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Articolo metodologico

Pretargeted Radioimmunotherapy basato sulla reazione di Diels-Alder domanda inversa Electron

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DOI:

10.3791/59041

⸱

29 gennaio 2019

 ,  , 
1Department of Chemistry, Hunter College of the City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Department of Radiology, Weill Cornell Medical College

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive la sintesi e la caratterizzazione di un trans- ciclottene (TCO)-anticorpo e un radioligand tetrazine Lu-etichettati (Tz) 177per pretargeted radioimmunotherapy (PRIT) modifica. Inoltre, vi si descrive l'uso di questi due costrutti di biodistribuzione in vivo e studi longitudinali terapia in un modello murino di cancro colorettale.

Abstract

Mentre radioimmunoterapia (RIT) è un approccio promettente per il trattamento del cancro, l'emivita lunga farmacocinetica degli anticorpi radiomarcati può provocare dosi di alta radiazione ai tessuti sani. Forse non a caso, diverse strategie differenti sono state sviluppate per aggirare questa limitazione preoccupante. Uno dei più promettenti di questi approcci è pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). PRIT si basa sul disaccoppiamento radionuclide dall'immunoglobulina, iniettando loro separatamente e quindi consentendo loro di combinare in vivo presso il tessuto bersaglio. Questo approccio sfrutta le eccezionali proprietà di targeting tumorale di anticorpi costeggiando i loro svantaggi farmacocinetiche, quindi riducendo le dosi di radiazione ai tessuti non bersaglio e facilitare l'uso di radionuclidi con emivite che sono considerato troppo breve per uso in radioimmunoconjugates tradizionale. Negli ultimi cinque anni, il nostro laboratorio ed altri hanno sviluppato un approccio in vivo pretargeting basato sulla reazione di Diels-Alder (IEDDA) dell'elettrone-domanda inversa tra trans- ciclottene (TCO) e tetrazine (Tz). Questa strategia è stata applicata con successo a pretargeted tomografia a emissione di positroni (PET) ed emissione del singolo-fotone tomografia (SPECT) imaging con una varietà di sistemi antigene-anticorpo. In un paio di pubblicazioni recenti, abbiamo dimostrato l'efficacia di PRIT basati su IEDDA in modelli murini di adenocarcinoma duttale pancreatico e carcinoma colorettale. In questo protocollo, descriviamo protocolli per PRIT utilizzando un 177Lu-DOTA-etichettati tetrazine radioligand ([177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz) e una variante di TCO-modificato del cancro colorettale targeting huA33 anticorpo (huA33-TCO). Più specificamente, descriveremo la costruzione di huA33-TCO, la sintesi e radiolabeling [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz e le prestazioni di biodistribuzione in vivo e studi longitudinali terapia in modelli murini di carcinoma colorettale.

Introduzione

Radioimmunoterapia (RIT) — l'uso degli anticorpi per la consegna dei radionuclidi terapeutici ai tumori — è stata a lungo un seducente approccio per il trattamento di cancro1,2. Infatti, questa promessa è stata sottolineata dalla United States Food and Drug Administration l'approvazione di due radioimmunoconjugates per il trattamento del linfoma Non-Hodgkin: 90Y-ibritumomab tiuxetano e 131-tositumomab3 , 4. ma anche dai suoi primi giorni, le prospettive cliniche di RIT sono state ostacolate da una complicazione critica: intensità di dose elevata radiazione ai tessuti sani5,6. In generale, radioimmunoconjugates per RIT sono etichettati con radionuclidi piu ' longevi (ad es., 131io [t½ = 8,0 giorni] e 90Y [t½ = 2,7 giorni]) con emivite fisiche che si incastrano bene con il emivita lunga farmacocinetica delle immunoglobuline. Questo è essenziale, in quanto garantisce che la radioattività sufficiente rimane una volta che l'anticorpo ha raggiunto la biodistribuzione ottimale dopo diversi giorni di circolazione. Tuttavia, questa combinazione di tempi di permanenza lunga nel sangue ed emivita lunga fisica comporta inevitabilmente l'irradiazione dei tessuti sani, riducendo i rapporti terapeutici e limitare l'efficacia della terapia7. Diverse strategie sono state esplorate per aggirare questo problema, compreso l'uso di frammenti anticorpali troncato come Fab, Fab', punto2, minibodies e nanobodies8,9,10. Uno dei più promettenti e affascinante, ma innegabilmente complessi approcci alternativi è in vivo pretargeting11.

