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Articolo metodologico

Trattamento radiante delle colture organotipiche da ghiandole salivari Sottomandibulari e parotidi modelli chiave in vivo caratteristiche

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DOI:

10.3791/59484

⸱

17 maggio 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Nutritional Sciences, University of Arizona, 2Cancer Biology Graduate Interdisciplinary Program, University of Arizona, 3Department of Chemical Engineering, University of Arizona

In questo articolo

Sommario

L'uso di colture organotipiche tridimensionali per visualizzare la morfologia e i marcatori funzionali delle ghiandole salivari può fornire nuove intuizioni sui meccanismi del danno tissutale dopo la radiazione. Qui di seguito è riportato un protocollo per sezioni, colture, irraggiamento, macchia e immagini di 50 – 90 μm di spessore di sezione della ghiandola salivare prima e dopo l'esposizione alle radiazioni ionizzanti.

Abstract

Iposalivazione e xerostomia creano complicanze orali croniche che diminuiscono la qualità della vita nei pazienti affetti da tumore della testa e del collo che sono trattati con la radioterapia. Approcci sperimentali per la comprensione dei meccanismi di disfunzione e restauro della ghiandola salivare si sono concentrati su modelli in vivo, che sono portatori di handicap dall'incapacità di schermo sistematicamente candidati terapeutici ed efficienze in trasfezione capacità di manipolare geni specifici. Lo scopo di questo protocollo di coltura organotipica della ghiandola salivare è quello di valutare il tempo massimo di vitalità della cultura e caratterizzare i cambiamenti cellulari dopo il trattamento delle radiazioni ex vivo. Abbiamo utilizzato la colorazione immunofluorescente e la microscopia confocale per determinare quando specifiche popolazioni di cellule e marcatori sono presenti durante un periodo di coltura di 30 giorni. Inoltre, i marcatori cellulari precedentemente segnalati nei modelli di radiazioni in vivo sono valutati in colture che sono irradiate ex vivo. In futuro, questo metodo è una piattaforma attraente per una rapida valutazione ex vivo delle risposte del tessuto della ghiandola salivare murina e umana agli agenti terapeutici che migliorano la funzione salivare.

Introduzione

La corretta funzione della ghiandola salivare è essenziale per la salute orale e viene alterata dopo il trattamento del cancro della testa e del collo con la radioterapia1. In 2017, quasi 50.000 nuovi casi di cancro alla testa e al collo sono stati segnalati negli Stati Uniti2. A causa degli effetti dannosi del tessuto e spesso irreversibili della radioterapia sui tessuti normali circostanti come le ghiandole salivari, i pazienti sono spesso lasciati con gravi effetti collaterali e diminuita qualità della vita2,3, 4. per la Complicazioni comuni causate da danni da radiazioni si manifestano in sintomi come xerostomia (la sensazione soggettiva di secchezza della bocca), carie dentali, alterata capacità di masticare e deglutire, disturbi del linguaggio, e microbiomi orali compromessi2, 3 il , 4. questi sintomi collettivamente possono portare alla malnutrizione e la sopravvivenza alterata in individui colpiti5. Mentre la disfunzione della ghiandola salivare in questa popolazione è stata ben documentata, i meccanismi di fondo del danno alle cellule di acinare sono stati contestati, e c'è poca integrazione tra i diversi modelli animali6,7.

I metodi attuali per studiare la funzione della ghiandola salivare e i danni causati dalle radiazioni includono l'uso di modelli in vivo, linee cellulari immortalate, colture cellulari primarie bidimensionali (2-D) e colture di salisphere tridimensionali (3-D)8, 9,10,11,12. Tradizionalmente, i modelli di colture cellulari provenienti da linee cellulari immortalate e culture 2-D coinvolgono singole celle a strati coltivate su superfici piane e sono preziosi per sperimentazioni rapide, semplici e convenienti. Tuttavia, le condizioni di coltura delle cellule artificiali possono alterare lo stato di differenziazione e le risposte fisiologiche delle cellule esposte a varie condizioni, e i risultati spesso non riescono a tradursi in interi modelli di organismo14,15. Inoltre, le colture cellulari immortalate richiedono la modulazione dell'attività di p53, che è fondamentale per la risposta della ghiandola salivare ai danni del DNA16,17.

