Articolo metodologico

Espansione del due-dimensione elettrofilate nanofibre in tre dimensioni ponteggi

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DOI:

10.3791/58918

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7 gennaio 2019

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1Department of Surgery-Transplant and Mary & Dick Holland Regenerative Medicine Program, University of Nebraska Medical Center

In questo articolo

Sommario

In questo articolo viene illustrata la tecnica di espansione una stuoia di nanofibra tradizionale, due dimensioni (2D) elettrofilate in un'impalcatura di tre dimensioni (3D) attraverso la depressurizzazione del sottocritico CO2 fluido. Queste impalcature aumentate 3D, strettamente mimica cellulare nanotopographic spunti e preservare le funzioni delle molecole biologiche incapsulati all'interno delle nanofibre.

Abstract

Elettrofilatura è stata la tecnologia preferita nella produzione di uno scaffold sintetico, funzionale dovuto la biomimetica alla matrice extracellulare e il controllo di facilità di composizione, struttura e diametro delle fibre. Tuttavia, nonostante questi vantaggi, nanofibre elettrofilate tradizionali ponteggi vengono con limitazioni tra cui disorganizzato nanofibra orientamento, bassa porosità, la dimensione dei pori piccoli e tappetini principalmente bidimensionale. Come tale, c'è un grande bisogno per lo sviluppo di un nuovo processo per la realizzazione di ponteggi di nanofibre elettrofilate capaci di superare le limitazioni di cui sopra. Nel presente documento, è descritto un metodo semplice e romanzo. Una stuoia di nanofibra 2D tradizionale si trasforma in un'impalcatura 3D con spessore desiderato, distanza del gioco, porosità e le indicazioni di nanotopographic per consentire per la semina delle cellule e proliferazione attraverso la depressurizzazione del sottocritico CO2 fluido. Oltre a fornire un scaffold per la rigenerazione del tessuto si verifica, questo metodo fornisce anche la possibilità di incapsulare le molecole bioattive come i peptidi antimicrobici per la consegna di droga locale. I ponteggi di nanofibra di CO2 espanso tengono grandi potenzialità nella rigenerazione dei tessuti, la guarigione della ferita, modellazione 3D del tessuto e somministrazione di farmaci topici.

Introduzione

Il concetto di sviluppare un'impalcatura sintetica che possa essere impiantata nei pazienti per aiutare nella rigenerazione e riparazione tissutale è uno che ha permeato il campo della medicina rigenerativa per decenni. Lo scaffold sintetico ideale serve per indurre la migrazione delle cellule dal tessuto sano circostante, fornisce un'architettura per vascolarizzazione di supporti di semina, adesione, segnalazione, proliferazione e differenziazione, cella, consente un'adeguata ossigenazione e consegna di nutrizione e promuove l'attività immunitaria ospite per garantire il successo dopo l'impianto1. Inoltre, può essere utilizzato come vettore per l'incorporamento di molecole antimicrobiche per assistere nella cicatrizzazione1,3,6,7,8,9. La capacità di controllare il rilascio temporale di queste molecole biologiche da scaffold sintetico è un altro attributo desiderabile che è considerato quando ingegneria ponteggi1.

Elettrofilatura è stata una tecnica ben utilizzata per la produzione di nanofibra ponteggi1,2,3,4,5,6. Precedenti tentativi di creare un'impalcatura di nanofibra come quello discusso qui sono state fatte a vari gradi di successo. Tuttavia, ponteggi tradizionali nanofibra hanno limitato le capacità di realizzare questi obiettivi. Nanofibra tradizionali ponteggi sono stati principalmente bidimensionale stuoie1,3. Queste impalcature nonexpanded sono densamente imballate con pori di piccole dimensioni; Questo limita l'infiltrazione delle cellule, migrazione e differenziazione come non promuove un ambiente abbastanza simile a quelli trovati in vivo1,7,8,9. Per questo motivo, più nuove tecniche di preparazione di scaffold nanofibre elettrofilate 3D sono state stabilite a modificare i difetti inerenti che vengono con nanofibre 2D. Queste tecniche si tradurrà in 3D impalcature; Tuttavia, hanno limitata applicabilità a causa dei metodi di produzione che richiedono soluzioni acquose e liofilizzazione procedure. Questa elaborazione comporta la distribuzione casuale delle nanofibre senza organizzazione ristretta, spessore adeguato, e/o porosità desiderata per fornire i segnali di nanotopographic adeguate che sono necessari per la proliferazione e migrazione cellulare. Questi fattori sono nei ponteggi di nanofibra elettrofilate 3D precedenti che non dispongono di adeguati mimetismo di vivere tessuti1,7,8,9.