In vivo pretargeting è un approccio alla terapia che cerca di sfruttare la squisita affinità e selettività degli anticorpi bordando loro farmacocinetica inconvenienti11,12,13e imaging nucleare. A tal fine, l'anticorpo radioattivo utilizzato nel tradizionale radioimmunotherapy viene decostruito in due componenti: una piccola molecola radioligand e un immunoconjugate che può legarsi sia un antigene tumorale e il suddetto radioligand. Il immunoconjugate è iniettato prima e dato un 'vantaggio', spesso parecchi giorni, durante i quali si accumula nel tessuto bersaglio e Cancella dal sangue. Successivamente, la piccola molecola radioligand è amministrato e combina con il immunoconjugate al tumore o cancella rapidamente dal corpo. In sostanza, in vivo pretargeting si basa sulla esecuzione di radiochimica all'interno del corpo stesso. Riducendo la circolazione della radioattività, questo approccio riduce le dosi di radiazione ai tessuti sani e facilita l'uso di radionuclidi contemporaneamente (ad es., 68Ga, t½ = 68 min211; Come, t½ = 7,2 h) con emivite che in genere sono considerate incompatibili con i vettori di base di anticorpi.

A partire nel tardo 1980, sono stati sviluppati una manciata di diversi approcci per in vivo pretargeting, comprese strategie basate sugli anticorpi anticorpo, l'interazione tra streptavidina e biotina e l'ibridazione di complementari oligonucleotidi14,15,16,17,18. Eppure ognuno è stata frenata a vari gradi di complicazioni, più notoriamente l'immunogenicità potente di anticorpi streptavidina-modificato19,20. Negli ultimi cinque anni, il nostro gruppo e altri hanno sviluppato un approccio in vivo pretargeting basato sulla rapida e bioorthogonal inversa electron demand Diels-Alder legatura tra trans- ciclottene (TCO) e tetrazine (Tz) 21,22,23,24. Il maggior successo di queste strategie hanno impiegato un anticorpo TCO-modificato e un radioligand Tz-cuscinetto, come TCO è in genere più stabile in vivo oltre la Tz partner (Figura 1)25,26. Come in altre metodologie pretargeting, il immunoconjugate mAb-TCO è amministrato in primo luogo e dato il tempo di cancellare dalla circolazione e si accumulano nel tessuto del tumore. Successivamente, la piccola molecola Tz radioligand viene iniettato, dopo di che fa clic con il immunoconjugate all'interno del tessuto bersaglio o cancella rapidamente dal corpo. Questo in vivo pretargeting strategia si è dimostrato altamente efficace per PET e SPECT imaging con diversi sistemi di diversi anticorpi e antigeni, costantemente producendo immagini con contrasto elevato e consentendo l'uso di radionuclidi di breve durata come 18 F (t½ = 109 min) e 64Cu (t1/2 = 12.7 ore)21,22,24. Più recentemente, l'efficacia di basati su clic pretargeted radioimmunotherapy (PRIT) è stata dimostrata in modelli murini di adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) e carcinoma colorettale27,28. A tal fine, i radionuclidi terapeutici 177Lu (βmax = 498 keV, t1/2 = 6,7 giorni) è stato impiegato in combinazione con due differenti anticorpi: 5B1, che si rivolge l'antigene carboidratico 19.9 (CA 19.9) espressa ubiquitariamente in PDAC , e huA33, che si rivolge A33, una glicoproteina transmembrana espressa in > 95% dei cancri colorettali. In entrambi i casi, questo approccio a 177Lu-PRIT ha reso le concentrazioni di alta attività nel tessuto del tumore, ha creato un effetto terapeutico dose-dipendente e contemporaneamente ridotte concentrazioni di attività in tessuti sani rispetto ai tradizionali direttamente-con l'etichetta radioimmunoconjugates.

In questo articolo, descriviamo i protocolli per PRIT utilizzando un 177Lu-DOTA-etichettati tetrazine radioligand ([177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz) e una variante di TCO-modificato dell'anticorpo huA33 (huA33-TCO). Più specificamente, descriviamo la costruzione di huA33-TCO (Figura 2), la sintesi e radiolabeling [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz (Figura 3 e Figura 4) e le prestazioni di in vivo biodistribuzione e terapia longitudinale studi in modelli murini di carcinoma colorettale. Inoltre, nei risultati rappresentativi e discussione, presentiamo un set di dati campione, possibili strategie di indirizzo per l'ottimizzazione di questo approccio e considerare questa strategia nel contesto più ampio di in vivo pretargeting e PRIT. Infine, è importante notare che mentre abbiamo scelto di concentrarsi su pretargeting utilizzando huA33-TCO e [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz in questo protocollo, questa strategia è altamente modulare e può essere adattato per soddisfare una vasta gamma di anticorpi e radionuclidi.

