Articolo metodologico

Lipidomica e trascrittomica nelle malattie neurologiche

DOI:

10.3791/59423

⸱

18 marzo 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiological Chemistry, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo presenta un protocollo modulare per la lipidomica e la trascrittomica tissutale e la lipidomica plasmatica in modelli murini di malattie neurologiche che mirano ai lipidi sottostanti l'infiammazione e l'attività neuronale, i lipidi di membrana, i messaggeri a valle e gli enzimi / recettori che codificano per l'mRNA alla base della funzione lipidica. Vengono delineate le procedure di campionamento, elaborazione dei campioni, estrazione e quantificazione.

Abstract

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I lipidi fungono da interfaccia primaria per insulti cerebrali o stimoli favorevoli alle malattie neurologiche e sono un serbatoio per la sintesi dei lipidi con varie funzioni di segnalazione o ligando che possono sottolineare l'insorgenza e la progressione delle malattie. Spesso cambiando a livello presintomatico, i lipidi sono una fonte emergente di bersagli farmacologici e biomarcatori. Molte malattie neurologiche presentano neuroinfiammazione, neurodegenerazione ed eccitabilità neuronale come segni distintivi comuni, in parte modulati da specifici sistemi di segnalazione lipidica. L'interdipendenza e l'interrelazione della sintesi di vari lipidi richiede un'analisi multilipidica, multienzimatica e multirecettore al fine di ricavare i punti in comune e le specificità dei contesti neurologici e di accelerare il dipanarsi degli aspetti meccanicistici dell'insorgenza e della progressione della malattia. L'attribuzione di ruoli lipidici a regioni cerebrali distinte fa progredire la determinazione del fenotipo molecolare lipidico e della morfologia associata a una malattia neurologica.

Qui viene presentato un protocollo modulare adatto per l'analisi dei lipidi di membrana e dei segnali lipidici a valle insieme all'mRNA di enzimi e mediatori alla base della loro funzionalità, estratti da regioni cerebrali discrete che sono rilevanti per una particolare malattia e / o condizione neurologica. Per garantire un'accurata profilazione lipidomica comparativa, i flussi di lavoro e i criteri operativi sono stati ottimizzati e standardizzati per: i) campionamento cerebrale e dissezione delle regioni di interesse, ii) co-estrazione di più segnali lipidici e lipidi di membrana, iii) doppia estrazione lipidico/mRNA, iv) quantificazione mediante cromatografia liquida monitoraggio a reazioni multiple (LC/MRM) e v) profilazione standard dell'mRNA. Questo flusso di lavoro è suscettibile per le basse quantità di tessuto ottenute dal campionamento delle sottoregioni cerebrali funzionalmente discrete (cioè mediante punzonatura cerebrale), prevenendo così pregiudizi nell'analisi multimolecolare dovuti all'eterogeneità tissutale e / o alla variabilità animale. Per rivelare le conseguenze periferiche delle malattie neurologiche e stabilire letture molecolari traslazionali degli stati di malattia neurologica, il campionamento degli organi periferici, l'elaborazione e la loro successiva analisi lipidomica, nonché la lipidomica plasmatica, sono anche perseguiti e descritti. Il protocollo è dimostrato su un modello murino di epilessia acuta.

Introduzione

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I recenti progressi nella funzione dei lipidi e il loro ruolo nell'insorgenza e nella progressione delle malattie neurologiche aprono nuove sedi di ricerca e sviluppo di nuovi bersagli terapeutici e delucidazione del meccanismo della malattia1. Le differenze documentate nella composizione lipidica in diverse regioni del cervello, enfatizzate dalle moderne tecniche di imaging molecolare come l'imaging con spettrometria di massa e la profilazione avanzata della spettrometria di massa, spostano il paradigma dell'indagine lipidica dall'intero cervello verso regioni cerebrali funzionalmente distinte e discrete. Il fatto che la composizione lipidica ....

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Protocollo

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Tutte le procedure sperimentali qui descritte sono conformi alla direttiva del Consiglio della Comunità europea del 22 settembre 2010 (2010/63UE) e sono state approvate dal comitato locale per gli animali dello stato Renania-Palatinato, Germania (riferimento file: 23 177-07/G16-1-075).