Più recenti tentativi di sviluppare un'impalcatura espansa, 3D con migliore biomimetica della matrice extracellulare (ECM) sono stati effettuati utilizzando un trattamento della soluzione acquosa di sodio boroidruro (NaBH4) e stampi predefiniti per aiutare a controllare meglio la forma della risultante dell'impalcatura7,8. Tuttavia, questo metodo non è ideale in quanto richiede l'utilizzo di soluzioni acquose, reazioni chimiche e liofilizzazione che potrebbe interferire con polimeri e qualsiasi biomolecole incapsulato che sono solubili in acqua. Gli additivi utilizzati possono anche causare effetti collaterali durante la rigenerazione del tessuto8,9. Il metodo di espansione di CO2 descritto in questo articolo notevolmente riduce il tempo di elaborazione, Elimina la necessità di soluzioni acquose e conserva l'importo e la funzionalità delle molecole biologicamente attive in misura maggiore rispetto alla precedentemente metodi consolidati9.

In studi precedenti, antibiotici, argento, 1 α, 25 dihydroxyvitamin D3e peptide antimicrobico LL-37 sono stati caricati in nanofibra impalcature individualmente e in associazione a studiare il potenziale di queste impalcature di distaccanti per ulteriore aiuto nella cicatrizzazione9,10,12,13. Allo scopo di dimostrare questo metodo di espansione impalcatura nanofibra, cumarinici 6, un colorante fluorescente, verranno caricati nel patibolo per dimostrare il potenziale di incorporare il patibolo con vari composti desiderati. Questo metodo di montaggio di impalcatura nanofibra espansa in combinazione con molecole bioattive incapsulati ha un grande potenziale nella rigenerazione dei tessuti, la guarigione della ferita, la creazione di modelli 3D del tessuto e la consegna d'attualità della droga.

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Protocollo

Tutti in vivo procedure descritte di seguito sono state approvate dal Comitato IACUC presso l'University of Nebraska Medical Center.

1. preparare le soluzioni per elettrofilatura Standard

  1. In un tubo di vetro da 20 mL, sciogliere 2 g di poly(ε-caprolactone) (PCL, Mw = 80 kDa) in una miscela solvente di diclorometano (DCM) e N, N-dimetilformammide (DMF) con una razione di 4:1 (v/v) ad una concentrazione del 10% (p/v).
    Attenzione: Maniglia DCM e DMF in un cappuccio ventilato per evitare l'esposizione ai vapori. Non esporre DCM per materie plastiche.
  2. Inserire il tubo di vetro in un rotatore di laboratorio fino a quando la soluzione diventa chiara. La soluzione può mescolare durante la notte.
  3. Se l'intenzione di incorporare materiali bioattivi come peptidi o farmaci il patibolo, creare una soluzione separata e conservare a 4 ° C fino all'uso.
    1. Preparare la soluzione di colorante fluorescente (50 mg/mL) con 20 mL della soluzione PCL.

2. impostare l'apparecchio di elettrofilatura (Figura 1A)

  1. Aggiungere la soluzione PCL in una siringa da 20 mL con un ago 21 calibro attaccato. Assicurare che non esiste nessuna aria nella siringa e nella tubazione associata.
  2. Posizionare un tamburo rotante in acciaio con il collettore di terra 12 cm dalla punta dell'ago.
  3. Utilizzando morsetti a coccodrillo, collegare l'alimentatore ad alta tensione di corrente continua (DC) all'ago e accertarsi che il collettore è collegato a terra.
    Attenzione: Spegnere sempre l'alimentazione elettrica prima di maneggiare qualsiasi materiali connessi.