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Protocollo

Tutti in vivo animale esperimenti descritti in questo lavoro sono sono eseguiti secondo protocolli approvati ed eseguiti sotto la Guida di riferimento etica del Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Weill Cornell Medical Center e Hunter College Istituzionale cura degli animali e uso comitati (IACUC).

1. la preparazione del huA33-TCO

Nota: La sintesi di huA33-TCO è stato precedentemente segnalati29. Tuttavia, per facilitare il lettore, viene replicata qui con regolazioni per condizioni ottimali.

  1. In un tubo del microcentrifuge 1,7 mL, preparare una soluzione di 125 μL di (E) - cyclooct - 4-enile 2,5-diosso-1-pyrrolidinyl carbonato (TCO-NHS) a secco di dimetilformammide (DMF) ad una concentrazione di 40 mg/mL (0,15 M). Questa soluzione può essere aliquotati e congelati a-80 ° C per uso negli esperimenti futuri.
  2. In un tubo del microcentrifuge separata 1,7 mL, preparare una soluzione di 5 mg/mL di huA33 in 1 mL di tampone fosfato salino (PBS; 2,7 mM 11,9 millimetri di fosfato di potassio, cloruro di potassio e cloruro di sodio 137 mM a pH 7,4).
  3. Utilizzando piccole aliquote (< 5 μL) di 0,1 M Na2CO3, regolare il pH della soluzione dell'anticorpo da passo 1.2 a 8,8-9.0. Utilizzare carta pH o un pH-metro con un microelettrodo per monitorare il pH e prestare attenzione che il pH non superi 9.0.
  4. Per la soluzione di anticorpo descritta al passaggio 1.3, aggiungere lentamente un volume corrispondente a 40 equivalenti molari di TCO-NHS rispetto alla quantità di anticorpo. Ad esempio, se 5 mg (30 nmol) di huA33 è la soluzione, aggiungere 9.0 μL (1.20 μmol) della soluzione di 40 mg/mL (0,15 M) di TCO-NHS.
    Nota: TCO-NHS è idrofobo. Quando si aggiunge alla soluzione dell'anticorpo, aggiungere lentamente e con agitazione per impedire la precipitazione. Non superare il 10% DMF in volume della soluzione di reazione finale.
  5. Consentire la reazione Incubare a 25 ° C su un thermomixer per 1 h con lieve agitazione (500 giri/min).
  6. Dopo 1 h, purificare il immunoconjugate huA33-TCO utilizzando una colonna di dissalazione esclusione dimensioni monouso pre-confezionati.
    1. Equilibrare la colonna di esclusione di dimensione come descritto dal fornitore per rimuovere eventuali conservanti presenti nella colonna durante la conservazione. Una procedura tipica prevede il lavaggio della colonna 5 x con un volume di PBS che corrisponde al volume della colonna: 5 x 2,5 mL di PBS.
    2. Aggiungere la miscela di reazione nella colonna di esclusione di dimensione notando il volume della miscela di reazione.
    3. Dopo la miscela di reazione è entrato la colonna, aggiungere una quantità appropriata di PBS per portare il volume totale della soluzione aggiunto alla colonna fino a 2,5 mL. Ad esempio, se la reazione di coniugazione è provocato da un volume totale di 1,3 mL, aggiungere 1,2 mL di PBS aggiuntive alla colonna.
    4. Raccogliere il prodotto utilizzando 2 mL di PBS come eluente.
      Nota: Questo passaggio produrrà il costrutto finale huA33-TCO in 2 mL di PBS, pH 7,4.
  7. Misurare la concentrazione del huA33-TCO utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis monitoraggio lunghezza d'onda di 280 nm. Il coefficiente di estinzione molare per la maggior parte delle IgG (ε280) è 210.000 M-1cm-1.
  8. Se si desidera una soluzione con una maggiore concentrazione di immunoconjugate, concentrare la soluzione di huA33-TCO utilizzando un'unità filtro centrifugo con un cut-off di 50.000 peso molecolare seguendo le istruzioni del produttore.
    Nota: Molti anticorpi sono stati conosciuti per aggregare o precipitare durante la concentrazione. Quando si tenta di questa procedura con un nuovo anticorpo, i ricercatori dovrebbero rinviare alla letteratura o la propria esperienza nella gestione dell'anticorpo in questione.
  9. Conservare il immunoconjugate completato huA33-TCO a 4 ° C al buio se è necessario immediatamente. Se si vuole essere utilizzato più di 4 giorni in futuro, conservarlo a-80 ° C al buio.
    Nota: Questo è un punto di sosta accettabile nella procedura. Il immunoconjugate huA33-TCO completato dovrebbe essere stabile per almeno 6 mesi di immagazzinaggio a-80 ° C al buio.