1. Modello animale di epilessia acuta e profilatticamente trattata con KA

  1. Eseguire l'induzione delle convulsioni, il trattamento e il punteggio comportamentale.
    1. Separare i topi (minimo n = 6 topi per gruppo) in gabbie singole.
    2. Preparare la soluzione per iniezione di induzione del sequestro e il veicolo corrispondente (vedere

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Risultati

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L'insieme dei protocolli descritti può essere combinato su diversi livelli in modo specifico per scopo, come la scelta del modello animale, la via di campionamento, il metodo di estrazione e la profilazione (Figura 1).

Al fine di determinare i cambiamenti del livello lipidico nel cervello e nella periferia nel corso di un decorso acuto di crisi epilettica e per svelare il potenziale effetto antiepil.......

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Discussione

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La metodologia neurolipidomica e trascrittomica qui descritta è un mezzo praticabile per studiare qualsiasi malattia o sviluppo sano ad alta e bassa risoluzione spaziale nel cervello e negli organi periferici. Grazie alle procedure ottimizzate di campionamento e manipolazione del plasma, l'analisi lipidomica plasmatica può essere effettuata anche dagli stessi animali sacrificati per la lipidomica e la trascrittomica tissutale, migliorando così l'affidabilità dei correlati molecolari del sangue tissutale e la scoperta di .......

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Dedichiamo questo articolo alla Dott.ssa Ermelinda Lomazzo. Durante la finalizzazione di questo manoscritto, la dottoressa Ermelinda Lomazzo è deceduta. È l'incarnazione della passione per la scienza e dell'impegno disinteressato nel lavoro di squadra per soddisfare uno scopo di ricerca significativo. Ha sempre sognato di contribuire in modo significativo al maggiore benessere degli esseri umani. La sua natura di buon cuore non è mai stata compromessa dalle faticose strade della scienza e della vita. Rimarrà inestimabile, e per sempre, nei nostri cuori.

