terapeutica di miRNA hanno un potenziale significativo nella regolazione della progressione del cancro. Ha dimostrato qui approcci analitici utilizzati per l'identificazione dell'attività di un trattamento di combinatoria miRNA nell'arrestare il ciclo cellulare e l'angiogenesi.
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Articolo metodologico
Analisi di miRNA combinatoria trattamenti per regolare il ciclo cellulare e l'angiogenesi
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Il cancro del polmone (LC) è la causa principale delle morti legate al cancro in tutto il mondo. Simile ad altre cellule di cancro, una caratteristica fondamentale delle cellule LC è proliferazione non regolamentata e la divisione cellulare. Inibizione della proliferazione di arrestare la progressione del ciclo cellulare ha dimostrato di essere un promettente approccio per il trattamento del cancro, tra cui LC.
terapeutica di miRNA sono emerse come regolatori di genico post-trascrizionale importante e sempre più stanno studiandi per uso nel trattamento del cancro. In recenti lavori, abbiamo utilizzato due Mirna, miR-143 e miR-506, per regolare la progressione del ciclo cellulare. Transfected le cellule A549 non a piccole cellule del polmone cancro (NSCLC), modificazioni dell'espressione genica sono stati analizzati e attività apoptotica dovuta al trattamento infine è stato analizzato. Downregulation di chinasi ciclina-dipendenti (CDKs) sono stati rilevati (cioè, CDK1, CDK4 e CDK6), e ciclo cellulare fermato presso le transizioni di fase di G1/S e G2/M. Analisi del percorso indicano potenziali attività antiangiogenica del trattamento, che conferisce l'approccio multiforme attività. Qui, le metodologie utilizzate per identificare l'attività di miRNA per quanto riguarda l'inibizione del ciclo cellulare, induzione di apoptosi e gli effetti del trattamento sulle cellule endoteliali tramite inibizione dell'angiogenesi sono descritti. Si spera che i metodi presentati qui sosterrà la ricerca futura su miRNA terapeutica e attività corrispondente e che i dati rappresentativi guiderà altri ricercatori durante analisi sperimentali.
Introduzione
Il ciclo cellulare è una combinazione di più eventi normativi che consentono la duplicazione del DNA e la proliferazione cellulare attraverso il processo mitotico1. Chinasi ciclina-dipendenti (CDKs) regolare e promuovere il ciclo cellulare2. Tra questi, il CDK mitotica (CDK1) e interfase CDKs (CDK2, CDK4 e CDK6) hanno un ruolo fondamentale nel ciclo cellulare progressione3. Proteina del retinoblastoma (Rb) è fosforilata da CDK4/CDK6 complessi per consentire il ciclo cellulare progressione4, e l'attivazione CDK1 è essenziale per la divisione cellulare successo
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Protocollo
1. miR-143 e miR-506 transfezione
Attenzione: Utilizzare un camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in lattice durante l'esecuzione di esperimenti descritti. Quando richiesto, è possibile utilizzare l'armadio di sicurezza biologica con il ventilatore su, senza bloccare le vie respiratorie o disturbare il flusso d'aria laminare. Impostare sempre la finestra di vetro proteggente all'altezza appropriata, come descritto dal produttore.
- Le cellule A549 NSCLC seme in una piastra T25 cm2 pallone/6/96 ben in DMEM/F12K media completati con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina (terreni di coltura) in una cappa di co....
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Risultati
Analisi dell'espressione genica tramite RT-qPCR ed elettroforesi su gel
Analisi di espressione genica differenziale usando RT-qPCR dimostrato significativi downregulation dei geni mirati CDK1, CDK4 e CDK6. CDK1 e CDK4/6 sono stati indicati per essere strumentale per il G2/M e transizioni G1/S, rispettivamente. Le analisi eseguite ha permesso il confronto diretto tra miRs individuale e attività di miR combinatori.......
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Discussione
Mirna possono operare come terapie mirate per il trattamento del cancro, riconoscendo l'alterazione dei livelli di espressione in malati vs tessuti normali. Questo studio mira a determinare i miRNA che potenzialmente fermare la progressione del ciclo cellulare durante le fasi multiple. È stato identificato che miR-143 e miR-506 arrestare il ciclo cellulare delle cellule tumorali e i protocolli presentati volti a comprendere l'attività di questo trattamento di miRNA combinatoria.
Le metodologie.......
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Dichiarazioni
Gli autori desidera ringraziare John Caskey alla Louisiana State University per la sua assistenza sull'analisi di dati di sequenziamento di RNA e l'Università del Texas Southwestern Medical Center, McDermott centro prossima generazione sequenziamento Core per via eseguire l'analisi di dati e sequenziamento di RNA. Questa ricerca è stata sostenuta da College di farmacia, Università della Louisiana Monroe Start-up finanziamenti e il National Institutes of Health (NIH) attraverso l'Istituto nazionale di generale Medical Science sovvenzioni 5 P20 GM103424-15, 3 P20 GM103424-15S1.