2. la sintesi di Tz-PEG7- NHBoc

  1. In un tubo del microcentrifuge 1,7 mL, sciogliere 5 mg di tetrazine N- hydroxysuccinimidyl ester (Tz-NHS; 12,6 μmol) a 0,15 mL di anidro dimetilsolfossido (DMSO).
  2. In un tubo del microcentrifuge separata 1,7 mL, sciogliere 8 mg di Boc-protetti aminoacidi PEG polimero, glicole O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene (NHBoc-PEG7-NH2; 17,1 μmol) a 0,15 mL di DMSO anidro.
  3. Per la soluzione di Tz-NHS, aggiungere 3 μL (21,3 μmol, 1,7 molari equivalenti) di trietilammina (tè) e mescolare accuratamente.
  4. Aggiungere la soluzione di rosa tetrazine alla NHBoc-PEG7-NH2 soluzione da Step 2.2 e incubare per 30 min a temperatura ambiente (TA) con lieve agitazione, la miscela di reazione.
  5. Dopo 30 minuti, diluire la reazione 1:1 in H2O e purificare la reazione mediante cromatografia liquida a fase inversa C18 ad alte prestazioni (HPLC) per separare qualsiasi Tz-NHS non reagito da Tz-PEG7- NHBoc. Utilizzare solventi senza acido per impedire la rimozione precoce di Boc proteggere il gruppo. Monitorare entrambi Tz-PEG7- NHBoc e Tz-NHS alla lunghezza d'onda di 525 nm.
    Nota: Tempi di ritenzione sono ovviamente fortemente dipendente dalle apparecchiatura HPLC di ogni laboratorio (pompe, colonne, tubi, ecc.), e controlli appropriati devono essere eseguiti prima della purificazione. Tuttavia, per presentare un esempio, se una pendenza di 5: 95 MeCN/H2O (entrambi senza alcun additivo) a 95: 5 MeCN/H2O oltre 30 min, vengono utilizzati una portata di 1 mL/min e una colonna di18analitiche 4,6 mm x 250 mm C , i tempi di ritenzione di Tz-NHS e Tz-PEG7- NHBoc sono circa 16 min e 18 min, rispettivamente.
  6. Congelare l'eluente HPLC raccolto usando azoto liquido e avvolgere il tubo di raccolta ora-congelato nella carta stagnola. Posto il tubo di raccolta congelato su un liofilizzatori pernottamento per rimuovere la fase mobile HPLC. Il prodotto sarà un solido rosa brillante caratteristico.
    Nota: Se l'azoto liquido non è disponibile, congelare l'eluente HPLC raccolto in ghiaccio secco o durante la notte in un congelatore a-80 ° C.

3. la sintesi di Tz-PEG7-NH2

  1. Al prodotto da passo 2.6, Tz-PEG7- NHBoc, aggiungere 1,5 mL di diclorometano (DCM) e trasferire questa soluzione in un pallone da piccolo.
  2. Aggiungere 0,25 mL di acido trifluoroacetico (TFA) goccia a goccia la soluzione rosa da passo 3.1.
  3. Consentire la reazione Incubare 30 min a RT con lieve agitazione.
  4. Dopo 30 min, far evaporare il solvente tramite evaporazione rotante. Non superare una temperatura del bagno di acqua di 37 ° C.
  5. Ricostituire il prodotto viscoso rosa in 0,5 mL di acqua.
  6. Purificare il prodotto utilizzando controfase C18 HPLC per separare Tz-PEG7-NH2 dal precursore Boc-protetto. Monitorare entrambi Tz-PEG7- NHBoc e Tz-PEG7-NH2 ad una lunghezza d'onda di 525 nm.
    Nota: Tempi di ritenzione sono ovviamente fortemente dipendente dalle apparecchiatura HPLC di ogni laboratorio (pompe, colonne, tubi, ecc.), e controlli appropriati devono essere eseguiti prima della purificazione. Tuttavia, per presentare un esempio, se una pendenza di 5: 95 MeCN/H2O (entrambi con 0,1% TFA) a 95: 5 MeCN/H2O oltre 30 min, vengono utilizzati una portata di 1 mL/min e una colonna di18analitiche 4,6 mm x 250 mm C , i tempi di ritenzione di Tz-PEG7- NHBoc e Tz-PEG7-NH2 sono circa 18 min e 13 min, rispettivamente.
  7. Congelare l'eluente HPLC raccolto usando azoto liquido e avvolgere il tubo di raccolta ora-congelato nella carta stagnola. Posto il tubo di raccolta congelato su un liofilizzatori pernottamento per rimuovere la fase mobile HPLC. Il prodotto sarà un solido rosa brillante.
  8. Ricostituire il prodotto dal passo 3.7, Tz-PEG7-NH2, con 150 μL di DMSO e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga 1,7 mL.
  9. Misurare la concentrazione di Tz-PEG7-NH2 utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis monitoraggio lunghezza d'onda di 525 nm. Il coefficiente di estinzione molare per Tz-PEG7-NH2 (ε525) è 535 M-1cm-1.