le colture di salisphere 3-D sono arricchite per le cellule staminali e progenitrici nei primi momenti della cultura e sono state utili per comprendere la radiosensibilità di questo sottoinsieme di cellule della ghiandola salivare9,18. Una limitazione critica di tutti questi modelli di coltura è che sono inefficaci nella visualizzazione della struttura 3D della ghiandola salivare, tra cui la matrice extracellulare (ECM) e le interazioni cellulare-cellula su vari strati, che sono cruciali nella modulazione salivare secrezione15. La necessità di un metodo che comprenda il comportamento del tessuto nel suo complesso, ma può anche essere manipolato in condizioni di laboratorio per studiare gli effetti del trattamento è necessario per scoprire ulteriormente i meccanismi di base della ghiandola salivare indotta da radiazioni Disfunzione.

Il sezionamento e la coltura dei tessuti vivi sono stati documentati in precedenza19,20 ed è spesso usato per studiare le interazioni cervello-tessuto21. Negli studi precedenti, il tessuto della ghiandola salivare parotide (PAR) dai topi è stato sezionato a circa 50 μm e coltivato fino a 48 h, e l'analisi della vitalità, della morte cellulare e della funzione è stata eseguita successivamente19. Su et al. (2016) ha ampliato questa metodologia coltivando ghiandole sottomandibolari umane (SMG) sezionate a 35 μm o 50 μm per 14 giorni20. Il metodo proposto è un progresso in quanto comprende sia le ghiandole salivari parotide che sottomandibolare sezionate a 50 μm e 90 μm e la valutazione delle colture per 30 giorni. La capacità di tagliare una gamma di spessore del tessuto è importante per valutare le interazioni cellula-cella e Cell-ECM che sono rilevanti per i processi cellulari, tra cui la polarità apicale-basolaterale e l'innervazione per la secrezione. Inoltre, le fette di ghiandola salivare sono state irradiate mentre in coltura per determinare la fattibilità di questo modello di coltura per studiare il danno della ghiandola salivare indotta da radiazioni.

Lo scopo di questo protocollo di coltura organotipica della ghiandola salivare è quello di valutare il tempo massimo di vitalità della cultura e caratterizzare i cambiamenti cellulari dopo il trattamento delle radiazioni ex vivo. Per determinare le sezioni temporali massime che sono vitali post-dissezione, la colorazione blu Trypan, la colorazione delle cellule vive e la colorazione immunoistochimica per la morte delle cellule sono state eseguite. La microscopia confocale e la colorazione immunofluorescente sono state utilizzate per valutare popolazioni cellulari specifiche, strutture morfologiche e livelli di proliferazione. Le colture di sezione tissutale sono state esposte anche a radiazioni ionizzanti per determinare gli effetti delle radiazioni su vari marcatori in questo modello 3-D. L'induzione della morte delle cellule, la rottura del citoscheletro, la perdita di marcatori di differenziazione e la proliferazione compensatoria nelle colture ex vivo irradiate sono state confrontate con studi precedenti di modelli in vivo. Questa metodologia fornisce un mezzo per indagare il ruolo delle interazioni delle cellule cellulari dopo il danno da radiazioni e fornisce un modello sperimentale per valutare in modo efficiente l'efficacia degli interventi terapeutici (manipolazioni genetiche o agenti farmacologici ) che possono essere meno adatte per i modelli in vivo.

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Protocollo

1. preparazione del VIBRATOME

  1. Spruzzare componenti staccabili del VIBRATOME compreso il vassoio tampone, attacco della lama, muffa blocco di agarosio, e pellicola di laboratorio con 70% etanolo, poi UV-sterilizzare per almeno 30 min.
  2. Posizionare e fissare un foglio aggiuntivo di pellicola di laboratorio sul vassoio tampone per evitare che il ghiaccio cada.
  3. Riempire la camera di ghiaccio con ghiaccio schiacciato, rimuovere la pellicola di laboratorio dal vassoio tampone e riempire il vassoio tampone con 100 mL di soluzione salina tampone di ghiaccio-fredda 1x tamponata (PBS) integrata con 1% di penicillina-streptomicina-ampicillina (PSA).
  4. Inserire una lama di rasoio in acciaio inossidabile nel portalama. Utilizzare il cacciavite per stringere/allentare e cambiare l'angolazione della lama.