Ringraziamenti
Non vengono dichiarati conflitti di interesse.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| -80 ° C Congelatore | VWR | VWR40086A | |
| piastra a 96 pozzetti | CELLTREAT Scientific | 50-607-511 | |
| Piastre per micropozzetti a 96 pozzetti | Thermo Scientific | 12-556-008 | |
| A549 Cellule di carcinoma polmonare non a piccole cellule | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Agarosio | VWR | 0710-25G | |
| Agilent 2100 Bioanalizzatore | Agilent Technologies | G2938c | |
| Ambion Silenziatore Controllo negativo n. 1 siRNA | Ambion | AM4611 | |
| Soluzione antibiotico-antimicotica (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Kit di analisi array di anticorpi, 2 reazioni | Full Moon Bio | KAS02 | |
| Microscopio a campo chiaro | Microscotti | IV-900 | |
| Microscopio a campo chiaro | New Star Environment LLC | ||
| Cell Cycle Antibody Array, 2 vetrini | Full Moon Bio | ACC058 | |
| Cell Logic+ Biosafety Cabinate | Labconco | 342391100 | |
| Cellquest Pro | BD bioscience | Passaggi 5.14; 6.13: Utilizzato per calcolare la distribuzione della popolazione in base alla fase del ciclo cellulare e per il calcolo della distribuzione della popolazione per l'analisi di apoptosi | |
| CFX96 Sistema in tempo reale | BioRad | CFX96 Modulo | |
| Chemidoc Sistema di imaging touch | BioRad | Sistema di imaging | |
| Incubatore CO2 Thermo | Scientific | HERAcell 150i | |
| Cultrex Fattore di crescita ridotto Matrice di membrana basale Trevigen | 3433-010-01 | ||
| Fotocamera digitale | AmScope | FMA050 | |
| DMEM 4,5 g/L di glucosio, senza piruvato di sodio, con L-glutammina | VWR | VWRL0100-0500 | |
| DNAse I | Zymo Research | E1010 | |
| Integratore per la crescita delle cellule endoteliali (ECGS) | BD Biosciences | 356006 | |
| Eppendorf Set Pick-A-Pack per pipette | Eppendrof | 05-403-152 | |
| Etanolo, assoluto (200 proof), molecolare Grado di biologia, | Fisher BioReagents | BP2818500 | |
| Bromuro di etidio | Alfa acar | L07462 | |
| F-12K Miscela di nutrienti (Kaighn's Mod.) con L-glutammina, Corning | Corning | 45000-354 | |
| FACS Calibur Flowcytometer | Becton Dickinson | ||
| Siero fetale bovino - Premium | Antlanta Biologicals | S11150 | |
| Fetale Siero bovino (FBS) | Fisher Scientific | 10438026 | |
| Fisherbrand Provette per microcentrifuga Basix con tappi a scatto standard | Fisherbrand Basix | 02-682-002 | |
| Incubatore a CO2 con camicia d'acqua Forma Series II Soluzione di | Thermo Scientific | ||
| (5000 U/mL) | Hospira | NDC#63739-920-11 | |
| Sistema di elettroforesi orizzontale | da banco sistema da laboratorio | BT102 | |
| has-miR-143-3p miRNA Mimic | ABM | MCH01315 | |
| has-miR-506-3p miRNA Mimic | ABM | MCH02824 | |
| Fattore di crescita dell'endotelio vascolare ricombinante umano (VEGF) | Thermo Scientific | PHC9394 | |
| Cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) | Donatori individuali | IRB# A15-3891 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | SH30256FS | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | Risultati: Utilizzato per l'analisi | |
| delle vie Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Acqua distillata | Invitrogen | 10-977-015 | |
| Lipofectamina 2000 | Invitrogen | 11-668-027 | |
| Caricamento del colorante 10X | ward's science+ | 470024-814 | |
| Medium M199 (con Earle′ s sali, L-glutammina e bicarbonato di sodio) | Sigma Aldrich | M4530 | |
| Microscopio Fotocamera digitale | AmScope | MU130 | |
| Modfit LT | Verity Software | Passaggio 5.15: Software alternativo per l'analisi delle distribuzioni | |
| Nanodrop | Thermo Scientific NanoDrop | one C | |
| Opti-MEM | Gibco di life technologies | 31985-070 | |
| Penicillina-streptomicina 10/10 | Antlanta Biologicals | B21210 | |
| Power UP sybr green master mix | Applied Biosystems | A25780 | |
| Ioduro di propidio | MP Biochemicals LLC | IC19545825 | |
| Proscanarray HT Scanner per microarray | Perkin elmer | ASCNPHRG. Abbiamo utilizzato la lunghezza d'onda del laser di eccitazione a 543 nm. | |
| q Copertura adesiva ottica per PCR | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Kit Quick-RNA Zymo | Research | R1055 | |
| Ribonucleasi A dal pancreas bovino | Sigma | R6513-50MG | |
| ScanArray Express | PerkinElmer | Passaggio 7.33: Software | |
| Agitatore | Thermo Scientific | 2314 | |
| SimpliAmp Termociclatore | Applied Biosystems | ||
| SpectraTube Provette da centrifuga 15ml | VWR | 470224-998 | |
| Provette da centrifuga SpectraTube 50ml | VWR | 470225-004 | |
| TBS Tampone, 20x liquido | VWR | 10791-796 | |
| Temperatura controllata centrifuga matchine | Thermo Scientific | ST16R | |
| Matchina per microcentrifuga a temperatura controllata | Eppendrof | 5415R | |
| Thermo Scientific BioLite Flask trattati per colture cellulari | Thermo Scientific | 12-556-009 | |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Thermo Scientific | PI23225 | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Thermo Scientific | PI89900 | |
| Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates | Thermo Scientific | AB0800WL | |
| Thermo Scientific Kit di sintesi del cDNA Verso (100 corse) | Thermo Scientific | AB1453B | |
| Scala DNA a bassissima gamma | Invitrogen | 10597012 | |
| VWR frigorifero da laboratorio standard a porta solida | VWR |
Riferimenti
- Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
- Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Malumbres, M., Barbacid, M.
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 4/26/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis. An author name was updated.
One of the authors' names was corrected from:
George Matthaiolampakis
to:
George Mattheolabakis