4. la sintesi di Tz-PEG7- DOTA

  1. Sciogliere Tz-PEG7-NH2 (4,5 mg, 6,9 μmol) in 0,15 mL di DMSO (o semplicemente procedere con la soluzione creata nel passaggio 3.8).
  2. Aggiungere 22 equivalenti molari di tè (21 μL, 0,15 mmol) alla soluzione contenente tetrazine dal punto 4.1.
  3. Aggiungere 10 mg (14,2 μmol) di p- SCN-Bn-DOTA come un solido e vortice la soluzione per circa 2 min o fino a quando il materiale sia completamente dissolto.
  4. Consentire la reazione Incubare 30 min a RT con lieve agitazione.
  5. Dopo 30 min, diluire la reazione 1:1 in H2O e purificare il prodotto utilizzando controfase C18 HPLC per rimuovere non reagito p- SCN-Bn-DOTA. Il p- SCN-Bn-DOTA possa essere controllato a una lunghezza d'onda di 254 nm, mentre la Tz-PEG7- DOTA è meglio monitorato ad una lunghezza d'onda di 525 nm.
    Nota: Tempi di ritenzione sono ovviamente fortemente dipendente dalle apparecchiatura HPLC di ogni laboratorio (pompe, colonne, tubi, ecc.), e controlli appropriati devono essere eseguiti prima della purificazione. Tuttavia, per presentare un esempio, se una pendenza di 5: 95 MeCN/H2O (entrambi con 0,1% TFA) a 95: 5 MeCN/H2O oltre 30 min e una colonna di18analitica 4.6 x 250 mm C sono usati, Tz-PEG7- DOTA e p-SCN-Bn-DOTA hanno tempi di ritenzione dei circa 15,6 min e 16,1 min, rispettivamente.
  6. Congelare l'eluente HPLC raccolto usando azoto liquido e avvolgere il tubo di raccolta ora-congelato nella carta stagnola. Posto il tubo di raccolta congelato su un liofilizzatori pernottamento per rimuovere la fase mobile HPLC. Il prodotto sarà un brillante rosa cipria.
  7. Ricostituire il prodotto a 0,15 mL di DMSO e misurare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis monitoraggio lunghezza d'onda di 525 nm. Il coefficiente di estinzione molare per Tz-PEG7- DOTA (ε525) è 535 M-1cm-1.
  8. Analizzare il composto finale di risonanza magnetica nucleare (NMR) e spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS) per verificare che la sintesi è stata eseguita correttamente. Vedere la tabella 1 per il determinato sperimentalmente gli spostamenti chimici e pesi molecolari di tutti i composti discussi in questo lavoro.
  9. Conservare la soluzione di - DOTA di7Tz-PEG purificata al buio a-80 ° C.
    Nota: Questo è un punto di sosta accettabile nella procedura. Il precursore DOTA -7Tz-PEG completato è stabile per almeno 1 anno in queste condizioni.

5. 177Lu radiomarcatura di Tz-PEG7- DOTA

Attenzione: Questo passaggio del protocollo prevede l'utilizzo e manipolazione di radioattività. Prima di eseguire queste operazioni — o l'esecuzione di qualsiasi altro lavoro con radioattività — i ricercatori dovrebbero consultare il radiazione Safety Department di loro Istituto di provenienza. Prendere tutte le misure possibili per ridurre al minimo l'esposizione alle radiazioni ionizzanti.

Nota: Quando si lavora con piccole quantità di radiometalli è consigliabile che tutti i buffer è esente da metalli in traccia per evitare interferenze in associazione del sito di coordinamento.

