Vi præsenterer en enkel suppressor skærmen protokol i fission gær. Denne metode er effektiv, mutagen-fri og selektiv for mutationer, der ofte opstår i en enkelt genomisk locus. Protokollen er velegnet til isolering af undertrykkerne, der lindre vækst defekter i flydende kultur, der er forårsaget af en mutation eller et lægemiddel.
En genetisk skærm for mutante alleler, der undertrykker fænotypiske defekter forårsaget af en mutation er en kraftfuld metode til at identificere gener, der tilhører nærtbeslægtede biokemiske veje. Tidligere metoder såsom syntetiske genetiske matrix (SGA) analyse og tilfældig mutagenese teknikker ved hjælp af ultraviolet (UV) eller kemikalier som ethyl methanesulfonate (EMS) eller N-ethyl-N-nitrosourea (ENU), har været udbredt men er ofte dyre og besværlige. Disse mutagen-baseret screening-metoder er også ofte forbundet med alvorlige bivirkninger på organismen, inducerende flere mutationer, som føjer til kompleksiteten af afsondrethed undertrykkerne. Her præsenterer vi en enkel og effektiv protokol for at identificere suppressor mutationer i mutanter, der giver en vækst defekt i Schizosaccharomyces pombe. Fitness af celler med en vækst mangel hos standard rige flydende medier eller syntetiske flydende medier kan overvåges for genopretning ved hjælp af en automatiseret 96-brønd Pladelæser over en længere periode. Når en celle erhverver en suppressor mutation i kulturen, outcompete sine efterkommere dem af forældrenes celler. De gendannede celler, der har en konkurrencedygtig vækst fordel over forældrenes cellerne kan derefter isoleret og backcrossed med forældrenes celler. Suppressor mutationer er derefter identificeres ved hjælp af hele-genome sequencing. Brug denne fremgangsmåde, har vi med held isoleret flere undertrykkere, at afhjælpe de alvorlige vækst defekter forårsaget af tab af Elf1, en AAA + familie ATPase, der er vigtigt i nukleare mRNA transport og vedligeholdelse af genomisk stabilitet. Der er i øjeblikket over 400 gener i S. pombe med mutanter giver en vækst defekt. Som mange af disse gener er uncharacterized, foreslår vi, at vores metode vil fremskynde identifikationen af roman funktionel interaktioner med denne brugervenlige og høj overførselshastighed tilgang.
Grundlag i forståelsen af funktionelle forbindelser mellem gener er afhængig af evnen til at identificere de molekylære mekanismer som komplekse genetiske egenskaber afviger for at producere forskellige fænotyper1. I fission gær, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), er fleste af protein-kodning gener undværes for levedygtighed2. Dette resultat taler ikke til unimportance af disse gener, men snarere at de indviklede kompenserende mekanismer bag de biokemiske veje, hvortil hører sådanne gener. Dissekere disse kompenserende mekanismer har genereret epistasis kort, som har afsløret omfattende genetiske interaktioner og udvidet vores forståelse af funktionelle biokemiske veje3,4.
Høj overførselshastighed metoder (fx syntetisk genetiske matrix analyse eller SGA) er blevet udviklet for at identificere genome-wide genetiske interaktioner i spirende gær, og er blevet udvidet til brug i fission gær5,6. Sådanne tilgange er ofte afhængige af et bibliotek af stammer, der indeholder alle levedygtige enkelt protein-kodning gen sletninger (omkring 3.300 haploide sletning mutanter dækker over 92% af fission gær genom), og kræver en robotarm til at udføre de genetiske krydsninger mellem de stamme af interesse og alle mulige stammer i library6. Yderligere, SGA teknikker afhænger bibliotek stammer evne til at have ordentlig og effektiv parring, en fænotype, der er unormalt at 444 i øjeblikket kendetegnet gener i S. pombe2.