2. preparazione del campione di tessuto in blocco di agarosio e sezionamento utilizzando il VIBRATOME

  1. Autoclave tutti gli strumenti di dissezione e sezionamento necessari tra cui pinze, forbici e pennelli.
  2. Preparare 3% basso punto di fusione agarosio in sterile 1X PBS e forno a microonde fino a quando l'agarosio si dissolve in soluzione. Assicurarsi che la soluzione non bollire e ruotare periodicamente il flacone per miscelare.
    Nota: evitare di solidificare l'agarosio a bassa fusione mantenendolo in un bagno d'acqua caldo. L'agarosio a bassa fusione è fluido a 37 ° c e si imposta a 25 ° c. Tuttavia, il bagno d'acqua dovrebbe essere inferiore a 40 ° c al fine di versare l'agarosio intorno al tessuto a temperatura fisiologica.
  3. Isolare le ghiandole salivari e posizionare il tessuto dissezionato in 2 mL di ghiaccio-freddo 1X PBS completati con 1% PSA in un piatto di coltura sterile da 30 mm.
  4. Utilizzando pinze autoclavate, rimuovere le ghiandole salivari da 1X PBS + 1% PSA soluzione e posizione nella parte inferiore di uno stampo di incorporamento. Riempire lo stampo con liquido 3% basso punto di fusione agarosio per coprire il tessuto.
  5. Utilizzando le pinze, regolare il tessuto al centro del blocco e posizionare la ghiandola salivare nel piano appropriato. Le migliori sezioni trasversali per le ghiandole sottomandibolari e parotidi sono nel piano verticale.
  6. Posizionare il blocco di agarosio sul ghiaccio per 10 minuti per indurire.
  7. Eseguire con cautela una lama di rasoio intorno al bordo esterno dell'agarosio per allentare e lasciare che il blocco scivoli sul film di laboratorio sterilizzato UV dal passo 1,1.
  8. Utilizzare una lama di rasoio per ritagliare una scatola di agarosio contenente la ghiandola salivare. Assicurarsi che il piano della sezione sia dritto e parallelo al lato opposto del blocco (la superficie che verrà incollata). Dal momento che l'agarosio non infiltrarsi nel tessuto, non tagliare troppo agarosio intorno al tessuto in modo che il tessuto sarà ben supportato.
  9. Utilizzare la supercolla per fissare il blocco alla superficie di taglio.
  10. Sezione a 50 μm o 90 μm di spessore con VIBRATOME ad una velocità di 0,075 mm/s e frequenza di 100 Hz.
    Nota: l'impostazione del vibratoma alla massima frequenza e alla velocità della lama più bassa fornisce le porzioni ottimali.
  11. Raccogli le sezioni in un piatto di coltura di tessuto 24-well contenente ~ 1 mL di PBS ghiacciato per pozzo utilizzando un pennello per capelli naturale, in autoclave, posizionando il pennello nel 70% di etanolo tra le collezioni di fette per mantenere la sterilità.

3. sezioni di coltura

  1. Autoclave una micro-spatola e pinze.
  2. Creare supporti di coltura vibratoma stock con o senza siero bovino fetale (FBS): media DMEM/F12 integrato con 1% PSA, 5 μg/mL di transferrina, 1,1 μM di idrocortisone, 0,1 μM di acido retinoico, 5 μg/mL di insulina, 80 ng/mL di fattore di crescita epidermico, 5 mM L-glutam50 Mina di gentamicina solfato e 10 μL/mL di miscela di oligoelementi. Aggiungere una quantità appropriata di FBS per rendere 0%, 2,5%, 5,0%, o 10% soluzioni.
  3. Prima del sezionamento, aggiungere 300 μL di supporto pre-riscaldato e inserire un inserto di membrana di diametro di 12 mm, 0,4 μm, in ogni pozzetto di una piastra di coltura di tessuto a 24 ben. I supporti devono raggiungere il fondo della membrana per creare un'interfaccia liquido-aria per la cultura.
  4. Posare delicatamente le sezioni salivari sulla parte superiore dell'inserto della membrana utilizzando la micro spatola e la coltura a 37 ° c in incubatore di atmosfera d'aria 5% CO2 e 95% umidificata.
    1. Aggiungere circa 300 μL di media di coltura primaria nel pozzo e qualche goccia negli inserti a membrana (circa 40 μL) a giorni alterni o secondo necessità. Una corretta coltura ha dimostrato che le cellule sono in grado di sopravvivere ed essere mantenute fino a 30 giorni ex vivo.

