Articolo metodologico

Cromatina Immunoprecipitazioni Analisi Utilizzando Nucleasi Micrococal nelle cellule di Mammaliana

DOI:

10.3791/59375

⸱

10 maggio 2019

 , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Beckman Research Institute of City of Hope

In questo articolo

Sommario

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L'immunoprecipitazioni della chromatina (ChIP) è un potente strumento per comprendere i meccanismi molecolari della regolazione genica. Tuttavia, il metodo comporta difficoltà nell'ottenere la frammentazione della cromatina riproducibile mediante tosatura meccanica. Qui, forniamo un protocollo migliorato per un saggio ChIP utilizzando la digestione ezimatica.

Abstract

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Per esprimere i fenotipi cellulari negli organismi, le cellule viventi eseguono l'espressione genica di conseguenza e i programmi trascrizionali svolgono un ruolo centrale nell'espressione genica. Il macchinario trascrittorio cellulare e le sue proteine di modificazione della cromatina si coordinano per regolare la trascrizione. Per analizzare la regolazione trascrizionale a livello molecolare, sono disponibili diversi metodi sperimentali come lo spostamento della mobilità elettroforetica, i saggi di immunoprecipitazioni transitori e cromatina (ChIP). Descriviamo un saggio ChIP modificato in dettaglio in questo articolo a causa dei suoi vantaggi nel mostrare direttamente le modifiche degli istoni e le interazioni tra proteine e DNA nelle cellule. Uno dei passi chiave di un saggio ChIP di successo è la tosatura della cromatina. Anche se la sonicazione è comunemente usata per la tosatura della cromatina, è difficile identificare le condizioni riproducibili. Invece di tosare la cromatina mediante sonicazione, abbiamo utilizzato la digestione enzimatica con nucleasi micrococcica (MNase) per ottenere risultati più riproducibili. In questo articolo viene fornito un semplice protocollo ChIP assay usando MNase.

Introduzione

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L'espressione genica nelle cellule dei mammiferi è regolata in modo stretto e dinamico, e la trascrizione è uno dei passi chiave. La trascrizione genica è regolata principalmente da fattori di trascrizione e istoni. Un fattore di trascrizione è una proteina che si lega a specifiche sequenze di DNA e controlla la trascrizione genica. Questi fattori promuovono o inibiscono il reclutamento di RNA polimerasi II (PolII), che avvia la sintesi di mRNA dal DNA genomico come modello1. Le modifiche istonicome l'acetilazione e la metilazione dei residui della coda istone irto influenzano positivamente e negativamente la trascrizione genica cambiando la struttura della cromatina2. Poiché le alterazioni nell'espressione genica influenzano il contesto cellulare, è essenziale esaminare i meccanismi molecolari con cui la trascrizione è regolata.

Ad oggi, sono disponibili diversi metodi per studiare la regolazione della trascrizione genica. L'analisi elettroforetica della mobilità (EMSA), chiamata anche analisi del cambio di gel, viene utilizzato per analizzare un'interazione proteina-DNA3. Un estratto nucleare proveniente da cellule di interesse viene incubato con una sonda di DNA con etichettatura isotoma radioattiva (ad esempio, 32P) ed elettroforise su un gel poliacrilammide. Il suo autoradiogramma mostra che il complesso DNA-proteinmi migra più lentamente della sonda in un gel. In presenza di un anticorpo contro la proteina, il complesso DNA-protein-anticorpo migra in un gel più lentamente del complesso DNA-protein. Questa banda supershiftata rivela un legame specifico tra il DNA e la proteina. Tuttavia, EMSA determina solo una specifica interazione DNA-proteina in un sistema privo di cellule, e quindi rimane sconosciuto se l'interazione controlla la trascrizione nelle cellule viventi. Il saggio transitorio del reporter, comunemente chiamato luciferasi reporter assay, è stato sviluppato per affrontare la regolazione dell'espressione genica nelle cellule. Tipicamente, una regione genomica a monte di un gene di interesse viene inserita in un plasmide reporter, trascinata transitoriamente in cellule e viene misurata l'attività del reporter. Una varietà di mutanti delezione consente l'identificazione delle regioni che sono responsabili della regolazione genica. Anche se un saggio reporter è uno strumento utile per identificare i fattori di trascrizione e rilegare le sequenze di DNA che controllano la trascrizione, questo metodo ha un grave svantaggio in quanto un plasmide reporter è privo di struttura cromatica e non riflette "reale" macchinari per la trascrizione. Inoltre, le modifiche ai istoni non possono essere determinate dal sistema.

