Cluster di proteine recettoriali germinant in 'germinosomes' nella membrana interna di spore di Bacillus subtilis . Descriviamo un protocollo utilizzando super risoluzione di microscopia e fluorescenti di proteine reporter per visualizzare germinosomes. Il protocollo identifica anche domini di membrana interna di spore che sono preferenzialmente colorate con il colorante di membrana FM4-64.
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Articolo metodologico
Visualizzazione di Germinosomes e la membrana interna in Bacillus subtilis spore
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le piccole dimensioni delle spore e la relativamente bassa abbondanza di proteine di germinazione, causare difficoltà nelle loro analisi microscopiche mediante epifluorescenza. Microscopia di Super-risoluzione tridimensionale strutturato illuminazione (3D-SIM) è uno strumento promettente per superare questo ostacolo e rivelare i dettagli molecolari del processo di germinazione delle spore di Bacillus subtilis (Bacillus subtilis). Qui, descriviamo l'uso di un SIMcheck modificato (ImageJ)-processo di imaging 3D assistente e proteine reporter fluorescenti per microscopia SIM di germinosomes di b. subtilis spore, interumana delle proteine di germinazione. Presentiamo anche una procedura di imaging 3D-SIM (standard) per la colorazione delle membrane di spore di Bacillus subtilis FM4-64. Utilizzando queste procedure, abbiamo ottenuto la risoluzione insuperabile per la localizzazione di germinosome e mostrano che > 80% dei KGB80 di b. subtilis spore dormienti ottenute dopo la sporulazione su medium MOPS minimo definito hanno uno o due GerD-GFP e GerKB-mCherry fuochi. I fuochi luminosi erano anche osservato in FM4-64 macchiati immagini 3D-SIM spore suggerendo che domini lipidici della membrana interna di differenti fluidità probabile che esistano. Ulteriori studi che utilizzano la doppia etichettatura procedure con membrana coloranti e germinosome proteine reporter per valutare co-localizzazione e quindi ottenere una panoramica ottimale dell'organizzazione delle proteine di germinazione del bacillo nella membrana interna spora sono possibile.
Introduzione
Spore degli ordini Bacillales e Clostridiales sono metabolicamente dormienti e straordinariamente resistente ai regimi di decontaminazione duro, ma a meno che non germinano, non possono causare effetti deleteri in esseri umani1. In nutrienti germinant innescata germinazione di spore di Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), l'evento di iniziazione è germinant legame ai recettori germinant (GRs) situato nella membrana interna di spore (IM). Successivamente, il GRs trasdurre segnali alla proteina canale SpoVA anche situato nel IM. Questo provoca l'inizio dello scambio di spora core piridina-2,6-dicarbossilico (acido dipicolinico....
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Protocollo
1. b. subtillis sporulazione (Timing: 7 giorni prima dell'osservazione microscopica)
-
1 ° giorno
- Inoculare una coltura batterica su una piastra (tryptone di 1%, 0,5% di Estratto di lievito, 1% NaCl, 1% agar) agar di brodo di Luria-Bertani (LB)13 ed incubare per una notte a 37 ° C per ottenere singole colonie. Utilizzare il ceppo di Bacillus subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry gatto, gerD-gfp kan) e ceppo parentale sfondo PS4150 di b. subtilis (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) come descritto in precedenza7.
Nota:
- Inoculare una coltura batterica su una piastra (tryptone di 1%, 0,5% di Estratto di lievito, 1% NaCl, 1% agar) agar di brodo di Luria-Bertani (LB)13 ed incubare per una notte a 37 ° C per ottenere singole colonie. Utilizzare il ceppo di Bacillus subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry gatto, gerD-gfp kan) e ceppo parentale sfondo PS4150 di b. subtilis (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) come descritto in precedenza7.
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Risultati
Il protocollo attuale presenta una procedura di imaging microscopio SIM per le spore batteriche. Le procedure di preparazione di sporulazione e diapositiva sono state effettuate come mostrato nella Figura 1 prima di formazione immagine. Più tardi, sono state applicate le procedure di imaging e l'analisi sia per dim (proteina fluorescente etichettata proteine germinazione) e brillante spora (sonda lipofilica macchiato IM) campioni come indicato nel testo segue.......
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Discussione
Il protocollo presentato contiene una procedura di 3D-SIM standard per l'analisi di FM4-64 macchiato di spore di Bacillus subtilis che include la sporulazione, preparazione del vetrino e processi di imaging. Inoltre, il protocollo descrive un SIMcheck modificato (ImageJ)-assistita processo per microscopia SIM di germinosomes di spore di Bacillus subtilis etichettati con reporter fluorescenti di imaging 3D. La procedura di quest'ultima ci ha permesso di osservare questa sottostruttura dim con maggiore co.......
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Dichiarazioni
Conflitti di interesse non dichiarati.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Christiaan Zeelenberg per la sua assistenza durante l'imaging di SIM. JW riconosce il Consiglio di borsa di studio di Cina per una borsa di dottorato e grazie Irene Stellingwerf per il suo aiuto durante la fase primaria di imaging.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vetrini in vetro essiccati all'aria | Menzel Glä ser | 630-2870 | |
| APO TIRF N20R8 100&volte; obiettivo olio (NA=1.49) | |||
| B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) | |||
| B. subtilis PS4150 (PS832 Δ gerE::spc, Δ cotE::tet)Erlenmeyer | |||
| palloni da 1 L | Sigma-Aldrich | Z567868 | |
| Erlenmeyer palloni da 250 mL | Sigma-Aldrich | Z723088 | |
| FluoSpheres microsfere modificate con carbossilato | Invitrogen, 0.1 μ m | F8803 | |
| FM4-64 | Thermo Fisher Scientific | F34653 | |
| Histodenz gradiente di densità non ionica media | Sigma-Aldrich | D2158 | |
| ImageJ | |||
| iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera | Andor Technology | https://imagej.net/Welcome | |
| LB Agar | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Provette per microfuge 1,5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3451PK | |
| Software di imaging per microscopio | Nikon, Giappone | NIS-Element AR 4.51.01 | |
| MilliQ Acqua demineralizzata ultrapura Millipore | Milli-Q IQ 7003 | ||
| Microscopio | |||
| Flacone con tappo a vite in polipropilene 180 mL | Thermo Fisher Scientific | 75003800 | |
| Vetrini coprioggetti di precisione | Paul Marienfeld | 117650 | |
| Provette a fondo tondo 15 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM | |
| Provette con tappo a vite 50 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM |
Riferimenti
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).
- Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -Q. Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales. Annual Re....
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Ristampe e permessi
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