4. irradiazione delle sezioni della ghiandola salivare

  1. Trattare le sezioni con una singola dose di radiazioni (5 GY) utilizzando cobalto-60 (o equivalente) irradiatore.
    1. Sezioni di trasporto per l'impianto di irradiatore utilizzando un contenitore di polistirolo rivestito per evitare fluttuazioni di temperatura. Inoltre, la cura deve essere presa durante il trasporto di nuovo all'incubatore di laboratorio per garantire che i supporti non spruzzi sul coperchio della coltura e indurre la contaminazione.
    2. Posizionare la piastra 24-well contenente le sezioni della ghiandola salivare 80 cm dalla sorgente di radiazione, al centro di un campo di radiazione 32 "x 32". I calcoli della dose di radiazione e il tempo corrispondente in irradiatore varieranno per strumento e decadimento cobalto-60.
  2. Continuare il monitoraggio e la coltura di queste sezioni come descritto nella sezione 3.

5. colorazione della redditività

  1. Aspirate vecchi media e lavare le fette due volte con sterile, pre-riscaldato 1X PBS.
  2. Sezioni di macchia con colorante blu Trypan.
    1. Utilizzare una Microspatola per spostare la fetta dalla cultura a una diapositiva di vetro.
    2. Aggiungere 0,4% trypan soluzione blu alla fetta di vibratoma con abbastanza volume per coprire il tessuto (10 – 20 μL).
    3. Incubare le fette a temperatura ambiente (RT) nel Trypan blu per 1 – 2 min affinché il colorante penetri nel tessuto. Le cellule non vitali saranno macchiate di blu e le cellule vitali non saranno macchiate.
  3. Colorazione delle sezioni con calceina, colorante AM Live-Cell.
    1. Aggiungere abbastanza volume di macchia per coprire la sezione in un pozzo di un 24 pozzetto (200 – 300 μL).
    2. Incubare le fette a RT per 15 minuti per consentire la penetrazione del colorante.
    3. Rimuovere con cautela la sezione dal pozzo e posizionarlo su uno scivolo di vetro. Montare le fette con 1 goccia di supporto di montaggio.
    4. Sezioni di immagine su un microscopio fluorescente a lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 488 nm e 515 Nm.

6. sezioni del vibratoma di colorazione anticorpale

Nota: il seguente fornisce un protocollo di colorazione anticorpale generico specifico per Ki-67; Tuttavia, questo protocollo può essere utilizzato con qualsiasi anticorpo. Tutti i Lavini sono condotti a RT se non diversamente indicato.