På trods af kompleksiteten af genetiske interaktioner, sammenligne Fænotypen af en stamme bærer mutationer i to gener på fænotype af to stammer transporterer enkelte mutationer af hvert gen kan have en af to bemærkelsesværdige resultater: 1) dobbelt mutant fænotype er værre end den forventede multiplikativ forældrene fænotyper i form af sygdom eller i de mest ekstreme tilfælde, dødelighed. Dette omtales som en negativ genetiske interaktion, og er generelt et tegn på, at de to gener handle i parallelle biologiske veje. 2) dobbelt mutant fænotype er bedre end den forventede kombination af forældrenes fænotyper, også kendt som en positiv genetiske interaktion. En positiv genetiske interaktion er særlig interessant, fordi det angiver, at disse gener fungerer i den samme proces. To positivt interagerende gener har tre potentielle relationer: en mutant gen kan op-regulere udtryk af genet i et parallelt forløb, de to gener kan arbejde i koncerten inden for den samme vej nedstrøms af hinanden eller de to gener indkode proteiner, der interagerer direkte med hinanden. Derfor kan positivt genetisk interaktioner bruges til at knytte gen administrative knudepunkter og klassificere uncharacterized gener i biokemiske veje7,8.
En suppressor er en mutation, der kan lindre sygdom Fænotypen af mutation af et andet gen, der typisk repræsenterer en positiv genetiske interaktion mellem to gener9,10. Suppressor mutationer på en anderledes locus fra, af de undertrykke-mutationen er kendt som extragenic undertrykkere. De er særligt værdifulde i at studere ikke-levedygtige genetiske mutationer af syntetisk redning dødbringende fænotype (også kendt som Lazarus effekten)11. De har også potentielle terapeutiske anvendelser i behandling af arvelige sygdomme12,13.
Af alle disse grunde, har identifikation af suppressor mutationer i forskellige modelorganismer udnyttet bredt for at lette forståelsen af forskellige biokemiske veje14,15,16. Screening for undertrykkerne er normalt baseret på Fænotypen af den pågældende mutation og kræver udførelse tilfældig mutagenese for at isolere de mutationer, der ville afhjælpe fænotype. Næsten alle modelorganismer har etableret tilfældig mutagenese metoder. For eksempel, N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) og ethylmethanesulfonate (EMS), to mutagener, der er i stand til at inducere punkt mutationer i DNA, er almindeligt anvendt i forskellige modeller fra bakterier til mus17,18,19 . Derudover har mangan chlorid længe været anvendt i gær for mangan kation evne til at hæmme DNA reparation veje20. En anden fælles tilgang er UV-induceret mutagenese, som genererer genome-wide mutagene pyrimidin dimerer21,22.
Udnyttelse af kemiske mutagenese at identificere suppressor mutationer har været populære, har metoden mange ulemper, herunder brugen af farlige kemikalier, meget varierende succes satser og indførelsen af ekstra konfunderende variabler præsenteret af de negative bivirkninger af mutagen på flere cellulære processer23,24. Derudover inducerer kemiske mutagenese ofte flere mutationer i genomet, som tilføjer kompleksitet ved hjælp af genetiske og sekventering teknikker til at identificere den nøjagtige mutation, der tillægges suppressor fænotype i organismen25.
For at afhjælpe manglerne i nuværende mutagenese tilgange, præsenterer vi en metode til skærmen for spontan suppressor mutationer i fission gær, der ikke stole på nogen mutagene eller en sletning bibliotek. Metoden isolerer overspændingsbeskyttere gennem en positiv markering assay. Princippet om denne metode er baseret på vækst fordel af muterede suppressor delpopulation i den flydende kultur, som kan blive overvåget af en automatiseret pladelæseren. Mating og meiose bruges kun, hvis man gerne vil rydde op i den genetiske baggrund eller bekræfte tilstedeværelsen af monogene alleler af undertrykkerne før hele-genome sequencing. Hvis den undertrykkelse fænotype er forårsaget af en enkelt mutation, adskille suppressor fænotype 2:2 efter tilbagekrydsning med forældrenes stammer. Suppressor mutationer kan derefter identificeres ved hjælp af hele-genome sequencing. Vi foreslår, at denne metode kan anvendes til screening undertrykkere i alle mikroorganismer, der kan vokse til en stor befolkningsgruppe i flydende kultur.