Lo sviluppo del metodo di immunoprecipitazioni della cromatina (ChIP) si è basato sui rapporti di Jackson e Chalkley che la fissazione "intera cellula" con formaldeide conservava la struttura della cromatina4,5. Da allora, molte tecniche correlate sono state sviluppate e migliorate6. Nei saggi ChIP, le cellule sono fissate con formaldeide per collegare in modo incrociato DNA e proteine. La cromatina viene frammentata e quindi immunoprecipitata con anticorpi di interesse. Il complesso immunitario viene lavato e il DNA viene purificato. L'amplificazione PCR con primer destinati a una particolare regione del genoma rivela l'occupazione di proteine di interesse nel genoma.

Anche se ChIP è un potente strumento per identificare le interazioni di proteine come fattori di trascrizione e istoni modificati con il DNA, il metodo comporta alcune difficoltà, come una fase di frammentazione della cromatina, in pratica. La Sonicazione è stata ampiamente utilizzata per la tosatura della cromatina; tuttavia, è ingombrante identificare le condizioni riproducibili. Il trattamento nucleale micrococcale (MNase) è un metodo alternativo per la tosatura della cromatina. MNase è un endo-exonuclease che digerisce DNA e RNA a doppio filamento, a filamento singolo, circolare e lineare. È relativamente facile determinare le condizioni, comprese le quantità di cromatina e enzima, temperatura e tempo di incubazione, per la frammentazione ottimale della cromatina. Abbiamo modificato e semplificato i protocolli esistenti e abbiamo stabilito un metodo semplice e riproducibile. Questo documento fornisce il protocollo per un saggio ChIP che utilizza MNase nelle cellule dei mammiferi.

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Protocollo

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1. Preparazione dei reagenti

  1. Soluzione di paraformaldeide (PFA) del 18,5%. Aggiungere 0,925 g di PFA, 4,8 mL di acqua (utilizzare acqua ultrapurificata per tutto il protocollo) e 35 L da 1 M KOH in un tubo di plastica conica da 50 mL. Chiudere il tappo e riscaldare il tubo in un becher di vetro da 400-600 mL contenente circa 200 mL di acqua utilizzando un forno a microonde. Rimuovere il tubo prima che l'acqua inizi a bollire e vortice il tubo per sciogliere PFA. Lasciare raffreddare la PFA a temperatura ambiente e conservarlo sul ghiaccio.
    NOT: Ripetere il riscaldamento e la miscelazione fino a quando il PFA non si scioglie completamente. Preparare la soluzione PFA immediatamente prima del collegamento incrociato (passaggio 2.1.3).
  2. Crea una soluzione di glicina da 1,25 M. Sciogliere 14,07 g di glicina in 150 mL d'acqua e filtrare attraverso un filtro di 0,22 m di dimensioni porose. Conservare a 4 gradi centigradi.
  3. Creare il buffer di lisi delle celle ChIP. Sciogliere 378 mg di PIPES, 10,6 mL di 2 M KCl e 1,25 g di poli(etileneossia) ramificata in acqua. Regolare il pH a 8,0 con 1 M KOH a 4 gradi centigradi e fino a 250 mL. Filtrare attraverso un filtro di 0,22 m di dimensioni pori e conservare a 4 gradi centigradi.
  4. Creare buffer di digestione nuclease micrococcale (MNase). Per fare 1 mL, mescolare 0,1 mL di 10x Tampone di digestione MNase, 10 -L di 100x soluzione BSA, 10 -L di 0,1 M dithiothreitol e 0,88 mL di acqua.
  5. Fare 1 M NaHCO3. Sciogliere 4,2 g di NaHCO3 in 50 mL di acqua e filtrare attraverso un filtro di 0,22 m di dimensioni pori. Conservare a temperatura ambiente.
  6. Fai 10% solfato di dodecyl di sodio (SDS). Sciogliere 5 g di SDS in 50 mL di acqua. Conservare a temperatura ambiente.
  7. Fare buffer di eluizione. Mescolare 15 L di 1 M NaHCO3, 15 l di 10% SDS e 120 L di acqua per ottenere 150 L di buffer di eluizione per un campione.
    NOT: Aumentare i volumi proporzionalmente a seconda del numero di campioni.
  8. Crea una soluzione di acetato di sodio da 3 M (pH 5.2). Sciogliere 24,6 g di anidrodo di acetato di sodio in acqua. Regolare il pH a 5,2 con l'acido acetico e fino a 100 mL. Filtrare attraverso un filtro di 0,22 m di dimensioni pori e conservarlo a temperatura ambiente.

