di canali = 8, larghezza del canale = 800.0 µm, profondità del canale = 120.0 µm, volume della siringa = 250 µ l) e la viscosità del campione (viscosità del liquido = 1.0).
6. Lavare la pompa inserendo il cavo di ingresso (arancione) nella provetta conica 50 mL contenente etanolo di 80%. Posizionare il cavo di uscita (verde) nel tubo vuoto conica 50 mL (contenitore per rifiuti).
7. Selezionare la cartella di Washout di Washout/pompa e fare clic su Esegui analisi passo (lavare volume = 2000 µ l, passaggio di volume di lavaggio = 250 µ l, direzione di Washout = Output). Ripetere ancora una volta la fase di lavaggio.
8. Ripetere la pompa lavaggio passaggi (6.6-6.7) con acqua di grado di coltura delle cellule e terreno di coltura umana Endothelial-SFM.
9. Continuare con la fase di lavaggio del collettore.
10. Aprire manualmente la valvola tra la siringa e il collettore inserendo l'adattatore 3VIE nella posizione corretta (indicatore OFF è girata a sinistra).
11. Selezionare Set Current Channel/Apri passo nella cartella Colori attenuati con collettore Wash e fare clic su Esegui analisi passo per aprire tutte le valvole del gruppo manometrico.
12. Lavare il collettore manualmente premendo 5 mL di etanolo 80% dalla siringa, seguita da 5 mL di acqua di grado di cultura cellulare.
13. Lavare il collettore premendo 5 mL di terreno di coltura umana Endothelial-SFM dalla siringa.
14. Rimuovere tutte le bolle di aria di grandi dimensioni che sono intrappolate nel collettore. Per effettuare questa operazione, inserire l'adattatore di pin di 8 pozzetti i 10 cm di Petri con il mezzo ed eseguire spingere/tirare con la siringa fino a quando tutte le bolle d'aria grandi sono andate (piccole bolle non sono un problema).
15. Selezionare Set Current Channel/chiusura passaggio nella cartella Colori attenuati con collettore Wash e fare clic su Esegui analisi passo per chiudere tutte le valvole del gruppo manometrico.
16. Collegare il cavo di uscita verde dalla pompa alla scheda di collettore.
17. La valvola a 3 vie tornare sulla posizione OFF per chiudere la siringa.
18. Selezionare cartella di Washout di Washout (via cavo) e fare clic su Eseguire analisi passo per lavare ogni porta con medium RPMI individualmente, assicurando che tutte le bolle vengono rimossi da ogni cavo (erogazione volume = 100 µ l).
    Nota: Ogni valvola del collettore è aperto uno-ad-uno, mentre gli altri canali chiusi, 1 a 8 e 100 μL del mezzo viene erogata attraverso ogni singolo canale. Assicurarsi che il liquido viene eseguito da ogni pin. Se non c'è nessun liquido che esce, è un'indicazione di una bolla d'aria o uno zoccolo.

7. preparazione del Chip microfluidici per Live Imaging

1. Assicurarsi che le configurazioni di microfluidica sono pronte e la camera dal vivo di formazione immagine è pre-equilibrata a 37 ° C e il livello di CO₂ raggiunge il 5% (Figura 3A, B).
2. Prendere il biochip dall'incubatrice e posizionarlo sul supporto di chip di microscopio. Montare il supporto di chip sul microscopio imaging fase (Figura 3).
3. Al fine di collegare il biochip alla pompa tramite il collettore, posizionare l'adattatore 8 pin vicino i bacini di uscita del chip e approfondire tutti i perni nel medium (ma non collegare completamente).
4. Selezionare l'interruzione di | Connettersi a Chip cartella e fare clic su Esegui analisi passo per erogare medium RPMI prima di collegare il chip (erogazione volume = 30 mL). Una volta che il mezzo viene erogato, inserire l'adattatore 8 pin nella presa del biochip.
   Nota: Durante questo passaggio, tutti i canali sono impostati su (Apri) e 30 µ l del mezzo viene erogata attraverso ogni canale e a seguire i canali sono impostati su Off (chiuso). Questo garantisce che nessun aria bolle saranno introdotti nei canali del chip microfluidici.
5. Manualmente e aspirare il mezzo da tutti i serbatoi di ingresso del biochip con una pipetta.
6. Selezionare l'interruzione di | Washout di chip cartella e fare clic su Esegui analisi passo per irrorare 40 mL di mezzo di CE-SFM pieno attraverso ognuno dei canali-uno per sbarazzarsi dei morti cellule/detriti dal canale (volume di Washout = 40 µ l, taglio di washout di massimo = 40 dynes/cm²).