Protokollen beskrevet her repræsenterer en roman og simpel skærm for spontan suppressor mutationer kan påvises gennem fænotypiske inddrivelse af mutationer giver langsom vækst i fission gær, en fænotype karakteristiske af over 400 gener i S. pombe, den funktion af mange af dem forbliver ukendt2,32. Tidligere metoder har taget andre tilgange til at screene for suppressor mutationer i mikroorganismer, herunder brugen af mutagener21, eller anvendelsen af et temperatur skift i temperatur-følsomme mutant baggrunde33. Derimod viser denne protokol, fænotypiske nyttiggørelsen sker uden yderligere miljømæssige/kemiske indblanding og fremhæver fitness fordel af stigende undertrykkelse mutationer i sidste ende at overtage de ressourcer til rådighed i væske kultur. Denne skærm lader isolering af både bypass overspændingsbeskyttere eller interaktion undertrykkerne, fordi det er effektivt til både tab af funktion mutationer som elf1∆ eller fal1∆ og punktmutationer såsom clr6-1, så længe mutanterne demonstrere fitness defekter i flydende kultur.
Hidtil har alle gendannede S stammer, som vi har undersøgt demonstreret varierende grader af fænotypiske opsving. Som registreret gennem genetisk passage, den gendannede fænotype tilskrives en enkelt genetisk element og er arvelige (eksempler vist i figur 2). Dette er en af de mest betydningsfulde fordele ved denne metode i forhold til kemikalie- eller UV-baserede suppressor skærme, som ofte målrette flere genomisk loci. Det er almindeligt at observere én eller to kolonier inddrives ud af 16 kolonier/stamme (omkring 10%) inden for en uge. Vi bemærkede imidlertid, at visse mutanter, såsom tab af funktion af Rrp6, nuklear-specifikke exosome underenheden, aldrig gendannet til den næsten vildtype vækstrate observeret i elf1Δ celler31. Det er sandsynligt, at funktionen af Rrp6 kun kan blive delvist opvejet af undertrykkerne, i modsætning til funktionen i andre mutanter testet, herunder fal1∆, som blev vist sig at forårsage en alvorlig meiotiske fejl gennem sin vigtige funktion i lovgivningsmæssige splejsning34. Vi mener, at alternative suppressor screening-metoder ville være underlagt det samme problem, når yfg er unikke, ikke-udskiftelig rolle i cellevækst.
Før du udfører genomisk sekventering, er det optimale til back-cross fænotype gendannede kolonierne, identificeret fra Pladelæser, med de forældre stammer til at klare den genetiske baggrund og få biologiske replikater. Derudover identificerer dybt hele-genome sequencing hundredvis af enkelt nucleotid ændringer, hvoraf de fleste ikke er ens mellem biologiske replikater, der er af begrænset interesse for screening. For eksempel, fandt vi i alt 660 genomisk ændringer på tværs af alle tre kromosomer mellem de to elf1Δ P og de fem forskellige S stammer (figur 3). Vi ikke almindeligt observere identiske mutationer mellem sekventeret biologiske replikater af hver stamme, tyder på, at enten nye mutationer kan opstå under dyrkning af elf1Δ celler før genomiske biblioteket konstruktion eller tilfældige fejl kan være indført under den bibliotek opbygning og sekventering. Derfor er isolerer mutationer, der er konsistent på tværs af biologiske replikater et vigtigt aspekt i den succesfulde identifikation af undertrykkerne bruger hele-genome sequencing.