2. Determinazione delle condizioni di digestione di MNase

NOT: Nel passaggio 2 del protocollo, viene presentato un esempio utilizzando VCaP, cellule tumorali della prostata umana. Eventuali linee cellulari di mammiferi possono essere utilizzate; vedere Nota ai passaggi.

  1. Preparazione della cromatina collegata
    1. Mantenere le cellule VCaP in glucosio alto DME, integrate con 10% siero bovino fetale (FBS) a 37 gradi centigradi in un incubatore di anidride carbonica. Cellule VCaP di semi a 4 x 106 cellule in sei piatti 6 cm in 4 mL di coltura e coltura per 3 giorni.
      NOT: Utilizzare i supporti di impostazioni cultura appropriati per ogni riga di cella. Fino a 10 x 106 cellule possono essere semiin un piatto di 6 cm o 10 cm. Per le cellule sospese, le cellule di semi nei flaconi T25. Il numero di piatti o flaconi dipende da quante dosi vengono testate per la digestione di MNase. Se vengono testate 4 dosi, preparare 6 piatti o fiasche. Vedere anche il passaggio 2.2.
    2. Staccare le cellule VCaP da un piatto utilizzando la trypsin e contare la cella. Calcolare il numero di cellulare in un piatto. Per le celle sospese, rimuovi una piccola quantità di sospensione cellulare da un pallone e numero di cella di conteggio.
    3. Aggiungere 0,229 mL di 18,5% PFA a un piatto di 6 cm in 4 mL di mezzi di coltura ad una concentrazione finale dell'1%. Ruotare delicatamente ma accuratamente un piatto o una fiaschetta per distribuire uniformemente l'PFA. Incubare a temperatura ambiente per esattamente 10 min.
      NOT: In questa fase, la cromatina e le proteine sono interconnesse. Poiché la PFA è tossica, eseguire questo passaggio in una cappa di fumi chimici e utilizzare adeguate attrezzature di protezione personale.
    4. Dopo 10 min, aggiungere 0,47 mL di soluzione di glicina da 1,25 M ad una concentrazione finale di 125 mM. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
      NOT: La glicina neutralizza l'eccesso di PFA per arrestare un ulteriore crosslinking.
    5. Anpirati fordeide/glicina/cultura media. Lavare le cellule aggiungendo 4 mL di salina con buffer fosfato (PBS) due volte. Per le cellule sospese, trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL e centrifugare a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e aggiungere un volume medio di PBS e sospendere completamente. Ripetere questo passaggio. Smaltire correttamente i rifiuti liquidi poiché contengono formaldeide.
    6. Preparare PBS contenente proteasi e forista inibitore di fosfosi (PIC) aggiungendo 1/100 volume di 100x PIC a PBS. Aspirare PBS da un piatto e aggiungere 1 mL per piatto di PBS contenente PIC. Raschiare le cellule e trasferire la sospensione cellulare in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL. Per le celle sospese, è sufficiente trasferire la sospensione in un tubo da 1,5 mL.
    7. Centrifuga tubi a 3.000 x g per 5 min a temperatura ambiente per recuperare il pellet cellulare. Rimuovere completamente il PBS utilizzando una pipetta. Registrare il numero di cella per tubo e conservare il pellet della cella a -80 gradi centigradi.
  2. Lisi e digestione di MNase