8. flusso di analisi di adesione e acquisizione immagini

1. Manualmente e aspirare il mezzo dal bacino dell'ingresso del canale di interesse con una pipetta.
2. Aggiungere 100 µ l di leucociti da passo 5.6 al serbatoio di ingresso del canale di interesse.
   Nota: Mescolare delicatamente le cellule per fare una sospensione unicellulare.
3. Nell'analisi della cella | Passaggio Descrizione cartella, selezionare Descrizione Set Current Channel/passo e, nell'elenco dei canali, selezionare solo il canale corrente di interesse e impostato su On (aperta) e impostare tutti gli altri sette canali Off (chiuso).
4. Selezionare l'analisi delle cellule di | Passaggio Descrizione cartella e fare clic su Esegui analisi passo.
   Nota: Assicurarsi che l'Erogazione di tasso di flusso variabile applicata costante pressione negativa per tirare la sospensione del leucocita del serbatoio di aspirazione attraverso il canale per 5 min (insieme di taglio = costante, Shear stress =-0,50 dyne/cm², durata = 00:05:00, Ritardo Scan = 00:00:00). Il valore negativo di sollecitazione di taglio garantisce la corretta direzione del flusso.
5. Aspirare i leucociti rimanenti dal bacino dell'ingresso.
6. Aggiungere 100 µ l di terreno RPMI completo il serbatoio di aspirazione. Selezionare cella analisi/passo Descrizione cartella e fare clic su Eseguire analisi passo per irrorare il canale per 5 min con medium RPMI al fine di lavare tutti i leucociti non aderenti (insieme di taglio = costante, Shear stress =-0,50 dyne/cm², durata = 00:05 00, ritardo di scansione = 00:00:00).
7. Acquisire immagini da almeno tre o quattro diverse posizioni del canale all'immagine i leucociti aderiti (per assicurare che sono acquisite in aree rappresentative).
8. Ripetere i passaggi da 8.1 – 8,7 per la valutazione funzionale di tutto il resto dei canali.
   Nota: È possibile eseguire contemporaneamente più canali. A tale scopo, aprire tutti i canali di interesse durante il passaggio 8.3. ed eseguire tutti i suddetti passaggi 8.4 –8.7 per più canali di interesse.

9. completare il test e pulizia della pompa di microfluidica

1. Dopo aver completato l'esperimento, esportare e salvare tutte le immagini in formato RAW.
2. Risparmiando i risultati, eseguire la pompa di microfluidica e il collettore di protocollo di pulizia.
3. Per la pompa di microfluidica, eseguire prima la cartella di Washout/pompa Washout irrorando 4 mL di acqua di grado di cultura cellulare, seguita da 4 mL di 80% etanolo come descritto nei passaggi 6.6 – 6.7 a secco la pompa facendo girare l'aria per alcuni minuti.
4. Al fine di pulire il collettore, è necessario eseguire il passaggio di Washout/collettore Wash con la siringa. La procedura per aprire la siringa e le valvole del collettore come descritto nella procedura 6.10 – 6,11 lavata prima con 80% di etanolo e successivo con acqua di grado di cultura cellulare. Asciugare il collettore spingendo l'aria tramite la siringa. Chiudere la valvola di siringa e le valvole del collettore come descritto nella procedura 6.10 e 6.15.

10. conteggio dei leucociti aderenti

1. Scaricare e installare software¹⁴ dal http://cellprofiler.org di elaborazione delle immagini.
   Nota: Immagine di elaborazione in questo studio è stato effettuato utilizzando il software versione 2.1.1. Se si utilizza una versione più recente, la pipeline potrebbe richiedere minor adattamento.
2. Scarica la pipeline Count_leukocytes.cpipe. Fare clic su File | Importazione | Pipeline di dal file e navigare sul PC per scegliere la pipeline Count_leukocytes.cpipe.
3. Drag-and-drop una cartella con immagini RAW acquisite dei leucociti aderenti alla finestra elenco File nei moduli Input | Immagini sezione per l'analisi.
4. Specificare le dimensioni tipiche dei leucociti via analisi moduli | IdentifyPrimaryObjects. Specificare il diametro minimo e massimo dei leucociti aderenti in pixel.
5. Selezionare i criteri di filtro tramite moduli analisi | FilterObjects. Specificare l'area come minimo accettato di oggetti in pixel.
6. Avviare l'analisi premendo sul pulsante Analyze images .
   Nota: Tutte le immagini RAW saranno trasformate, e i risultati verranno salvati in una cartella di destinazione predefinita. Il file di output Image.txt contiene i numeri dei leucociti aderenti in ogni immagine elaborata (ogni numero corrisponde ad una sola immagine, cioè, ogni campo di vista acquistata).

In primo luogo, la risposta di hiPSC-ECs alla stimolazione con agente pro-infiammatorio TNFα dovrebbero essere esaminati, come descritto in precedenza7. Trattamento di TNFα per 12 h innesca il upregulation di E-selectin con il picco a 6 h dopo l'inizio del trattamento. Inoltre, ICAM-1 è upregulated 6-12 h post-trattamento. Anche se non abbiamo osservato il upregulation previsto di VCAM-1, si osserva tipicamente in cellule endoteliali di vena ombelicale umana primaria (HUVECs). Abbiamo trovato il trattamento di TNFα (12 h) durante la notte per essere la più conveniente per l'analisi di adesione del leucocita.