Vi identificerede og bekræftet to undertrykkere i cd’er regioner i fem sekventeret S stammer. Selv om mutationer i SPBPJ4664.02 blev fundet i både S-A1 og S-A2 stammer, er det usandsynligt, at SPBPJ4664.02 er en gyldig suppressor, fordi S-A1 og S-A2 ikke indeholder en suppressor på samme gen som den ikke supplerende med hinanden ( data ikke vist). Vi også ikke bekræfte rli1 i S-A3, hvilket ikke Co adskille med S fænotype når backcrossed med elf1Δ. Alternativt, fandt vi specifikke mutationer i ikke-kodende regioner i S-A1, S-A2 og S-A3. Det er muligt, at disse ændrede ikke-kodende genomisk regioner afhjælpe elf1Δ fænotype, som vil blive behandlet i vores fremtidige undersøgelser. I forhold til traditionelle metoder såsom en kobling, analyse, som kan tage år at kortlægge en genetisk mutation, identificeret vi to overspændingsbeskyttere senest to måneder efter at have bekræftet, at en monogene element forårsaget S fænotype. Med den hurtige udvikling af hele-genome sequencing technology er vi optimistiske, at denne metode vil være mere effektivt at identificere konsistente genetiske mutationer i en overskuelig fremtid.
I Resumé giver denne protokol trinvise anvisninger for at med held identificere suppressor mutationer for enhver gene af interesse med en langsomt voksende defekt i flydende kultur. Enkelheden i dette assay tillader for den omfattende screening af flere genetiske baggrunde af interesse med lidt hands-on træning. Der er plads til yderligere automatisere processen ved hjælp af en flydende håndtering robot til at udføre de daglige fortyndinger. Da laboratoriet manipulation af mikroorganismer kræver nødvendigvis vækst i flydende kultur, en proces, der er i sagens natur selektiv til fitness, foreslår vi, at denne protokol kan anvendes bredt til andre store befolkning modelorganismer som bakterier og andre gær arter.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af den nationale Institute General Medical Sciences, tilskud 1R15GM119105-01-K.Z. Vi takker alle korrekturlæsere for indsigtsfulde kommentarer. Vi takker også James Tucker, Alicia Anderson, Elizabeth sort og Glen Marrs for diskussion og kommentarer på dette håndskrift.
Adenine, Powder | Acros Organics | 147441000 | Use at 75 mg/L to make liquid and solid rich media (YEA) |
Bacteriology Petri Dish | Corning, Falcon | C351029 | 100×15mm, use to grow strains to single colonies on solid rich media |
D-Glucose Anhydrous, Powder | Fisher Chemical | D16-1 | Use at 30 g/L to make liquid and solid rich media (YEA) |
Difco Agar, Granuated | Becton, Dickinson and Co. | 214530 | Use at 20 g/L to make solid rich media (YEA) |
DNA extraction buffer | 2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1mM Na2-EDTA | ||
Focused-ultrasonicator | Covaris Inc. | S220 | Alternatively, use QSonica Q800R sonicator/DNA and chromatin shearing system |
Gen5 Data Collection and Analysis Software | Biotek, Inc. | GEN5SECURE | Or equivalent, must be compatible with the micro-plate reader, use to export data readings from the micro-plate reader |
Hydrochloric Acid 1N, Liquid | Fisher Chemical | SA48-4 | Use to adjust pH to 5.5 in liquid and solid rich media |
Liquid Rich Media (liquid YEA) | 30 g/L D-Glucose, 5 g/L Yeast Extract, 75 mg/L Adenine, pH adjusted to 5.5 with 1 M HCl | ||
Microplate Reader, Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader | Biotek, Inc. | BTH1MG | Or equivalent, must read visible light at 600nm wavelength range |
Rich Media agar plates (YEA plates) | 30 g/L D-Glucose, 5 g/L Yeast Extract, 75 mg/L Adenine, 20 g/L Agar, pH adjusted to 5.5 with 1 M HCl. | ||
RNase A/T1 mix | Thermo Fisher Scientific | EN0551 | Use according to manufacturer recommendation |
Sterile Polystyrene Inoculating Loop | Corning, Inc. | OS101 | Or equivalent, use to transfer colonies from agar plates to 96-well plate |
Sterile workspace and burners | |||
Tissue Culture Plate, 96-well Optical Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning, Falcon | C353072 | Or equivalent, must have optical flat bottom for micro-plate ready |
TruSeq DNA PCR-Free LT/HT Library Prep Kit | Illumina, Inc. | 20015962 | Use to prepare the whole-genome sequencing library |
Yeast Extract, Powder | Fisher Chemical | BP1422-500 | Use at 5 g/L to make liquid and solid rich media (YEA) |