    NOT: Il volume del reagente nei passaggi seguenti si basa su un tubo contenente 6 x 106 celle. Regolare il volume del reagente in modo proporzionale a seconda del numero di cella; quando un tubo contiene 2 x 106 celle, utilizzare 100 l of ChIP cell lysis buffer (passaggio 2.2.1), buffer di digestione MNase (passaggio 2.2.3) e buffer di diluizione ChIP (passaggio 2.2.5) e 10 L di 0,5 M EDTA (pH 8.0) (passaggio 2.2.4).
    1. Scongelare il pellet cellulare immagazzinato (cellule VCaP, contenente 6 x 106 cellule per tubo) preparato al punto 2.1.7 sul ghiaccio. Preparare il buffer di lisi della cella ChIP integrato con PIC aggiungendo 1/100 volume di 100 volte PIC al buffer. Aggiungere 300 l di buffer di lisi della cella ChIP integrato con PIC e sospendere accuratamente il pellet. Vorticare il tubo per 15 s e incubare la sospensione sul ghiaccio per 10 min.
    2. Centrifuga a 9.000 x g per 3 min a 4 gradi centigradi e rimuovere completamente il supernatante. Risospendere il pellet in 300 -L di buffer di digestione MNase.
    3. Diluire MNase (2.000 unità gel/L) con tampone di digestione MNase per dare 50 unità di gel/L. Aggiungere 0, 0,5, 1, 2, 4 luna di 50 unità di gel/ l una di MNase alla sospensione e incubare a 37 gradi centigradi per esattamente 10 min, mescolando per inversione ogni 2,5 min.
      NOTA: la tabella 1 mostra le quantità ottimali di MNase in diverse linee cellulari.
    4. Aggiungete 30 di EDTA di 0,5 M (pH 8,0) per terminare brevemente la digestione e il vortice di MNase. Incubare per 5 min sul ghiaccio. Centrifuga a 9.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e rimuovere completamente il supernatante.
    5. Preparare il buffer di diluizione ChIP integrato con PIC aggiungendo 1/100 volume di 100 volte PIC al buffer. Risospendere il pellet in 300 l di buffer di diluizione ChIP integrato con PIC.
    6. Sonicare la sospensione sul ghiaccio utilizzando un sonicatore dotato di una sonda a microtip. Utilizzare le seguenti condizioni di sonicazione: ampiezza 2, tempo elaborato 15 s, impulso ON 5 s, impulso OFF 30 s. Prendere 1 l'l delle sospensioni e accorciare su un vetrino e osservarle con un microscopio. Assicurarsi che la struttura della cella sia quasi spezzata.
      NOT: La figura 1A mostra microfotografie rappresentative della sospensione cellulare VCaP prima e dopo la sonicazione. Questo passo è per rilasciare la cromatina digerita nel supernatante rompendo le membrane nucleari. Un'impostazione di potenza deve essere regolata a meno del 5% della potenza massima e provare sonicazione per 5 s tre volte con più di un intervallo di 30 s. Se il controllo della potenza è disponibile, regolare l'impostazione della potenza a 5 W ed elaborare i campioni per il totale di 15 s come accennato in precedenza per dare potenza totale di 70-75 J. Controllare se la struttura cellulare è rotta come accennato in precedenza. Se non è sufficiente, ripetere ancora una volta. La condizione descritta in precedenza è praticamente applicata a tutte le linee cellulari testate.
