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Articolo metodologico

Modello Xenotrapianto eterogeneo derivato dal paziente del cancro pancreatico utilizzando larve di pesce zebra come ospiti per la valutazione comparativa del farmaco

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DOI:

10.3791/59507

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30 aprile 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Key Laboratory of Metabolism and Molecular Medicine, Ministry of Education, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, 2National Human Genetic Resources Sharing Service Platform (2005DKA21300), 3Fudan University Shanghai Cancer Center, 4Department of Pancreatic Surgery, Fudan University Shanghai Cancer Center, 5Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, 6Pancreatic Cancer Institute, Fudan University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive le procedure di ottimizzazione in un modello di xenotrapianto tumorale a doppia fluorescenza basato su virus utilizzando il pesce zebra larva come ospiti. Questo modello xenotrapianto eterogeneo imita la composizione tissutale del microambiente del cancro al pancreas in vivo e funge da strumento più preciso per valutare le risposte ai farmaci in modelli personalizzati zPDX (zebrafish patient-derived xenogrft).

Abstract

Lo xenotrapianto tumorale derivato dal paziente (PDX) e lo xenotrapianto tumorale derivato dalle cellule (CDX) sono tecniche importanti per la valutazione preclinica, la guida medica e le ricerche di base sul cancro. Generazioni di modelli PDX in topi host tradizionali richiedono molto tempo e lavorano solo per una piccola parte di campioni. Recentemente, il PDX del pesce zebra (zPDX) è emerso come un sistema host unico, con le caratteristiche di piccola e alta efficienza. Qui, descriviamo una metodologia ottimizzata per la generazione di un modello di xenotrapianto tumorale a doppia fluorescenza per la valutazione chemioterapia comparativa nei modelli zPDX. Le cellule tumorali e i fibroblasti sono stati arricchiti da tessuti tumorali pancreatici appena raccolti o congelati in diverse condizioni di coltura. Entrambi i gruppi cellulari sono stati etichettati dal lentivirus che esprime proteine fluorescenti verdi o rosse, così come un gene anti-apoptosi BCL2L1. Le cellule trasfette sono state pre-miscelate e co-iniettate nel pesce zebra larvale 2 dpf che sono stati poi allevati in un mezzo E3 modificato a 32 gradi centigradi. I modelli di xenotrapianto sono stati trattati con farmaci chemioterapici e/o inibitori di BCL2L1, e le vibilità di entrambe le cellule tumorali e i fibroblasti sono stati studiati simultaneamente. In sintesi, questo protocollo consente ai ricercatori di generare rapidamente una grande quantità di modelli zPDX con un microambiente tumorale eterogeneo e fornisce una finestra di osservazione più lunga e una quantificazione più precisa nella valutazione dell'efficienza dei farmaci candidati.

Introduzione

L'oncologia di precisione mira a trovare le strategie terapeutiche più vantaggiose per il singolo paziente1. Attualmente, numerosi modelli preclinici come la coltura primaria in vitro, la coltura organoide in vitro2e gli xenografifti derivati dal paziente (PDX) nei topi prima o dopo la coltura organoide sono proposti per la diagnosi e per vagliare/valutare il potenziale scelte terapeutiche3. Modello PDX generato dall'iniezione di cellule tumorali primarie umane in topi immunocompromessi, è uno degli strumenti più promettenti per lo screening farmacologico personalizzato in oncologia clinica3,4. A differenza della linea cellulare coltivata in vitro, i modelli PDX di solito conservano l'integrità e l'eterogeneità dell'ambiente tumorale in vivo, imitando meglio la diversità e le caratteristiche idiosincratiche di diversi pazienti tumorali, e quindi, possono prevedere potenziale esito medico dei pazienti4. Tuttavia, la generazione di modelli PDX nei topi richiede campioni di pazienti di alta qualità e mesi di tempo per raccogliere cellule e modelli sufficienti per esperimenti multigruppo, e le composizioni cellulari/genetiche dello xenotrapianto possono derivarsi da quelle dell'originale biopsia del paziente. Anche il tasso di successo per la creazione del modello PDX dei topi è basso, rendendo difficile l'implementazione nella pratica clinica. Per i pazienti che trasportano carcini rapidamente progrediti come il cancro al pancreas, potrebbero non essere in grado di ottenere informazioni preziose dagli esperimenti PDX in tempo.