  1. In una provetta da centrifuga 1,7 mL, aggiungere 200 μL di tampone di acetato di ammonio 0,25 M regolato con aliquote di 1 M HCl a pH 5.5.
    Nota: Se si utilizza meno di 370 MBq di attività per l'etichettatura, il volume del buffer utilizzato dovrebbe essere ridotto a 100 µ l.
  2. Aggiungere la quantità desiderata di [177Lu] LuCl3 per la soluzione tampone. L'importo aggiunto sarà dipenda dal numero dei soggetti dell'esperimento e le dosi radioattive viene somministrate. È consigliabile che 1-2 dosi extra vale la pena di radioattività aggiungersi come misura precauzionale per compensare la perdita potenziale di radioattività durante fasi di purificazione.
  3. Aggiungere Tz-PEG7- DOTA in DMSO al composto radioattivo al punto 5.2. La quantità di Tz-PEG7- DOTA è dipenda dal numero di soggetti in fase di test. Maggiori dettagli su questo argomento possono essere trovato nel passaggio 6.2.2.2.
  4. Lasciare la soluzione a incubare a 37 ° C per 20 min.
  5. Verificare che la radiomarcatura è completata mediante cromatografia di strato sottile istantanea di radio (radio-iTLC) con 50 mM EDTA, pH 5.5 come fase mobile. L'etichetta [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz rimarrà alla linea di base — Rf = 0 — mentre gratis [177Lu] Lu3 + sarà coordinato con l'EDTA e viaggerà con il fronte del solvente, Rf = 1.0 (Figura 3B).
  6. Se etichettatura quantitativa non viene raggiunta, aggiungere ulteriore ligando per coordinare il radiometal gratuito. In alternativa, purificare l'etichetta [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz utilizzando una cartuccia di18 C. Seguire le istruzioni del produttore per l'uso. Seguito è riportato un esempio di routine.
    1. Adescare la cartuccia passando lentamente attraverso 5 mL di etanolo attraverso la cartuccia con una grossa siringa. Quindi, passare attraverso 5 mL di acetonitrile e poi 5 mL di deionizzata (DI) H2O.
    2. Aspirare la soluzione di radioligand da 5.3 passo in una più piccola siringa e iniettare lentamente sulla cartuccia C18 . Quindi, lavare la cartuccia con 10 mL DI H2O di rimuovere qualsiasi unbound [177Lu] LuCl3.
    3. Eluire con 500 µ l di etanolo. Rimuovere qualsiasi etanolo dal prodotto finale passando sopra la nave con un tasso di flusso debole di azoto secco o argon per 10-15 min. Successivamente, risospendere il radioligando in soluzione salina in un volume determinato nel passaggio 6.2.2.2.

6. gli studi in vivo

Attenzione: Come nella sezione 5, questo passaggio del protocollo prevede l'utilizzo e manipolazione di radioattività. Prima di eseguire questi passaggi, i ricercatori dovrebbero consultarsi con reparto di sicurezza di radiazione del loro Istituto di appartenenza. Prendere tutte le misure possibili per ridurre al minimo l'esposizione alle radiazioni ionizzanti.

