Questo articolo descrive i protocolli per valutare l'effetto di proteine fluorescenti sull'aggregazione e la tossicità di polyglutamine misfolded espansione per la valutazione rapida di una proteina fluorescente appena atipico nel contesto del reporter fluorescenti.
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Articolo metodologico
Effetto di proteine fluorescenti su Fusion partner utilizzando saggi di tossicità di Polyglutamine in lievito
In questo articolo
Sommario
Abstract
Per l'indagine di localizzazione della proteina e il traffico usando la formazione immagine di cellule vive, i ricercatori spesso si affidano loro proteina di interesse ad un reporter fluorescente di fusione. L'elenco in continua evoluzione delle proteine fluorescenti geneticamente codificate (FPs) presenta agli utenti con diverse alternative quando si tratta di design fusion fluorescente. Ogni FP ha specifiche proprietà ottiche e biofisiche che possono influenzare le proprietà biochimiche, cellulari e funzionali delle fusioni fluorescente risultante. Per esempio, parecchi FPs tendono a formare oligomeri non specifici che sono suscettibili di ostacolare la funzione del partner di fusione. Purtroppo, solo pochi metodi esistono per testare l'impatto di FPs sul comportamento del reporter fluorescente. Qui, descriviamo un metodo semplice che permette la rapida valutazione dell'impatto della FPs utilizzando poliglutammina (polyQ) saggi di tossicità nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Proteine di huntingtin PolyQ espanso sono associati con l'insorgenza della malattia di Huntington (HD), dove l'huntingtina espanso vengono aggregati in oligomeri tossici e corpi di inclusione. L'aggregazione e la tossicità di poliQ espansioni in lievito sono altamente dipendente sulle sequenze fiancheggianti la regione di poliQ, compresa la presenza di tag fluorescente, fornendo così una piattaforma sperimentale ideale per studiare l'impatto di FPs sul comportamento dei loro partner di fusione.
Introduzione
Poiché la caratterizzazione iniziale della proteina fluorescente verde (GFP) da Aequorea victoria1, un'ampia tavolozza di FPs codificato geneticamente sono stati sviluppati, permettendo i biologi delle cellule localizzare e monitorare contemporaneamente più eventi/proteine cellulari in vita cellule2,3. FPs sono derivati da organismi multipli, da meduse di corallo e pertanto, visualizzazione specifiche proprietà biofisiche che deviare ampiamente di là di loro rispettivo spettro fluorescente. Queste proprietà includono luminosità, fotostabilità e una tendenza a oligomerizzazione ....
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Protocollo
1. generazione di nuovo fluorescente Tagged Httex1 reporter per un'espressione in lievito
Nota: Questa sezione è stata modificata dal protocollo di Jiang et al. 16 e Albakri et al. 19.
- Disegnare primers per amplificare la sequenza che codifica la proteina fluorescente o interesse mediante PCR. Il primer forward dovrebbe includere una sequenza leader per assistere l'enzima di restrizione durante la digestione (GATC), seguita da un sito di restrizione SpeI (ACTAGT) e 20 basi a valle dell'ATG (escluse ATG) del gene della proteina fluorescente di interesse. I....
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Risultati
FPs hanno differenti proprietà biofisiche, compresa la loro tendenza a oligomerizzazione, che possono influenzare il comportamento dei loro partner di fusione nel contesto del reporter fluorescenti. Questo protocollo descrive un metodo semplice dove più FPs possono essere fusi per espansioni polyQ tossici. Poiché polyQ tossicità dipende fortemente le sequenze fiancheggianti il tratto poliQ15, questo dosaggio permette un confronto rapido e diretto dei reporter di fu.......
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Discussione
In questo articolo, vari metodi per misurare l'aggregazione di Httex1 polyQ espansioni e loro effetto sulla crescita del lievito sono stati impiegati come un modello per studiare come i diversi fluorescente proteine alterano i loro soci di fusione nel contesto del reporter fluorescenti . Usando una variante GFP (ymsfGFP) come controllo positivo, abbiamo mostrato che questo rileva cambiamenti significativi nella tossicità di poliQ e aggregazione tra i diversi tag fluorescente e consente un confronto diretto e r.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è supportato da una sovvenzione di funzionamento da istituti canadesi per ricerca di salute M.L.D e P.L. Il lavoro qui presentato è supportato da un John R. Evans Leader Fund award della Fondazione canadese per l'innovazione e un corrispondente fondo del fondo di ricerca di Ontario per P.L. Y.J. è supportato da un master alla borsa di studio di dottorato trasferimento dal preside della scuola Schulich di M edicine e odontoiatria presso l'Università del Western Ontario. S è supportato da una borsa di studio di dottorato di ricerca in Canada ALS.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 5-alfa Competente E. coli (Alta efficienza) | New Englanfd Biolab | C2987 | |
| SpeI-HF | New Englanfd Biolab | R3133 | Gli enzimi ad alta fedeltà sono preferiti |
| SalI-HF | New Englanfd Biolab | R0138 | Gli enzimi ad alta fedeltà sono preferiti |
| Agarosio | Fisher Scientific | BP160 | |
| LB-Agar | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB-Brodo | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Ampicilina | Fisher Scientific | BP1760 | |
| PfuDNA polimerasi ad altissima fedeltà | Tecnologie Agilent 600382 | ||
| Spettrofotometro per micropiastre EPOCH2 | BioTek Instruments inc | EPOCH2TC | |
| Replicatore di perni di lievito | V& P Scientific inc. | ||
| SPI imager | S& P Robotica inc. | spImager-M | |
| Zeiss LSM 800 confocale con AryScan | Carl Zeiss Microscopy | LSM 800 | |
| camere di imaging Lab-Tek a 8 pozzetti Fisher | Scientific | 12565470 | |
| apparato Bio-Dot | Bio-Rad | 1706545 | |
| Chemi Doc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| anticorpo anti-FLAG M1 | Sigma-Aldrich | F3040 | |
| Capra anti-topo IgG alexa 555 anticorpo secondario | Thermo | A32727 | |
| Kit MiniPrep per plasmidi | Fisher Scientific | Kit | |
| l'estrazione del gel plasmidico | Fisher Scientific | K0831 | |
| Kit per purificazione PCR | Fisher Scientific | K0702 | |
| Prizm | GraphPad | N/A | |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Fisher Scientific | BP13354 |
Riferimenti
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
- Shcherbak....
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Ristampe e permessi