Negli ultimi anni, il pesce zebra è stato segnalato per essere potenziali host non solo per i modelli CDX (xenogrofo tumorale derivato dalla cellula), ma anche modelli PDX5,6,7,8,9, 10. Come animale modello di vertebrato, il pesce zebra presenta sufficienti somiglianze con i mammiferi sia in genetica che in fisiologia, con due vantaggi significativi: trasparenza e piccola taglia11. Il pesce zebra è anche altamente fecondità, e centinaia di larve inbred possono essere ottenute in pochi giorni da una singola coppia di adulti12. Diversi studi hanno impiegato pesci zebra per generare modelli sia transgenici che xenotrapiformi di malattie tumorali13,14. Rispetto agli xenografti di topi, gli xenografti di pesce zebra consentono il tracciamento a risoluzione a singola cellula. Una certa quantità di tessuti umani è in grado di generare centinaia di modelli PDX di pesce zebra (zPDX), mentre può essere sufficiente solo per generare un paio di topi pdX modelli15,16. Inoltre, le larve di pesce zebra a 2-5 dpf già sviluppano sistemi circolatori completi e organi metabolici come fegato e reni, ma non il sistema immunitario17, mentre il sacco del tuorlo rimanente è un mezzo 3D naturale, ideale per lo screening farmacologico, farmaco test di resistenza e osservazioni di migrazione tumorale6,18,19,20,21.

Con un ultimo tentativo di utilizzare zPDX come piattaforma di screening/test per l'uso clinico, qui, descriviamo una proposta ottimizzata per il modello zPDX del cancro al pancreas, che consente la valutazione del farmaco candidato in vivo in breve tempo utilizzando meno cellule a costi inferiori. Rispetto ai precedenti riferimenti su zPDX6,9,10, abbiamo introdotto diverse ottimizzazioni per rendere il sistema più fattibile e affidabile per la diagnosi clinica personalizzata: 1) pre-ordinamento di diverse cellule gruppi nei tessuti tumorali primari e stabilizzare le cellule primarie per una settimana prima di ulteriori esperimenti; 2) etichettare le cellule umane e migliorare la vitalità cellulare in xenotrapianto tramite modificazione genetica basata su lentivirus; 3) ottimizzare la condizione di coltura del pesce zebra sia negli integratori di nutrimento (glucosio e glutammina) che nella temperatura; 4) quantificare le risposte ai farmaci di diversi tipi di cellule in modo comparativo. Abbiamo anche apportato modifiche alla soluzione di iniezione aggiungendo diversi materiali supplementari. Complessivamente, tali miglioramenti offrono la possibilità di generare rapidamente uno xenotrapianto più simile a quello del paziente negli ospiti di pesci zebra che può essere utilizzato come strumento affidabile per valutare la risposta dei farmaci candidati.

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate e hanno seguito le linee guida del Comitato Etico Animale della Fudan University e tutti i campioni di cancro al pancreas sono stati ottenuti dal Fudan University Shanghai Cancer Center. L'approvazione etica è stata ottenuta dal Comitato Etico FUSCC e da ciascun paziente è stato ottenuto il consenso informato scritto.

1. Preparazione dell'apparecchiatura per la Microiniezione

  1. Preparazione della piastra di iniezione.
    1. Preparare una soluzione da 50 mL dell'1% di agarose disciolta in soluzione E3 (0,6 g/L di sale acquario in acqua doppia distillata - 0,01 mg/L blu di metilene). Far bollire la soluzione fino a quando l'agarose si scioglie.
    2. Versare 50 mL della soluzione di agarose in una parabola Petri da 10 cm e quindi posizionare la muffa di fissaggio dell'embrione di pesce zebra sulla superficie. Rimuovere lo stampo quando la soluzione agarose diventa solidificata.
    3. Aggiungere 20 mL di soluzione E3 alla piastra di iniezione e mantenerla a 4 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine.
  2. Preparazione degli aghi di iniezione.
    1. Tirare un capillare di vetro di 10 cm con una dimensione interna di 0,9 mm in due aghi su un puller ad ago.
    2. Utilizzare le pinze per tagliare l'estremità dell'ago per creare un'apertura al microscopio.