3. elettrofilatura

  1. Per i 20 mL della soluzione PCL, impostare i parametri della pompa a siringa come segue: diametro = 20,27 mm, portata = 0,5 mL/h. Check se le goccioline si formano sulla punta dell'ago.
  2. Se si desidera l'incorporazione di molecole bioattive, impostare l'apparecchio per consentire co-axial elettrofilatura (Figura 1B). Creare un ugello coassiale su misura utilizzando aghi ipodermici.
    Nota: Tali ugelli sono anche disponibili in commercio. Si noti che una soluzione di tintura è preparato per simulare l'aggiunta di tali molecole.
    1. Preparare una soluzione di 1% della tintura fluorescente cumarina 6 in acqua. Aggiungere 3 mL di tintura 1% di una piccola siringa. Collegare la siringa all'ugello coassiale stesso come la soluzione PCL. Ancora una volta, assicurarsi che non siano senza bolle d'aria.
    2. Per questa soluzione da 3 mL, impostare i parametri della pompa a siringa come segue: diametro = 9,49 mm, portata = 0,02 mL/h. Check se le goccioline si formano sulla punta dell'ago.
  3. Applicare un potenziale elettrico di 20 kV tra la filiera (ago da 22 gauge) e un collettore di terra situato 20 cm di distanza la filiera. Raccogliere le nanofibre allineate in un tamburo rotante a 2.000 giri/min. Raccogliere le nanofibre PCL quando raggiungono uno spessore di ~ 1 mm.

4. generazione di PCL nanofibra Mats con fori disposti.

  1. Fabbricare nanofibre PCL.
    1. Sciogliere perline PCL in una miscela solvente costituito da DCM e DMF con un rapporto di 4:1(v/v) ad una concentrazione del 10% (PCL) (w/v). La soluzione PCL della pompa con una portata di 0,7 mL/h con una pompa a siringa mentre un potenziale di 20 kV viene applicata tra la filiera (un ago 22-gage) e un collezionista a terra situato 12 cm a parte la filiera.
    2. Raccogliere la membrana di nanofibra utilizzando un tamburo rotante con una velocità di rotazione maggiore di 500 giri/min.
  2. Immergere le nanofibre PCL in liquido N2 per 5 min (cioè., diventano rigide). Mantenere le nanofibre PCL in liquido N2 e un pugno di nanofibre PCL con un pugno di diametro di mm 0,5.

5. ampliamento della nanofibra 2D stuoie con o senza fori disposti tramite sottocritico CO2 liquido (Figura 2).

  1. Inserire le nanofibre PCL in azoto liquido per 5 min e tagliare in quadrati di 1 cm x 1 cm utilizzando delle forbici affilate chirurgiche mentre sono immersi nell'azoto liquido per evitare la deformazione dei bordi.
  2. Posizionare il tappetino di taglio in una provetta da centrifuga 30ml con ~ 1 g di ghiaccio secco. Strettamente il coperchio di cap e consentire il ghiaccio secco cambiare in liquido CO2.
  3. Una volta che il liquido si è formata nel tubo, rilasciare rapidamente la pressione aprendo il tappo.
    Attenzione: Utilizzare attrezzatura protettiva termica adeguata quando si lavora con azoto liquido e ghiaccio secco. Non aprire il tubo pressurizzato verso la faccia. La provetta da centrifuga non deve essere utilizzato ripetutamente.
  4. Rimuovere e osservare l'impalcatura soffiato dal tubo. Posizionare il patibolo in una nuova provetta da centrifuga con ghiaccio secco e ripetere fino ad ottenere lo spessore desiderato. Sterilizzare le impalcature di nanofibra espansa in ossido di etilene prima dell'incubazione con le cellule.

