Gli embrioni di pesce zebra vengono utilizzati per valutare la tossicità dei composti chimici. Si sviluppano esternamente e sono sensibili alle sostanze chimiche, consentendo il rilevamento di sottili cambiamenti fenotipici. L'esperimento richiede solo una piccola quantità di composto, che viene aggiunto direttamente alla piastra contenente embrioni, rendendo il sistema di test efficiente e conveniente.
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Articolo metodologico
Rapida valutazione della tossicità dei composti chimici utilizzando gli embrioni di pesce zebra
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il pesce zebra è un organismo modello di vertebrato ampiamente utilizzato per la malattia e la scoperta di farmaci basati sul fenotipo. Il pesce zebra genera molti figli, ha embrioni trasparenti e rapido sviluppo esterno. Gli embrioni di pesce zebra possono quindi essere utilizzati anche per la rapida valutazione della tossicità dei farmaci preziosi e disponibili in piccole quantità. Nel presente articolo, viene descritto un metodo per lo screening efficiente della tossicità dei composti chimici utilizzando embrioni post-fecondazione di 1-5 giorni. Gli embrioni sono monitorati da stereomicroscopiper per studiare i difetti fenotipici causati dall'esposizione a diverse concentrazioni di composti. Vengono inoltre determinate concentrazioni letali semimassi (LC50) dei composti. Il presente studio ha richiesto 3-6 mg di un composto inibitore, e l'intero esperimento richiede circa 8-10 h per essere completato da un individuo in un laboratorio con strutture di base. Il protocollo attuale è adatto per testare qualsiasi composto per identificare effetti tossici o fuori bersaglio intollerabili del composto nella fase iniziale della scoperta di farmaci e per rilevare sottili effetti tossici che possono essere persi nella coltura cellulare o in altri modelli animali. Il metodo riduce i ritardi procedurali e i costi dello sviluppo di farmaci.
Introduzione
Lo sviluppo di farmaci è un processo costoso. Prima che un singolo composto chimico è approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) e L'Agenzia europea dei medicinali (EMA) diverse migliaia di composti sono sottoposti a un costo di oltre un miliardo di dollari1. Durante lo sviluppo preclinico, la maggior parte di questo costo è necessaria per la sperimentazione animale2. Per limitare i costi, i ricercatori nel campo dello sviluppo di farmaci hanno bisogno di modelli alternativi per lo screening di sicurezza dei composti chimici3. Pertanto, nella fase iniziale dello sviluppo del farmaco, sareb....
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Protocollo
La struttura centrale del pesce zebra della Tampere University ha un'autorizzazione di stabilimento concessa dal National Animal Experiment Board (ESAVI/7975/04.10.05/2016). Tutti gli esperimenti che utilizzano embrioni di pesce zebra sono stati effettuati secondo il governo provinciale della Finlandia orientale, il Dipartimento sociale e sanitario del protocollo di unità di servizio regionale di Tampere - LSLH-2007-7254/Ym-23.
1. Impostazione dei serbatoi di accoppiamento per il pesce zebra durante la notte
- Mettere 2-5 pesci zebra maschi adulti e 3-5 pesci zebra femminile adulti in serbatoi di accoppiamento durante la notte. (L'a....
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Risultati
La parte critica della valutazione della tossicità è la sperimentazione di diverse concentrazioni di uno o più composti chimici in un singolo esperimento. All'inizio, selezionare i composti per la valutazione della tossicità, il numero di concentrazioni da testare per ogni composto e, di conseguenza, creare un grafico (Figura 3). Abbiamo usato un colore univoco per ogni composto per organizzare gli esempi (Figura 3). L'uso di mar.......
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Discussione
Il test di tossicità in vitro con cellule coltivate è in grado di rilevare la sopravvivenza e gli studi morfologici delle cellule fornendo informazioni limitate sulla tossicità indotta dal composto di prova. Il vantaggio dello screening della tossicità dei composti chimici che utilizzano embrioni di pesce zebra è la rapida individuazione di cambiamenti fenotipici indotti chimicamente in un intero animale durante lo sviluppo embrionale in un organismo modello pertinente. Circa il 70% dei geni umani che codificano.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno segnalato un potenziale conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Il lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Sigrid Juselius Foundation (SP, MP), della Finnish Cultural Foundation (AA, MH), dell'Accademia della Finlandia (SP, MP), della Orion Farmos Foundation (MH), della Fondazione Tampere Tuberculosis (SP, MH e MP) e della Fondazione Jane e Aatos Erkko (SP e MP) ). Ringraziamo i nostri collaboratori italiani e francesi, il professor Supuran, e il professor Winum, per aver fornito inibitori all'andradica carbonica per la valutazione della sicurezza e della tossicità per scopi di sviluppo di farmaci anti-TB e anti-cancro. Ringraziamo Aulikki Lehmus e Marianne Kuuslahti per l'assistenza tecnica. Ringraziamo anche Leena Makinen ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastre a 24 pozzetti | Bilancia Nunc | Thermo Scientific | |
| (Bilancia) | Bilancia KERN | PLJ3000-2CM | |
| (Bilancia) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT. Baker | RS421910024 | |
| Sonda Dissezione | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germania | D4540 | |
| Provette Falcon 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| Metilcellulosa ad alto peso molecolare | Sigma Aldrich, Germania | M0262 | |
| Incubatrice per larve di pesce zebra | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Provette per microcentrifuga | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffina Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pipetta Pasteur | Sarstedt | 86.1171 | |
| Piastra di Petri | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Piastre di Petri | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipetta (1 mL e 200 μ L) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Piastre 24 pozzetti | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscopio/Telecamera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 fiale a colori | |
| (1,5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB ceppi | ZIRC | ZL1 |
Riferimenti
- Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes. Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).
- Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A.....
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Ristampe e permessi