2. Preparazione degli embrioni per il trapianto

  1. Mettere da 1 a 2 paia di pesci zebra adulti in un serbatoio di accoppiamento alle 19-9 e raccogliere le uova fecondate intorno alle 8 del mattino successivo.
  2. Trasferire le uova fecondate dal serbatoio di accoppiamento a un piatto Petri contenente 40 mL di soluzione E3 fresca e incubare a 28,5 gradi centigradi.
  3. Dopo 8 h di incubazione nella soluzione E3, aggiungere 0.03% 1-phenyl-2-thiourea (PTU) nella soluzione E3 per inibire la pigmentazione. Incubare gli embrioni in soluzione E3 con 0,03% PTU a 28,5 gradi centigradi fino a 48 cv. Questo passaggio può essere omesso se si utilizzano pesci zebra mutanti Casper in-bre.

3. Isolamento e coltura delle cellule umane primarie da fresco inquinamento chirurgico del cancro pancreatico o tessuto congelato

  1. Ottenere campioni di tessuto di cancro al pancreas umano delle dimensioni di circa 1 cm3 durante un intervento chirurgico addominale, e trasferire immediatamente il tessuto in mezzi di crescita (DMEM con 10% siero bovino fetale (FBS), 10 SM Y-27632, 100 g/ mL primocina, 10 g/mL putrescine diclidoruride, 10 mM di nicotina e 1% streptolicina di penicillina).
  2. Trasferire il campione di cancro al pancreas in una parabola di Petri e rimuovere il tessuto necrotico circostante, il tessuto adiposo e il tessuto connettivo.
  3. Risciacquare il tessuto tumorale per 5-6 volte con cuscinetto di fosfato (PBS) e tagliare il tessuto in 1 mm3 pezzi utilizzando bisturi.
  4. Trasferire i tessuti triturati in 5 mL di HBSS in un tubo da 50 mL e aggiungere collagenase di tipo IV, ialuronidase e DNase I a concentrazioni finali di 200 unità/mL, 100 mg/L e 20 mg/L, rispettivamente. Pipette la miscela su e giù per mescolare bene.
  5. Incubare la miscela a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di biossido di carbonio del 5% per 15-20 min.
  6. Aggiungere 7 mL di DMEM al tubo e centrifugare a 110 x g per 5 min a 4 gradi centigradi quando la digestione è completa.
  7. Decant il supernatante e ri-sospendere la miscela tumorale in DMEM.
  8. Infilare il composto in una piastra Petri di 6 cm in 3 mL di mezzi di piena crescita (DMEM con 10% FBS, 20 g/mL di insulina, 100 ng/mL bFGF, 10 ng/mL EGF, 10 mS Y-27632, 100 g/mL primocina, 10 g/mL putrescine di idrochloride, 10 mMM di nicotinamide , 1% penicillina streptomica). Separare le celle in due gruppi.
  9. Nel gruppo I, aggiungere 100x inibitore dei fibroblasti del cancro al pancreas nel mezzo dopo 48 h per rimuovere i fibroblasti invasi, lasciando le cellule tumorali come i principali tipi di cellule;. Nel gruppo II, i fibroblasti supereranno le cellule tumorali entro una settimana.
  10. Coltura entrambi i gruppi di cellule per 1-2 settimana a seconda della densità /purezza delle cellule e cambiare i media ogni tre giorni. I tipi di cellule previsti in entrambi i gruppi I e II possono occupare oltre il 98% in proporzione in un esperimento di successo tipotico.