    7. Centrifuga a 9.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi, trasferire il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml e risparmiare 20 l della cromatina digerita per la fase 2.3. Conservare il resto a -80 gradi centigradi.
  3. Crosslinking inverso, purificazione del DNA e analisi della cromatina digerita
    1. Aggiungete 75 l'acqua, 4 luna di 5 M NaCl e 1 l di proteinasi K a un tubo a vite da 1,5 ml. Aggiungere 20 l di cromatina digerita da varie condizioni di digestione di MNase preparate al passo 2.2.7 ai tubi contenenti acqua, NaCl e proteine K. Chiudere il tappo strettamente, mescolare completamente e incubare il tubo a 65 gradi durante la notte.
      NOT: Questo passo è per la rimozione del collegamento tra proteine e DNA.
    2. Preparare due tubi di microcentrifuga da 1,5 ml per condizione. Aggiungere 100 l di fenolo:cloroformio:isoamylalcohol (25:24:1) (PCI) a un tubo da 1,5 mL. Aggiungere 10 -L di acetato di sodio da 3 M (pH 5,2) e 2 luna di glicogeno in un altro tubo.
      NOT: L'uso di cloroformio:isoamylalcohol non è necessario7. L'aumento del volume può provocare un basso recupero del DNA dopo la precipitazione dell'etanolo8.
    3. Centrifugare brevemente il tubo contenente cromatina digerita dal punto 2.3.1 e aggiungere 100 L di PCI. Chiudere il tappo strettamente, e vortice vigorosamente per formare emulsione. Centrifugare il tubo alla massima velocità (ad esempio, 20.000 x g) per 30 s a temperatura ambiente.
    4. Prendere con attenzione la fase superiore contenente il DNA e aggiungerla al tubo contenente PCI preparato al punto 2.3.2. Vortice vigorosamente e centrifugare il tubo come passo 2.3.3.
      NOT: Se la fase inferiore è contaminata, centrificare nuovamente il tubo, o rimuovere la maggior parte della fase inferiore prima, centrificare il tubo, e prendere la fase superiore.
    5. Prendere con attenzione la fase superiore come descritto al punto 2.3.4 e aggiungerlo al tubo contenente acetato di sodio e glicogeno preparato al punto 2.3.2. Aggiungere 250 -L di etanolo. Mescolare per inversione e incubare per 10 min a temperatura ambiente. Centrifugare il tubo alla massima velocità (ad esempio, 20.000 x g) per 30 min a 4 gradi centigradi.
      NOT: L'incubazione della soluzione a temperatura ambiente non influisce sul recupero del DNA8,9.
    6. Confermare i pellet sul fondo del tubo. Rimuovere con cura il supernatante in modo da non disturbare il pellet e aggiungere 500 lun di 70% di etanolo. Centrifugare il tubo alla massima velocità (ad esempio, 20.000 x g)per 5 min a 4 gradi centigradi.
    7. Rimuovere completamente il supernatante e asciugare il pellet per circa 5 min a temperatura ambiente. Sciogliere il pellet in 20 , luna di 10 mM Tris HCl/1 mM EDTA (pH 8.0) (TE). Misurare la concentrazione del DNA utilizzando uno spettrofotometro UV.
    8. Mescolare 0,5 g di DNA con un colorante di carico gel e applicare al 2% gel di agarose. Elettroforizzare i campioni a 100 V nel tampone tris-acetato-EDTA fino a quando il colorante viola non è migrato ai due terzi del gel e macchiare un gel con 0,5 g/mL di bromuro di etidio per 10 min. Scatta una foto del gel.
      NOT: Vedere Figura 2 per i dettagli.