  1. Nel piatto di coltura del tessuto multi-well, aspirare i media e lavare almeno 2x con sterile 1X PBS.
  2. Fissare le sezioni utilizzando 4% paraformaldeide (PFA) durante la notte a 4 ° c.
  3. Aspirare il 4% di PFA e lavare 3x con PBT [1X PBS, 1% di albumina sierica bovina (BSA), 0,1% Triton X-100].
    Nota: le sezioni possono essere conservate in 1X PBS a 4 ° c e macchiate in un secondo momento. Il tempo massimo di conservazione testato in questo manoscritto è stato di 3 settimane. Il tempo di conservazione più lungo dovrà essere ottimizzato dal singolo utente, se necessario.
  4. Permeabilize sezioni utilizzando 0,3% Triton X-100 in 1X PBS per 30 min.
    Nota: questo passaggio può essere modificato e ottimizzato per la colorazione e la permeabilizzazione di anticorpi specifici.
  5. Soluzione di permeabilizzazione di Pipet off.
  6. Lavare le fette 3x per 5 min con 1x PBS, 1% BSA e 0,1% Triton X-100 (PBT).
  7. Bloccare le fette con un agente bloccante con 1% di siero di capra normale per 1 h.
  8. Lavare le fette 3x per 5 min con PBT.
  9. Incubare le fette durante la notte a 4 ° c con 500 μL di anticorpo monoclonale di coniglio anti-Ki67 diluito in 1% BSA in 1X PBS.
    Nota: per la colorazione di Phalloidin, saltare il passo 6,9 e procedere utilizzando il protocollo per la specifica Phalloidin utilizzata. Per la contromacchia del DNA, saltare al passo 6,15.
  10. Aspirato anticorpo monoclonale anti-Ki67 coniglio.
  11. Lavare le fette 6x per 5 minuti in 1X PBS.
  12. Incubare le fette in 500 μL di anticorpi secondari coniugati fluorescenti compatibili con l'anticorpo anti-Ki67 diluito in 1% BSA in 1X PBS a RT per 1,5 h coperti dalla luce.
    Nota: in base agli anticorpi secondari utilizzati, il tempo di incubazione con l'anticorpo secondario può essere ulteriormente ottimizzato dal singolo utente. Inoltre, l'anticorpo secondario è sensibile alla luce. Tutti i Lavini successivi devono essere eseguiti al buio.
  13. Aspirato anticorpo secondario.
  14. Lavare le fette per 3x per 5 min con 1x PBS.
  15. Lavare le fette per 5 minuti in acqua deionizzata.
  16. Svasare le fette con DAPI (1μg/mL) per 20 minuti a RT.
  17. Lavare le fette (una volta) per 5 minuti in acqua deionizzata.
  18. Montare le fette con una goccia (~ 40 μL) di supporti di montaggio. Per evitare bolle in eccesso, posizionare lentamente il vetrino coprioggetti sul supporto di montaggio sulla slitta, iniziando con un angolo di 45 °.
    1. Per evitare di schiacciare le sezioni spesse con il coprioggetti, montare ogni fetta con un distanziale. Un distanziatore può essere creato posizionando un bordo di grasso sottovuoto in un quadrato intorno alla sezione tissutale.
    2. Quando si posa il vetrino coprioggetti, i bordi del vetrino coprioggetti possono essere sigillati con grasso sottovuoto. Premere verso il basso sui bordi del vetrino coprioggetti con il pollice per aderire saldamente sul vetrino. In alternativa, sigillare il vetrino coprioggetti sullo scivolo del microscopio con smalto trasparente.

7. Imaging di sezioni VIBRATOME

  1. Immagini i vetrini colorati entro 5 giorni dalla colorazione.
  2. Ottenere sezioni ottiche delle fette di VIBRATOME macchiate utilizzando un microscopio confocale. Con un microscopio confocale, ottenere un z-stack ad una dimensione di passo definito o scattare singole immagini a seconda del design sperimentale dell'utente. Le immagini possono essere esaminate su qualsiasi schermo del computer dopo la raccolta confocale.
    Nota: a causa dello spessore delle fette VIBRATOME, si consiglia di utilizzare un microscopio confocale o un ambito con capacità z-stack per visualizzare i dettagli all'interno dei campioni. Per le immagini utilizzate in questo manoscritto, è stato utilizzato un obiettivo olio 63X; Tuttavia, questo può essere adattato e ulteriormente modificato dal singolo utente e l'ambito specifico utilizzato. È stata utilizzata la risoluzione dei pixel consigliata per ogni obiettivo e fattore di zoom con il campionamento Nyquist presunto di 2,5 pixel in X e Y per la più piccola struttura otticamente risolvibile. Tuttavia, alcuni commentatori suggeriscono 2,3 pixel, mentre altri suggeriscono 2,8 pixel. Si prega di fare riferimento al manuale di microscopia confocale biologica22 per ulteriori dettagli su come effettuare questi calcoli.

