L'uso di colture organotipiche tridimensionali per visualizzare la morfologia e i marcatori funzionali delle ghiandole salivari può fornire nuove intuizioni sui meccanismi del danno tissutale dopo la radiazione. Qui di seguito è riportato un protocollo per sezioni, colture, irraggiamento, macchia e immagini di 50 – 90 μm di spessore di sezione della ghiandola salivare prima e dopo l'esposizione alle radiazioni ionizzanti.
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Articolo metodologico
Trattamento radiante delle colture organotipiche da ghiandole salivari Sottomandibulari e parotidi modelli chiave in vivo caratteristiche
In questo articolo
Sommario
Abstract
Iposalivazione e xerostomia creano complicanze orali croniche che diminuiscono la qualità della vita nei pazienti affetti da tumore della testa e del collo che sono trattati con la radioterapia. Approcci sperimentali per la comprensione dei meccanismi di disfunzione e restauro della ghiandola salivare si sono concentrati su modelli in vivo, che sono portatori di handicap dall'incapacità di schermo sistematicamente candidati terapeutici ed efficienze in trasfezione capacità di manipolare geni specifici. Lo scopo di questo protocollo di coltura organotipica della ghiandola salivare è quello di valutare il tempo massimo di vitalità della cultura e caratterizzare i cambiamenti cellulari dopo il trattamento delle radiazioni ex vivo. Abbiamo utilizzato la colorazione immunofluorescente e la microscopia confocale per determinare quando specifiche popolazioni di cellule e marcatori sono presenti durante un periodo di coltura di 30 giorni. Inoltre, i marcatori cellulari precedentemente segnalati nei modelli di radiazioni in vivo sono valutati in colture che sono irradiate ex vivo. In futuro, questo metodo è una piattaforma attraente per una rapida valutazione ex vivo delle risposte del tessuto della ghiandola salivare murina e umana agli agenti terapeutici che migliorano la funzione salivare.
Introduzione
La corretta funzione della ghiandola salivare è essenziale per la salute orale e viene alterata dopo il trattamento del cancro della testa e del collo con la radioterapia1. In 2017, quasi 50.000 nuovi casi di cancro alla testa e al collo sono stati segnalati negli Stati Uniti2. A causa degli effetti dannosi del tessuto e spesso irreversibili della radioterapia sui tessuti normali circostanti come le ghiandole salivari, i pazienti sono spesso lasciati con gravi effetti collaterali e diminuita qualità della vita2,3, 4. per la Com....
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Protocollo
1. preparazione del VIBRATOME
- Spruzzare componenti staccabili del VIBRATOME compreso il vassoio tampone, attacco della lama, muffa blocco di agarosio, e pellicola di laboratorio con 70% etanolo, poi UV-sterilizzare per almeno 30 min.
- Posizionare e fissare un foglio aggiuntivo di pellicola di laboratorio sul vassoio tampone per evitare che il ghiaccio cada.
- Riempire la camera di ghiaccio con ghiaccio schiacciato, rimuovere la pellicola di laboratorio dal vassoio tampone e riempire il vassoio tampone con 100 mL di soluzione salina tampone di ghiaccio-fredda 1x tamponata (PBS) integrata con 1% di penicillina-streptomicina-ampicillina (PSA).<....
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Risultati
Le colture primarie 2-D sono coltivate nei media integrati del siero bovino fetale (FBS), mentre le colture principali di salisphere 3-D sono tipicamente coltivate in condizioni esenti da siero10,11. Inoltre, i due studi precedenti che utilizzarono le colture VIBRATOME di ghiandole salivari hanno coltivato le loro sezioni in 0% o 10% FBS completati media19,20. Le fette sot.......
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Discussione
La ricerca sulla ghiandola salivare ha utilizzato una serie di modelli di cultura, tra cui culture 2-D immortalate, colture primarie 2-D, culture salisphere 3-D e colture di organi 3-D da espianti embrionali per accertare le domande sulla biologia e la fisiologia sottostanti. Questi modelli di cultura hanno prodotto informazioni approfondite su una vasta gamma di domande di ricerca e continueranno ad essere strumenti importanti nella ricerca salivare. I limiti di questi modelli di coltura includono la modulazione dell'at.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un finanziamento pilota fornito dall'ufficio di ricerca e scoperta dell'Università dell'Arizona e dagli istituti nazionali di sanità (R01 DE023534) a Kirsten Limesand. La borsa di formazione per la biologia del cancro, T32CA009213, ha fornito supporto allo stipendio per Wen Yu Wong. Gli autori vorrebbero ringraziare M. Rice per il suo prezioso contributo tecnico.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vibratomo VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratomo per sezionamento |
| Lame di rasoio in acciaio inossidabile a doppio taglio Microscopia | elettronica Scienze | 72000 | |
| Agarosio | Fisher Scientific | BP165-25 | Parafilm a basso punto di fusione |
| Sigma-Aldrich | P6543 | ||
| Penicillina-Streptomicina-Amfotericina B | Lonza | 17-745H | PSA |
| piastra a 24 pozzetti | CellTreat | 229124 | |
| Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Loctite UltraGel Control Supercolla | Loctite | N/A | Acquistata presso il negozio di ferramenta |
| Natural Red Sable Round Paintbrush | Princeton Art & Spazzola Co | 7400R-2 | |
| Gentamicina Solfato | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
| Transferrina | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
| L-glutatmina | Gibco | 25030-081 | |
| Oligoelementi | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
| Insulina | Fisher Scientific | 12585014 | |
| Fattore di crescita epidermico | Corning | 354001 | |
| Idrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Acido retinoico | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
| Siero fetale bovino | Gibco | A3160602 | |
| DMEM/F12 Media | Corning | 150-90-CV | |
| Millicell Inserto per colture cellulari | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, dimensione dei pori di 0,4 um per piastra a 24 pozzetti |
| 0,4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Kit di imaging di cellule LIVE/DEAD (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | utilizzato solo componente colorante LIVE Tecnologia |
| di segnalazione cellulare | anti-Ki-67 | 9129S | |
| di segnalazione cellulare | anticorpo anti-E caderina | 3195S | |
| Tecnologia di segnalazione cellulare anti-caspasi-3 scissa | 9661L | ||
| Anticorpo anti-SMA | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Anticorpo anti-amilasi | Sigma-Aldrich | A8273 | |
| Anticorpo anti-CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Anticorpo anti-TUBB3 | di segnalazione cellulare | 5568S | |
| Alexa Fluor 594 Anticorpo Kit di etichettatura | Thermo-Fisher | A20185 | |
| Alexa Fluor 594 Falloidina | Thermo-Fisher | A12381 | |
| Siero bovino Albumina Fisher | Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
| Paraformaldeide Prills | Fisher Scientific | 5027632 | |
| New England Agente bloccante nucleare | Perkin Elmer | 2346249 | Non più venduto |
| di segnalazione cellulare | DAPI | 4083S | |
| Prolong Gold Antifade Mezzi di montaggio | Invitrogen | P36934 | |
| Leica SPSII Confocale spettrale | Leica Biosystems | N/A | Per l'imaging confocale |
| Leica DMIL Microscopio a contrasto di fase invertito Leica | Biosystems | N/A | |
| Cobalto-60 strumento di teleterapia | energia atomica del Canada Ltd Theratron-80 | N / A | |
| Amac Box, chiaro | il contenitore Store | 60140 | Stampo a blocchi di agarosio |
Riferimenti
- Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review. Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians.
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Ristampe e permessi