3. ChromatinImmunoprecipitazionation

  1. Preparazione della cromatina digerita
    1. Preparate lecellule. Per le cellule aderenti, semi 2-10 x 106 cellule per piatto in 2 piatti (6 cm o 10 cm) per gruppo di trattamento e consentire alle cellule di attaccarsi al fondo dei piatti per più di 1 giorno. Per le cellule sospese, semi in 2 flaconi T25 per gruppo di trattamento. Trattare le cellule come desiderato.
    2. Prendere un piatto o un pallone da ogni gruppo e contare il numero di cella come descritto nel passaggio 2.1.2. Preparare la cromatina incrociata come indicato nei passaggi 2.1.3-2.1.7.
    3. Eseguire il lyse della pellet cellulare e della digestione di MNase come descritto nei passaggi 2.2.1-2.2.7. Utilizzare la quantità ottimale di MNase per digerire la cromatina come determinato nel passaggio 2. Conservare la cromatina digerita a -80 gradi centigradi.
    4. Collegamento incrociato inverso 20 - L di cromatina digerita e purificailtà del DNA come descritto al punto 2.3.8. Misurare la concentrazione del DNA come descritto al punto 2.3.7. Elettroforezza i campioni nel gel di agarose del 2% per controllare la dimensione della cromatina digerita come accennato al punto 2.3.
      NOT: La concentrazione del DNA è identica a quella della cromatina digerita immagazzinata preparata al punto 3.1.3.
    5. Diluire un campione di cromatina digerito inverso dal passo 3.1.4 per dare 10 ng/L con acqua e diluire in serie le concentrazioni di 1, 0,1 e 0,01 ng/L. Conservare a -20 .
      NOT: Questi esempi vengono utilizzati per gli standard PCR in tempo reale.
  2. Immunoprecipitazione
    NOTA: Nei passaggi 3.2-3.5 del protocollo, viene determinata l'occupazione anti-trimetilato istono H3 lisina 4 (H3K4me3) nelle cellule VCaP. Vedere anche Figura 3.
    1. Scongelare la cromatina digerita dal punto 3.1.3. Tieni tutti i campioni sul ghiaccio.
    2. Preparare il buffer di diluizione ChIP integrato con PIC aggiungendo 1/100 volume di 100 volte PIC al buffer. Diluire la cromatina digerita a 5 g/500 -L con buffer di diluizione ChIP integrato con PIC. Preparare 1.000 -l più extra per (1) IP con IgG non immune (Control IgG), (2) IP con H3K4me3.
    3. Aggiungete 5 -L di 5 g/g/500 di cromatina digerita a un tubo a vite da 1,5 ml come campione di ingresso (1% di un IP). Conservare il campione a -80 gradi centigradi.
    4. Aggiungete 500 l di una cromitina di sè/500 l a un tubo a vite da 1,5 mL come campione IP. Aggiungere 2 g di anticorpo al tubo. Chiudere il tappo e incubare il tubo a 4 gradi centigradi con una leggera miscelazione utilizzando una piattaforma a dondolo.
      NOT: Anche se la quantità ottimale di anticorpi deve essere determinata empiricamente, si raccomandano all'inizio 2 g per IP.
    5. Aggiungete 30 gradi di proteine ChIP-grade G perline magnetiche per IP. Incubare il tubo a 4 gradi centigradi per 2 h con una leggera miscelazione utilizzando una piattaforma a dondolo.
      NOT: Prelavaggio di perline magnetiche non è necessario.
  3. Lavare il complesso immunitario e invertire il crosslinking
    1. Ruotare brevemente il tubo dal punto 3.2.5. Mettere il tubo in un rack di polietilene contenente magneti di neodinium per 1 min. Rimuovere con attenzione il supernatante per aspirazione.
    2. Aggiungere 0,5 mL per tubo di tampone di lavaggio del complesso immunitario a basso sale. Disperdere le perline toccando delicatamente o vorticendo brevemente il tubo. Incubare il tubo a 4 gradi centigradi per 5 min con una leggera miscelazione utilizzando una piattaforma a dondolo. Dopo 5 min, ripetere il passaggio 3.3.1.
    3. Aggiungere 0,5 mL di un cuscinetto di lavaggio complesso immunitario ad alto sale per tubo. Disperse e lavate le perline come gradino 3.3.2. Dopo il lavaggio, ripetere il passaggio 3.3.1.
    4. Aggiungere 0,5 mL di LiCl immune complex wash buffer per tubo. Disperse e lavate le perline come gradino 3.3.2. Dopo il lavaggio, ripetere il passaggio 3.3.1.
    5. Posizionare il tubo in un rack magnetico per 1 min. Rimuovere completamente il rimanente supernatante.
    6. Aggiungere 150 l di tampone di eluizione al tubo. Vorticare il tubo per disperdere completamente le perline. Chiudere il tappo e incubare il tubo a 65 gradi centigradi per 30 min, mescolando per inversione o vortice ogni 5 min per disperdere accuratamente le perline.