6. caratterizzazione di nanofibra espanso ponteggi

  1. Caratterizzare la morfologia e la struttura delle impalcature nanofibra espanso mediante microscopia elettronica a scansione (SEM).
    1. I campioni con biadesivo conduttivo per il perno metallico e cappotto con platino per 40 s utilizzando una macchina di polverizzazione a 40 mA.
    2. Esaminare le fibre tramite SEM in base a precedenti studi9. Raccogliere le immagini a una tensione accelerare di 15 kV.
  2. Caratterizzare in vitro profili di rilascio e bioattività di peptidi rilasciati.
    1. Peso 10 mg di nanofibra membrane prima e dopo l'espansione in CO2.
    2. Immergere i campioni in tampone PBS e raccogliere 10 μL del surnatante a tempi differenti (0-28 giorni).
    3. Utilizzare kit Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) per quantificare la concentrazione di peptide LL-37 nel surnatante raccolto.
  3. Esaminare la risposta di infiltrazione cellulare in vivo e host.
    1. Mettere 9 - settimana-vecchi ratti Sprague-Dawley (deviazione standard) in una camera di anestesia, collegare al vapore isoflurano e anestetizzare i ratti. Trasferire i ratti a un tavolo operatorio dopo i topi diventano completa anestesia senza sentimenti. Continuamente anestetizzare i ratti utilizzando un cono di isoflurane-naso con vaporizzatore durante l'intervento chirurgico. Radersi i capelli dei dorsi di ratto dal rasoio di un animale e sterilizzarlo con iodio e alcool macchia della pelle. Creare tasche sottocutanee tramite incisioni di 1,5 cm in siti di supraspinal sul dorsum usando un bisturi.
    2. Inserire un espanso nanofibra impalcatura (1,5 mm di spessore) in tasca sottocutanea usando la pinzetta per ogni incisione. Chiudere l'incisione con una pinzatrice.
    3. A 1, 2 e 4 settimane, eutanasia i ratti con 95% CO2. Delicatamente sezionare l'espianto e il tessuto circostante utilizzando forbici chirurgiche. Prima dell'analisi istologica, immergere il tessuto in formalina per almeno 3 giorni e poi incorporare con paraffina. Sezione del tessuto con un microtomo, quindi eseguire ematossilina ed eosina (H & E), la colorazione tricromica di Masson.

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Risultati

L'efficacia di espansione nanofibre elettrofilate 2D tradizionale nei ponteggi 3D tramite depressurizzazione del sottocritico CO2 fluido è stata dimostrata in diverse capacità: lo spessore delle impalcature è aumentato da 1 mm quando non trattata fino a 2,5 mm e 19.2 mm con uno e due trattamenti di CO2 , rispettivamente (Figura 3A-C). La porosità-a caratteristica dell'architettura critico per la semina delle cellule-inol...

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Discussione

Trasformando nanofibre elettrofilate 2D tradizionale in espanso scaffold 3D è stata studiata tramite CO2 depressurizzazione. 2D tradizionale nanofibre sono correttamente espansa tramite sottocritico CO2 fluido. I passaggi critici sono per fabbricare nanofibre 2D sotto una condizione ottimizzata e tagliare i tappetini senza deformare i bordi (ad es., usando forbici chirurgiche affilate). Questo CO2-espanso nanofibra impalcature hanno molti benefici sopra stuoie 2...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano che non esiste alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da concede dal National Institute of General Medical Science (NIGMS) al NIH (2P 20 GM103480-06 e 1R01GM123081 a J.X.), i fondi Otis Glebe Medical Research Foundation, NE LB606 e avvio dal University of Nebraska Medical Centro.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
PolicaprolattoneSigma-Aldrich440744
N,N-DimettaliformammideFisher ChemicalD-199-1
DiclorometanoFisher ChemicalAC61093-1000
Cumarina 6Sigma-Aldrich546283
Tamburo rotante in acciaiopersonalizzatoQuesto funge da collettore durante l'elettrofilatura.
Pompa a siringaFisher Scientific14-831-200La filatura coassiale richiede due pompe a siringa singola.
RevolverLab Net InternationalH5600Rotatore da laboratorio regolabile per soluzioni di miscelazione
Ago ipodermico (27G x 1 1/2")EXCELINT International Co26426Questo fa parte dell'esempio di ugello coassiale personalizzato mostrato.
Ago ipodermico (21G x 1 1/2")EXCELINT International Co26416Questo fa parte dell'esempio di ugello coassiale personalizzato mostrato.
Alimentatore CC ad alta tensioneGamma Ricerca ad alta tensioneES30
Microscopio elettronico a scansioneFEINova 2300
Microscopio a fluorescenzaZeissAxio Imager 2
LL 37 Kit ELISAHycultBiotech HK321-02

Riferimenti

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