  1. Preparazione degli animali
    1. In athymic femminili, per via sottocutanea dell'impianto di cellule di cancro colorettale di 5 x 106 SW1222 sospese in 150 µ l di una miscela 1:1 di media delle cellule e matrice (ad es., Matrigel) e permettere a questi di crescere in un xenograft3 di 100-150 mm (14-18 giorni dopo l'inoculazione).
    2. L'ordinamento degli animali per un esperimento di biodistribuzione
      1. Una volta che i tumori sono di dimensioni sufficienti come determinato da misurazione di pinza, ordinare gli animali affinché ogni coorte ha circa lo stesso volume medio del tumore. Gli animali possono essere distinti in ogni gabbia dalle marcature sulla coda con inchiostro indelebile (una banda, due bande, ecc.).
    3. L'ordinamento degli animali per uno studio di terapia longitudinale
      1. Una volta che i tumori sono di dimensioni sufficienti, come determinato dalla misura della pinza, è possibile collegare auricolari a ciascuno degli animali per garantire un monitoraggio corretto in tutto l'esperimento.
        Nota: Etichette numeriche orecchio possono staccarsi durante tutto il corso dell'esperimento. Di conseguenza, si consiglia di accompagnare queste etichette fisiche con tacche di orecchio in modo sistematico (cioè., destra, sinistra, bilaterale, diritto x 2, x 2 a sinistra).
      2. Ordinare gli animali in modo che il volume medio del tumore in ogni gruppo è approssimativamente uguale. Il seguente metodo per l'ordinamento degli animali può essere eseguito utilizzando un programma di foglio di calcolo.
        1. Elencare i numeri di identificazione degli animali, modello tacca dell'orecchio e volume del tumore in tre colonne separate.
        2. Ordinare i dati dal più piccolo al più grande volume del tumore.
        3. In una quarta colonna, è necessario assegnare ogni animale un ciclo attraverso le gabbie a forma di serpente e il numero di gabbia. Ad esempio, se ci sono 5 gabbie, questa colonna sarebbe riempito "5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5..." fino a quando tutti gli animali sono assegnati una gabbia.
        4. Una volta che le gabbie sono assegnate, ordinare i dati di numero di gabbia. Se vengono utilizzate le tacche dell'orecchio, garantire che ogni animale in una gabbia data ha un modello di tacca unico orecchio. Se esistono duplicati (due o più dello stesso modello) in una gabbia data, il uno mouse scambio con uno da un'altra gabbia con il motivo manca fino a quando ogni gabbia ha animali con modelli di tacca unico orecchio.
  2. Formulazioni e iniezioni
    Nota: La sequenza di iniezione per studi di biodistribuzione e la terapia procede come segue: huA33-TCO viene iniettato in primo luogo, seguito da [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz dopo un intervallo predeterminato.
    1. Immunoconjugate
      1. Diluire una parte aliquota della soluzione huA33-TCO da 1,9 passo a una concentrazione di 0,8 mg/mL in soluzione sterile salina 0,9%.
      2. Disegnare le dosi di 150 µ l (100 µ g) di soluzione di huA33-TCO in siringhe pretrattati con 1% albumina di siero bovino (BSA) in PBS e memorizzare queste siringhe sul ghiaccio.
        Nota: BSA trattamento riduce il legame non specifico dell'anticorpo per le pareti della siringa.
      3. Caldo gli animali sotto una lampada di calore per 3 minuti per dilatare la vena della coda.
      4. Iniettare la soluzione di huA33-TCO nella vena caudale del mouse dello xenotrapianto-cuscinetto. Consentire 24h (o un intervallo di tempo pre-determinato diversi) per il huA33-TCO ad accumulare nel tumore del mouse.
    2. Radioligand
      1. Si Tz-PEG7- DOTA come descritto nella sezione 5.
      2. Disegnare le dosi in 150 μL dello 0,9% sterile salina contenente 1,1 equivalenti molari di Tz-PEG7- DOTA riguardante la quantità di huA33-TCO amministrato. Ad esempio, se 100 μg (0.67 nmol) di huA33-TCO è stato iniettato nell'animale e la miscela di reazione [177Lu] - Tz7Lu-DOTA-PEG è stata effettuata con una specifica attività di 12,4 GBq/μmol, quindi le dosi creeranno contenente 9.14 MBq di ogni attività. Ciò corrisponde a 0.74 nmol di Tz (1,1 EQ. molare relativa a huA33-TCO).
      3. Caldo gli animali sotto una lampada di calore per 3 min a dilatare la vena della coda.
      4. Iniettare la dose di radioligand nella vena caudale del mouse dello xenotrapianto-cuscinetto. La quantità di attività deve essere iniettato è determinata dal ricercatore. I dati pubblicati hanno dimostrato gli effetti terapeutici di dose-dipendente sulle dimensioni del tumore all'interno di una gamma di 7,4-55,5 MBq.
  3. Biodistribuzione
    1. Presso il punto di tempo desiderato dopo la somministrazione del radioligand, eutanasia ogni coorte dei topi utilizzando un 2% O2 / 6% CO2 miscela di gas.
      Nota: Seguire qualsiasi requisiti istituzionali per quanto riguarda i metodi per l'eutanasia fisica secondaria (ad es., la dislocazione cervicale).
    2. Per ogni animale, rimuovere tutti gli organi di interesse, lavarli in un bagno d'acqua per rimuovere il sangue in eccesso e asciugarle su un tovagliolo di carta aperto per 5 min. elenco di organo di esempio nell'ordine suggerito: sangue, tumore, cuore, polmoni, fegato, milza, stomaco, intestino tenue , grande intestino, reni, muscolo, osso, pelle, coda.
    3. Una volta sufficientemente essiccati, posizionare gli organi in provette di coltura monouso pre-pesati. Pesare i tubi ora-riempito ancora una volta per ottenere la massa di ogni organo o tessuto.
    4. Misurare l'attività in ciascuna delle provette in un contatore gamma. Calibrare l'attività misurata con il contatore gamma al rivelatore utilizzato per misurare la dose disegnata. Conteggio radioattivo standard di 177Lu su ciascuno strumento e determinare un fattore di calibrazione per l'interconversione tra attività e conteggi al minuto (cpm).
    5. Tracciare i dati di biodistribuzione come un grafico a barre (Vedi Figura 5) con il valore medio normalizzato l'assorbimento per ogni organo visualizzato insieme con un bar che denota una deviazione standard. Le differenze statistiche nell'assorbimento fra gruppi di campioni possono essere valutate da un test t spaiato, in cui il significato è raggiunto quando p < 0.05.
  4. Monitoraggio della terapia
    1. Misurare il lato più lungo del tumore oblungo (lunghezza) così come la larghezza, che è perpendicolare alla lunghezza con pinze. Calcolare il volume utilizzando la formula per il volume di un ellissoide: πL· (4/3) W· H, che si semplifica in ½L· W2, supponendo che l'altezza è circa uguale alla larghezza.
      Nota: È anche possibile utilizzare un tumore palmare dispositivo di misurazione, se uno è disponibili (Vedi Tabella materiali).
    2. Pesare ogni topo su un equilibrio per tenere traccia di aumento di peso o perdita di peso nel tempo.
    3. D'importanza, monitorare l'aspetto fisico di ogni animale per segni di agitazione, come curvato indietro o rotti vasi sanguigni cutanei (che possono indicare ematotossicità).
      Nota: Misure del tumore dovrebbero essere raccolti ogni 1-2 giorni durante il corso dello studio longitudinale di terapia.
    4. Traccia dati dalla terapia longitudinale studiano volumi del tumore come media nel tempo e normalizzano il volume del tumore di iniziale, se lo si desidera. Le differenze statistiche nell'assorbimento nello stesso giorno tra gruppi di campioni possono essere valutate da un test t spaiato, in cui il significato è raggiunto quando P < 0.05. Analisi statistiche più estese possono e devono essere eseguite come consigliato da un biostatistico addestrato.