    7. Durante l'incubazione, preparare un tubo a vite da 1,5 ml e aggiungere 6 M NaCl e 2 -L di proteinae K. Thaw 1% campione di input preparato al passo 3.2.3. Aggiungere 150 l di tampone di eluizione, 6 L di 5 M NaCl e 2 l di proteine K all'1% del campione di input.
    8. Dopo l'incubazione, girare lungo il tubo. Collocare il tubo in un rack magnetico per 1 min e trasferire il supernatante al tubo a vite contenente NaCl e proteinae K preparato al passaggio 3.3.7.
    9. Chiudere il tappo e vorticare tutti i campioni IP e di input per mescolare completamente. Incubare il tubo a 65 gradi durante la notte.
  4. Purificazione del DNA
    1. Preparare il tubo come descritto in 2.3.2 e aggiungere 150 L di PCI invece di 100 l. In un altro tubo, aggiungere 12 L di acetato di sodio da 3 M (pH 5,2) e 2 l una di glicogeno.
    2. Rimuovere il tubo dall'incubatrice. Girare verso il basso il tubo e aggiungere 150 l di PCI.
    3. Vortice vigorosamente il tubo per formare l'emulsione. Centrifugare il tubo alla massima velocità (ad es. 20.000 x g) per 30 s a temperatura ambiente.
    4. Trasferire con cura 140 l della fase superiore al tubo contenente PCI preparato al punto 3.4.1. Ripetere il passaggio 3.4.3.
      NOT: Vedere anche Nota nel passaggio 2.3.4.See also Note in step 2.3.4.
    5. Trasferire con cura 120 l di fase superiore al tubo contenente acetato di sodio e glicogeno preparato al passo 3.4.1.
      NOT: Vedere anche Nota nel passaggio 2.3.4.See also Note in step 2.3.4.
    6. Aggiungere 300 l di etanolo. Mescolare per inversione e incubare per 10 min a temperatura ambiente.
    7. Centrifugare il tubo alla massima velocità (ad esempio, 20.000 x g) per 30 min a 4 gradi centigradi. Lavare il pellet come descritto al punto 2.3.6.
    8. Dopo aver asciugato il pellet come descritto al punto 2.3.7, sciogliere il pellet in 50 gradi di TE. Conservare a -20 gradi centigradi.
  5. Rilevamento di frammenti di DNA tramite PCR in tempo reale
    1. Scongelare i seguenti campioni: (1) IP con Control IgG, (2) IP con anti-H3K4me3, (3) 1% campione di input. Scongelare anche 4 dosi di standard preparati nel passaggio 3.1.5 (totale di 7 campioni).
      NOT: Utilizzare gli standard dello stesso gruppo per la quantificazione delle quantità di DNA nei campioni di input e IP.
    2. Crea la soluzione pcR per 8 campioni. Mescolare 40 l di 2x supermix PCR in tempo reale, 8 litri ciascuno di 4 M, primer in avanti e inverso e 8 luna di acqua.
      NOT: Una miscela di reazione PCR contiene 5 volte luna di 2 volte il supermix PCR in tempo reale, 1 l ciascuno dei primir in avanti e indietro di 4 M e 1 l di acqua. Le sequenze di Primer sono elencate nella tabella 2.
    3. Soluzione di lavoro AliquotA 8 -L di PCR in un pozzo di una piastra PCR. Aggiungere 2 o l di campioni del passaggio 3.4.8 o gli standard del passaggio 3.1.5.
    4. Sigillare la piastra PCR ed eseguire la PCR utilizzando le seguenti condizioni: 1) 95 S per 3 min per la denaturazione iniziale, 2) 95 C per 10 s per la denaturazione, 3) 56 C per 30 s per l'annealing, 4) 72 S per 30 s per l'estensione e la raccolta dei dati , ripetere i passaggi da 2 a 4) per 55 cicli. Dopo il ciclismo, misurare una curva di fusione del prodotto PCR. Analizzare i dati.
      NOT: I dati non elaborati per la figura 3 sono riportati nella tabella 3. Calcolare la quantità iniziale (SQ) dei campioni utilizzando una curva standard. Moltiplicare l'Input SQ nell'1% per 100 per regolare un campione di input dell'1% su un IP per dare sQ in Input (Eq. 1) regolato. Dividere SQ nel campione IP per SQ regolato in Input per dare valore di input % (metodo di input percentuale, Eq. 2). Per calcolare l'arricchimento delle pieghe, dividere SQ in IP con anti-H3K4me3 per SQ in IP con controllo IgG (metodo di arricchimento piega, Eq. 3).
      SQ regolato nell'ingresso (SQ in ingresso 1%) x 100 (1)
      Media di immissione di H3K4me3 - 100 x (SQ in IP con anti-H3K4me3) / (SQ regolato in ingresso) (2)
      Arricchimento di piegatura di H3K4me3 (SQ in IP con anti-H3K4me3) / (SQ in IP con controllo IgG) (3)