4. Etichettatura delle cellule con Lentivirus Che esprime il gene anti-apoptosi BCL2L1 (BCL-XL) e diverse proteine fluorescenti separatamente

  1. Produzione di lentivirus
    1. Piastra 3 x 106 cellule HEK 293T con mezzo DMEM completo (DMEM fornito con 10% FBS) in piatti e coltura 10 cm durante la notte a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di biossido di carbonio del 5%. Sostituire il mezzo con 6 mL di supporti senza sieri prima della trasfezione.
    2. Preparare la soluzione A: 8 g di vettori lentivirali contenenti BCL2L1(pCDH-EF1-mKate2-E2A-BCL2L1-WPRE o pCDH-EF1-eGFP-E2A-BCL2L1-WPRE), 2,4 g di pVSVG, 4 g di pMDL(Gag/Pol), 1,6 g di pREV e DMEM senza siero in un volume totale di 500 l. Delicatamente pipet la miscela più volte, e metterlo a temperatura ambiente per 5 min.
    3. Preparare la soluzione B: 40-L di PEI (polyethyleneimine) in DMEM senza siero 460 L. Posizionarlo a temperatura ambiente per 5 min.
    4. Aggiungere lentamente la soluzione B nella soluzione A e lasciare il tubo a temperatura ambiente per 30 min.
    5. Aggiungere la miscela finale nel piatto di coltura cellulare HEK 293T preparato al punto 4.1.1 e incubare a 37 gradi centigradi in un incubatore di biossido di carbonio del 5%. Dopo 12 h, aggiungere altri 5 mL del supporto DMEM completo. Dopo 48 h, raccogliere il mezzo contenente il lentivirus.
    6. Filtrare il supernatante utilizzando un filtro sterile da 0,45 m, aggiungere il supernatante in una colonna di concentrazione, centrifugare a 6.000 x g per 25-30 min a 4 gradi centigradi. Le aliquote di lentivirus di 100 gradi per tubo sono fatte e conservate a -80 gradi centigradi.
  2. Infezione delle cellule primarie
    1. Semina le cellule (gruppo I e II) da infettare in una piastra di 12 pozze con densità del 30-40% e coltura le cellule durante la notte a 37 gradi centigradi in un incubatore di anidride carbonica del 5%.
    2. Sostituire il mezzo con 500 luna di supporto senza siero contenente 8 g/mL di polibrene per 4 h. Quindi, aggiungere nel mezzo ulteriori 100 l del lentivirus (eGFP-E2A-BCL2L1 per il Gruppo I o mKate2-E2A-BCL2L1 per il Gruppo II). Dopo 12 h, sostituire il supporto con 1 mL di supporto completo.
    3. Controllare i marcatori di fluorescenza dopo 48 h.
    4. Raccogliere le cellule infette e mescolare a 1:1 rapporto con una concentrazione finale di 106/ mL.
    5. Centrifugare le cellule a 110 x g per 5 min e ri-sospendere la miscela cellulare in 50 : L di soluzione di iniezione (1640 medio con 10% FBS, 0.05% di sale di sodio acido ialuronico, 0,05% metilcellulosa).

5. Iniezione di sospensione mista di cellule nel pesce zebra

  1. Aggiungere 10 volte la soluzione di tricaina nell'acqua E3 per anetizzare le larve di pesce zebra e trasferire le larve (dal punto 2.3) alla piastra di iniezione riempita da E3 modificato (E3 con glucosio 1 g/L e 5 mmol/L-glutamine).
  2. Riempire 25 - L di sospensione mista delle cellule in aghi micro capillari e inserire l'ago nel manipolatore di microiniezione.
  3. Impostare la pressione e il tempo di iniezione. Inietta 50-80 cellule (8 nL) nel sacco del tuorlo di pesce zebra da 48 hpf.

6. Cultura del pesce zebra Xenoinfted (modello zPDX)

  1. Trasferire le larve di pesce zebra post-xenotrapianto in 40 mL di soluzione mix (soluzione E3 con 1 g/L di glucosio e 5 mmol/L-glutamine) a 32 gradi centigradi.