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Risultati

La coniugazione del TCO per huA33 si basa sull'accoppiamento tra il TCO-NHS ammina-reattivo e i residui di lisina sulla superficie dell'immunoglobulina. Questo metodo è altamente affidabile e riproducibile e affidabile produce una grado-di-etichettatura di TCO/mAb 2-4. In questo caso, spettrometria di massa MALDI-ToF è stata impiegata per confermare un certo grado di etichettatura di circa 4,0 TCO/mAb; un valore simile è stato ottenuto utilizzando un tetrazine fluorophore-modificato come ...

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Discussione

Uno dei punti di forza di questo approccio per in vivo pretargeting — soprattutto in relazione alle strategie fondate sugli anticorpi anticorpo e radioattivi apteni — è la sua modularità: trans- ciclottene moiety possono essere aggiunti a qualsiasi anticorpo, e tetrazine radioligands possono essere radioattivi con una straordinaria varietà di radionuclidi senza alterare la loro capacità di reagire con i loro partner di clic. Ancora l'adattamento di questo approccio per altri sistemi antigene/anticorpo n...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano il Dr. Jacob Houghton per conversazioni utili. Gli autori inoltre ringraziare il NIH per loro generosi finanziamenti (R00CA178205 e U01CA221046).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
(E)-Cicloott-4-enile 2,5-diosso-1-pirrolidinil carbonato (TCO-NHS)Sigma-Aldrich 764523Conservare a -80 gradi; C
2,5-Dioxo-1-pirrolidinil 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-il)benzilammino]-5-ossopentanoato (Tz-NHS)Sigma-Aldrich764701Negozio a -80 ° C
Acetonitrile (MeCN)Fisher ScientificA998-4
Acetato di ammonio (NH4OAc)Fisher ScientificA639-500
Boc-PEG7-ammina (O-(2-amminoetil)-O′-[2-(Boc-ammino)etil]esaetilenglicole)Sigma-Aldrich70023Conservare a -20 ° C
Diclorometano (DCM)Fisher ScientificD143-1
Dimetil solfossido (DMSO), anidroFisher ScientificD12345
EMD Millipore Amicon Ultra-2 Unità di filtro centrifugaFisher ScientificUFC205024
GE Healthcare Colonne di desalinizzazione PD-10 monousoFisher Scientific45-000-148
N, N-dimetilformammide (DMF), anidroFisher ScientificAC610941000
soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Fisher Scientific70-011-04410x concentrato
p-SCN-Bn-DOTAMacrocicliciB-205Conservare a -20 ° C
Trietilammina (TEA)Fisher ScientificAC157911000
Acido trifluoroacetico (TFA)Fisher ScientificA116-50
Misuratore di tumorePeira TM900Peira TM900

Riferimenti

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