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Risultati

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La digestione della cromatina è uno dei passaggi importanti per un saggio ChIP. Abbiamo usato MNase per digerire la cromatina per ottenere una miscela di oligomeri nucleosomi. Nella fase di digestione di MNase, MNase può passare attraverso la membrana nucleare e digerire la cromatina. Tuttavia, la cromatina digerita non può passare attraverso la membrana e rimane nei nuclei. Per liberare la cromatina digerita dai nuclei, è necessaria una breve sonicazione. Figura 1A mostra microfotografie pr...

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Discussione

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Anche se la sonicazione è comunemente usata per ottenere la cromatina frammentata, è dispendioso in termini di tempo e ingombrante identificare le condizioni riproducibili. In questo protocollo, abbiamo usato la digestione di MNase perché la digestione degli enzimi dovrebbe essere più facile identificare le condizioni riproducibili. Un breve passo di sonicazione dopo la digestione di MNase (vedi passo 2.2) è stato necessario per rompere la membrana cellulare e rilasciare la cromatina digerita. Pertanto, la potenza di son...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è supportata dalle royalties Genentech per City of Hope. Questo lavoro non è supportato in tutto o in parte dai National Institutes of Health.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,5 M EDTA (pH 8,0)Thermo ScientificAM9010
2 M KClThermo ScientificAM9010
2x iQ SYBR Green supermixBio-Rad1706862
5 M NaClThermo ScientificAM9010
50 bp Scala DNANew England BiolabsN3236S
AgarosioProdotto di ricerca InternazionaleA20090
Ottilfenossi poli(etileneossi)etanolo ramificatoMillipore SigmaI8896IGEPAL CA-630
Perle magnetiche di proteina G di grado ChIPTecnologia di segnalazione cellulare9006S
Tampone di diluizione per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)Millipore Sigma20-153Composizione del tampone: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM di NaCl.
Gel Caricamento Colorante Viola (6x)New England BiolabsB7024S
GlicinaBio-Rad161-0724Grado di elettroferesi
GlicogenoMillipore SigmaG176719-22 mg/mL
Cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi Halt, senza EDTA (100x)Thermo Scientific78445
Tampone di lavaggio del complesso immunitario ad alto contenuto di saleMillipore Sigma20-155Composizione del tampone: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 500 mM NaCl.
Anticorpo istone H3K4me3 (pAb)Motivo attivo39915
LiCl Immune Complex Wash BufferMillipore Sigma20-156Composizione del tampone: 0,25 M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% acido desossicolico (sale sodico), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8,1.
Tampone di lavaggio del complesso immunitario a basso contenuto di saleMillipore Sigma20-154Composizione del tampone: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 150 mM NaCl.
Magna GrIP Rack (8 pozzetti)Millipore Sigma20-400Qualsiasi tipo di supporto per la separazione magnetica compatibile con una provetta da 1,5 mL va bene.
Nucleasi micrococcicaNew England BiolabsM0247Sviene fornito con tampone 10x (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7,9 a 25 ° C) e 100x BSA (10 mg/mL)
NaHCO3JT Baker3506-01
IgG di coniglio normaleMillipore Sigma12-370
PIPESMillipore SigmaP6757
Proteinasi KMillipore Sigma3115887001
Sistema di PCR in tempo realeBio-RadCFX96, C1000
RNA pol II CTD anticorpo fosfo Ser5Motivo attivo39749
SDSBoehringer Mannheim100155di grado elettroferesi
Millipore SigmaS5636
Sonicatore dotato di una sonda a micropuntaQSONICAQ700Qualsiasi tipo di sonicatore compatibile con una provetta da 1,5 mL va bene.
Fenolo ultrapuro:Cloroformio:Alcool isoamilico (25:24:1, v/v)Thermo Scientific15593031pH 8.05
Acetato di sodio

Riferimenti

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Nucleasi micrococcicasaggio ChIPmodificazioni istonicheinterazioni proteina DNAframmentazione della cromatinadigestione con MNasilisi cellularepurificazione del DNA

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