7. La Drug Administration sul pesce zebra Xenoinfted e la valutazione delle cellule tumorali/fibroblasti Viabilities

  1. Determinazione della concentrazione ottimale di gemcitabine/navitoclax.
    1. Mettere 10 embrioni di pesce zebra di tipo selvatico a 48 hpf in ogni pozzo di una piastra di 12 pozze.
    2. Aggiungere diverse concentrazioni di gemcitabine o navitoclax in ogni pozzo e incubare a 32 gradi centigradi per due giorni.
    3. Dopo 2 giorni, calcolare il dosaggio massimo di tolleranza (MTD) di gemcitabine e navitoclax in cui le larve di pesce zebra non hanno mostrato malformazione significativa e comportamento anormale, e le concentrazioni di lavoro sono impostate al di sotto della MTD.
  2. Trattamento di modelli zPDX con gemcitabine/navitoclax.
    1. Mettere 10 larve xenofted in ogni pozzo di un piatto di 12 pozze.
    2. Dividere le larve in quattro gruppi, trattare il gruppo di controllo in E3 contenente lo 0,1% di DMSO e trattare gli altri gruppi con 5 g/mL di gemcitabine e/o 50 navitoclax, e incubare a 32 gradi centigradi per due giorni.
  3. Valutazione delle viabilità cellulari e composizione cellulare nei modelli zPDX.
    1. Anestesizza le larve xenotrapianto dopo il trattamento e posizionale nel 3% di metilcellulosa.
    2. Immagina le larve dalla vista laterale usando un microscopio a fluorescenza o un microscopio confocale.
    3. Quantificare l'intensità dei segnali di fluorescenza rosso e verde utilizzando il software ImageJ e GraphPad.

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Risultati

Nella figura 1è presente una struttura schematizzata della procedura. In breve, le cellule del tessuto tumorale primario sono state semiate nel mezzo completo dopo la digestione con o senza l'aggiunta di inibitori fibroblasti del cancro al pancreas. Le cellule tumorali e i fibroblasti sono stati arricchiti come due distinte popolazioni che i fibroblasti dominavano senza inibitori, e la crescita delle cellule tumorali ha prevalso dopo l'aggiunta di inibitori (...

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Discussione

Entrambi i modelli PDX e CDX sono piattaforme vitali nel campo della biologia tumorale22,e la fase critica di un trapianto interspecie di successo è quello di migliorare la sopravvivenza dello xenotrapianto.  Recentemente, alcuni studi hanno dimostrato che l'espressione transitoria di BCL2L1 (BCL-XL) o BCL2 può migliorare significativamente la vitalità delle cellule staminali embrionali umane negli ospiti dei topi senza influenzare le identità cellulari e i destini

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Dichiarazioni

Non sono stati resi noti potenziali conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China 81402582, Natural Science Foundation of Shanghai 12D-2295100, 14YF1400600 e 18-R1404500

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEMGIBCOC11995500BT
FBSHyclonesv30087.03
Y-27632CliniscienceY0503Inibitore della chinasi Rho
Primocininvivogenant-pm-1un antibiotico per colture cellulari primarie
Putrescina dicloridratoSigmaP5780
NicotinamideSigmaN3376
Penicillina streptomicinaGIBCO15140122.00
Tampone fosfato (PBS)GIBCOC10010500CP
HBSSGIBCO14170112.00
Collagenasi tipo IVGIBCO17104019.00
IaluronidasiSigmaH3884
Dnasi ISigmaD5025
InsulinaSigmaI9278
b-FGFGIBCOPHG0264
EGFGIBCOPHG0314
Inibitore dei fibroblasti del cancro del pancreasCHI ScientificFibrOUT
0.45 μ m filtro sterileMilliporeSLHV033RB
Colonna di concentrazioneMilliporeMillipore UFC910008Concentrare il virus
PolybreneSigmaH9268
Acido ialuronico Sale sodicoSigmaH7630
L-glutamminaGIBCO21051024.00
Gemcitabina Gemzan
MetilcellulosaSigmaM0262
Navitoclax (ABT-263)SelleckS1001Bcl-xL inibitore
Equipment
MicroinjectorNARISHIGE
StereomicroscopioOLYMPUSMVX10
Microscopio confocaleLEICASP80,00

Riferimenti

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