Dissociazione hiPSC-ECs ottimale dovrebbe comportare una sospensione unicellulare gratuita dei cespi di cella. Figura 2 illustra la densità ottimale hiPSC-CE subito dopo l'iniezione. In genere, 15 minuti dopo l'iniezione, hiPSC-ECs fissare alla parte inferiore del canale e iniziare a diffondere (Figura 2D). 1 h dopo l'iniezione, hiPSC-ECs formano un monostrato ben diffuso lungo il canale e sarà pronto per iniziare l'analisi di flusso (Figura 2E).

Etichettatura dei leucociti con tracciante fluorescente è vantaggioso per fase immagini di contrasto in automatizzato quantificazione di immagine, in quanto facilita il passaggio di identificazione delle cellule, soprattutto perché i leucociti rispettano il monostrato di cellule endoteliali e spesso è difficile per software di distinguere diversi tipi di cellule.

Gratis software di elaborazione di immagini open source sono molto utile per la quantificazione automatizzata dei leucociti aderenti. La pipeline descritta nel protocollo qui è basata sull'identificazione di oggetto primario utilizzando Sogliatura adattiva delle immagini fluorescenti dei leucociti (Figura 4A). Filtraggio di oggetti basati su un'area minima inoltre identificati Filtra oggetti falsamente identificati, come detriti cellulari, autofluorescenza o qualsiasi altro non-specifico segnale fluorescente (Figura 4 C, D).

Un chip microfluidico con otto canali paralleli permette il confronto di due gruppi indipendenti, per esempio, ECs differenziati da hiPSCs indipendente, come donatori sani o pazienti con i disordini genetici. Ulteriori controlli, ad esempio ECs non trattata o pre-trattamento con un anticorpo blocco di ICAM-1 possono essere inclusi come ben10,11. Due o tre chip microfluidici possono essere elaborati in un momento. Per la robustezza delle conclusioni, si consiglia un minimo di tre esperimenti biologici indipendenti eseguite su giorni indipendente.

Figura 1 : Preparazione di hiPSC-ECs e leucociti per il dosaggio di flusso. (A) pre-trattamento di hiPSC-ECs con lo stimolo pro-infiammatorio (TNFα). (B) rappresentazione schematica della dissociazione enzimatica hiPSC-ECs, centrifugazione e risospensione. (C) rappresentazione schematica di rivestimento dei canali (C, a sinistra), iniezione della sospensione hiPSC-CE (C, medio) e aggiunta di terreno di coltura dopo hiPSC-ECs allegato nel chip microfluidici di cella. (D) rappresentazione schematica della fase di lavaggio del leucocita, etichettatura con colorante fluorescente DiOC6 e risospensione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Chip microfluidico con hiPSC-ECs. (A) Microfluidic chip un 10cm di Petri. (B) la camera umidificata utilizzata per l'incubazione. (C, D, E) Immagini rappresentative di hiPSC-ECs nella microfluidica canale 0 min (C), 15 min (D), 1 h (E) dopo l'iniezione. Barra della scala = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Messa a punto sperimentale del dosaggio live cell imaging e del leucocita aspersione. (A, B) Foto (A) e schematica rappresentazione (B) dell'apparato sperimentale del dosaggio live cell imaging e flusso: pompa di microfluidica - microscopio fluorescente invertito con montato dal vivo imaging camera (5% CO2, 37 ° C, umidificare), (2) - (1), (3) - 8 canali collettore, (4) - PC per l'acquisizione di controllo e immagine di microscopio, (5) - PC per controllo pompa microfluidica. (C) Microfluidic chip con il tubo inserito del collettore 8 canali fissi in un portatarga e montato nella fase motorizzata del microscopio. (D) rappresentazione schematica delle fasi principali dell'analisi di flusso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : Analisi dell'immagine e il rilevamento automatico dei leucociti aderenti. (A) la finestra di dialogo del software con le impostazioni specificate per l'identificazione dei leucociti di elaborazione delle immagini. (B), la finestra di dialogo del software di elaborazione immagine con i filtri specificati criteri di oggetti identificati sulla base minimamente accettano superficie (SAmin = 70 px). (C) esempio di corretta identificazione dei leucociti e filtraggio di oggetti non specifici della piccola superficie (SA) (diametro tipico pixel (Min, Max) = (9, 15); Filtraggio criteri SAmin = 70 px). Oggetti accettati sono raffigurati in verde e oggetti di scarto sono raffigurati in viola. (D) esempio di errata identificazione dei leucociti a causa della non corretta gamma di diametro tipico (diametro tipico pixel (Min, Max) = (3, 15); Filtraggio criteri SAmin = 70 px). Oggetti accettati sono raffigurati in verde e oggetti di scarto sono raffigurati in viola. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.