Julia M. Post è stata finanziata dal Focus Program for Translational Neuroscience (FTN) ....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
12(S)-HETEBiomolCay10007248-25Lipid Std
12(S)-HETE-d8BiomolCay334570-25Lipid Std
1200 series LC SystemAgilentInstrumentation/LCMS
2100 BioanalyzerAgilentInstrumentation/qPCR
5(S)-HETE-d8BiomolCay 334230Lipid Std
ABI 7300 Cycler per PCR in tempo realeStrumentazione per biosistemi/qPCR
Acetonitrile LC-MS Chroma SolvHoneywell9814920Provette Eppendorf ambrate per solventi/LCMS
EppendorfSample Prep.
Analista 1.6.2 SoftwareAB SCIEX, DarmstadtSoftware
Bilancia analiticaMettler ToledoStrumentazione/Preparazione dei campioni.
Acido arachidonico-d8 MS StandardBiomolCay-10007277Lipid Std
Bessmann Tissue PulverizerSpectrum Laboratories, Inc. (Breda, Paesi Bassi)Strumentazione/Preparazione del campione.
BinoZeissMicroscopia
scissa Caspasi 3 anticorpoSegnalazione cellulare9661SMicroscopia
Criostato, Leica CM3050 SLeica BiosystemsStrumentazione/Preparazione dei campioni.
Autocampionatore CTC HTC PALCTC Analytics AGStrumentazione/LCMS
Dumont Pinze curve Dumoxel #7FST11271-30Strumenti chirurgici
Pinze Dumont Punta super fine #5SF (x2)FST11252-00Strumenti chirurgici
EDTA 1000 A Rö hrchenKabe Labortechnik078001Preparazione del campione.
EP-1 EconoPumpBioRAD700BR07757Strumentazione/Preparazione del campione.
Pinze fini Finitura a specchioFST11412-11Strumenti chirurgici
Forbici per iride fini affilateFST14094-11Strumenti chirurgici
Forbice fine Carburo di tungsteno drittoFST14568-09Strumenti chirurgici
Spatole per irideFST10094-13Strumenti chirurgici
Acido kainicoAbcamab120100Farmaco epilettico
Software per la visualizzazione dei lipidiAB SCIEX, DarmstadtSoftware
LPC 17:0Avanis Polaris855676PLipid Std
LPC 18:0Avanis Polaris855775PLipid Std
Luna 2,5µ m C18(2)- HAST 100A Colonna LCPhenomenex00D-4446-B0Strumentazione/LCMS
Lampada d'ingrandimentoMaul GmbHStrumentazione/Preparazione del campione.
Metanolo LC-MS Chroma Solv 99,9%Honeywell9814920Solvente/LCMS
Motic CamaraMicroscopiaMotica
MTBEHoneywell34875-1LSolvente/LCMS
MultiQuant 3.0 pacchetto software di quantificazioneAB SCIEX, DarmstadtSoftware
NanoDrop 2000c SpettrofotometroThermo ScientificStrumentazione/qPCR
PA 16:0-18:1Avanis Polaris840857PLipid Std
PA 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1404Lipid Std
Palmitoyl EthanolamideBiomolCay90350-100Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide-d5BiomolCay9000573-5Lipid Std
PC 16:0-18:1Avanis Polaris850457PLipidi Std
PC 16:0-18:1Avanis Polaris850457PLipid Std
PC 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1004Lipid Std
PE 16:0-18:1Avanis Polaris850757PLipid Std
PE 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1104Lipid Std
PG 16:0-18:1Avanis Polaris840457PLipid Std
PG 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1204Lipid Std
PI 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1504Lipid Std
Precelleys 24PeqlabStrumentazione/Preparazione dei campioni.
Precellys Keramik-Kü gelchenPeqlab91-pcs-ck14pPreparazione del campione.
Precellys Stahlkugeln 2,8mmPeqlab91-PCS-MK28PPreparazione del campione.
1,4 mmVWR91-PCS-CK14Preparazione del campione.
Prostaglandina D2BiomolCay 12010Lipidi Std
Prostaglandine D2-d4BiomolCay 312010Lipidi Std
Prostaglandine E2BiomolCay10007211-1Lipidi Std
Prostaglandine E2-d9BiomolCay10581-50Lipidi Std
PS 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1304Lipidi Std
Q Trappola 5500 trappola ionica lineare a triplo quadrupolo MSAB SCIEXStrumentazione/LCMS
Sistema di PCR in tempo realeAppliert BiosystemStrumentazione/qPCR
Resolvin D1BiomolCay10012554-11Lipid Std
Rneasy Mini Kit - Set di DNasi senza RNAasi (50)Qiagen79254Preparazione del campione.
Precolonna di sicurezzaPhenomenexStrumentazione/LCMS
Piastre di copertura ShandonThermo Fisher72110017Microscopia
Shandon Rack e coperchio per vetriniThermo Fisher73310017Microscopia
SM 18:0Avanis Polaris860586PLipid Std
SM d18:1/12:0Avanis PolarisLM-2312Lipid Std
Pinze standard diritte lisce SmoothFST11016-17Strumenti chirurgici
Forbice chirurgica ToughCut Modello standardFST14130-17Strumenti chirurgici
T3000 TermociclatoreBiometraStrumentazione/qPCR
Trombossano B2BiomolCay19030-5Lipidi Std
Trombossano B2-d4BiomolCay319030-25Lipidi Std
Lyser tissutale IIQiagen/ Retsch12120240804Strumentazione/Preparazione dei campioni.
Microscopia Tissue TekSakura Finetek4583
ToluidinblauRoth0300.2Microscopia
VapothermBarkey4004734Strumentazione/Preparazione campioni.
Wasser LC-MS Chroma SolvVWR9814920solvente/LCMS
applicatiKit di montaggio AU111609004

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aronica, E., et al. Neuroinflammatory targets and treatments for epilepsy validated in experimental models. Epilepsia. 58, 27-38 (2017).
  2. Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L.

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Dissezione del cervelloanalisi LC MRMestrazione duale di RNA e lipidianalisi degli endocannabinoidiprofilazione dei fosfolipidicampionamento cerebrale per punchmodello murino di epilessia

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