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Risultati

Le colture primarie 2-D sono coltivate nei media integrati del siero bovino fetale (FBS), mentre le colture principali di salisphere 3-D sono tipicamente coltivate in condizioni esenti da siero10,11. Inoltre, i due studi precedenti che utilizzarono le colture VIBRATOME di ghiandole salivari hanno coltivato le loro sezioni in 0% o 10% FBS completati media19,20. Le fette sot...

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Discussione

La ricerca sulla ghiandola salivare ha utilizzato una serie di modelli di cultura, tra cui culture 2-D immortalate, colture primarie 2-D, culture salisphere 3-D e colture di organi 3-D da espianti embrionali per accertare le domande sulla biologia e la fisiologia sottostanti. Questi modelli di cultura hanno prodotto informazioni approfondite su una vasta gamma di domande di ricerca e continueranno ad essere strumenti importanti nella ricerca salivare. I limiti di questi modelli di coltura includono la modulazione dell'at...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un finanziamento pilota fornito dall'ufficio di ricerca e scoperta dell'Università dell'Arizona e dagli istituti nazionali di sanità (R01 DE023534) a Kirsten Limesand. La borsa di formazione per la biologia del cancro, T32CA009213, ha fornito supporto allo stipendio per Wen Yu Wong. Gli autori vorrebbero ringraziare M. Rice per il suo prezioso contributo tecnico.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Vibratomo VT1000SLeica BiosystemsN/AVibratomo per sezionamento
Lame di rasoio in acciaio inossidabile a doppio taglio Microscopiaelettronica Scienze72000
AgarosioFisher ScientificBP165-25Parafilm a basso punto di fusione
Sigma-AldrichP6543
Penicillina-Streptomicina-Amfotericina BLonza17-745HPSA
piastra a 24 pozzettiCellTreat229124
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS)Gibco14190-144
Loctite UltraGel Control SupercollaLoctiteN/AAcquistata presso il negozio di ferramenta
Natural Red Sable Round PaintbrushPrinceton Art & Spazzola Co7400R-2
Gentamicina SolfatoFisher ScientificICN1676045
TransferrinaSigma-AldrichT-8158-100mg
L-glutatminaGibco25030-081
OligoelementiMP BiomedicalsICN1676549
InsulinaFisher Scientific12585014
Fattore di crescita epidermicoCorning354001
IdrocortisoneSigma-AldrichH0888
Acido retinoicoFisher ScientificR2625-50MG
Siero fetale bovinoGibcoA3160602
DMEM/F12 MediaCorning150-90-CV
Millicell Inserto per colture cellulariMillipore SigmaPICM0125012 mm, dimensione dei pori di 0,4 um per piastra a 24 pozzetti
0,4% Trypan BlueSigma-AldrichT8154
Kit di imaging di cellule LIVE/DEAD (488/570)Thermo-FisherR37601utilizzato solo componente colorante LIVE Tecnologia
di segnalazione cellulareanti-Ki-679129S
di segnalazione cellulareanticorpo anti-E caderina3195S
Tecnologia di segnalazione cellulare anti-caspasi-3 scissa9661L
Anticorpo anti-SMASigma-AldrichC6198
Anticorpo anti-amilasiSigma-AldrichA8273
Anticorpo anti-CD31Abcamab28364
Anticorpo anti-TUBB3di segnalazione cellulare5568S
Alexa Fluor 594 Anticorpo Kit di etichettaturaThermo-FisherA20185
Alexa Fluor 594 FalloidinaThermo-FisherA12381
Siero bovino Albumina FisherScientificBP1600
Triton X-100Sigma-Aldrich21568-2500
Paraformaldeide PrillsFisher Scientific5027632
New England Agente bloccante nuclearePerkin Elmer2346249Non più venduto
di segnalazione cellulareDAPI4083S
Prolong Gold Antifade Mezzi di montaggioInvitrogenP36934
Leica SPSII Confocale spettraleLeica BiosystemsN/APer l'imaging confocale
Leica DMIL Microscopio a contrasto di fase invertito LeicaBiosystemsN/A
Cobalto-60 strumento di teleterapiaenergia atomica del Canada Ltd Theratron-80N / A
Amac Box, chiaroil contenitore Store60140Stampo a blocchi di agarosio
Tecnologia Tecnologia Tecnologia

Riferimenti

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