Programma completo di autopsia per persone con sclerosi multipla

Summary

La sclerosi multipla è una malattia demielinante infiammatoria senza cura. L'analisi del tessuto cerebrale fornisce importanti indizi per comprendere la patogenesi della malattia. Qui discutiamo la metodologia e l'analisi a valle del tessuto cerebrale MS raccolti attraverso un programma di autopsia rapida unico in funzione presso la Cleveland Clinic.

Abstract

Descriviamo un programma di donazione rapida di tessuti per persone con sclerosi multipla (MS) che richiede che scienziati e tecnici siano disponibili 24 ore su 24, 7 giorni su 7, 365 giorni all'anno. I partecipanti acconsentono a donare il loro cervello e il midollo spinale. La maggior parte dei pazienti è stata seguita da neurologi presso il Cleveland Clinic Mellen Center for MS Treatment and Research. I loro corsi clinici e le disabilità neurologiche sono ben caratterizzati. Poco dopo la morte, il corpo viene trasportato al MS Imaging Center, dove il cervello viene scansionato in situ da 3 T risonanza magnetica imaging (MRI). Il corpo viene quindi trasferito nella stanza dell'autopsia, dove vengono rimossi il cervello e il midollo spinale. Il cervello è diviso in due emisferi. Un emisfero viene immediatamente collocato in una scatola di affettare e fette alternate spesse 1 cm sono fissate in paraformaldeide del 4% per due giorni o congelate rapidamente nel ghiaccio secco e nel metilbutane 2. Le fette cerebrali fisse brevi vengono conservate in una soluzione di crioconservazione e utilizzate per analisi istologiche e rilevamento immunocitochimico di antigeni sensibili. Le fette congelate sono conservate a -80 gradi centigradi e utilizzate per studi molecolari, immunocitochimici e di ibridazione/RNA in situ. L'altro emisfero è posto in paraformaldeide del 4% per diversi mesi, posto nella scatola di taglio, ri-scansionato nello scanner a risonanza magnetica 3 T (MR) e tagliato a fette di centimetro di spessore. Le immagini MR (MR) postmortem in situ (MRI) sono registrate con fette cerebrali spesse 1 cm per facilitare le correlazioni RM-patologica. Tutte le fette di cervello sono fotografate e vengono identificate le lesioni della materia bianca del cervello. Il midollo spinale è tagliato in segmenti di 2 cm. I segmenti alternati sono fissati in paraformaldeide del 4% o congelati rapidamente. Il rapido approvvigionamento di tessuti MS postmortem consente analisi patologiche e molecolari del cervello e dei midollo spinale e correlazioni patologiche delle anomalie della risonanza magnetica cerebrale. La qualità di questi tessuti postmortem rapidamente elaborati (di solito entro 6 h dalla morte) è di grande valore per la ricerca sulla SM e ha portato a molte scoperte ad alto impatto.

Introduction

Uno dei modi migliori per studiare una malattia è quello di esaminare il tessuto malato stesso. Questo presenta sfide a coloro che studiano le malattie del sistema nervoso centrale (SNC). Le biopsie del cervello e del midollo spinale malati sono estremamente rare e di solito coinvolgono casi atipici. I tassi di autopsia per gli individui affetti da malattie del SNC sono diminuiti drasticamente negli ultimi anni e, se eseguiti, spesso non forniscono un rapido approvvigionamento di tessuti. Queste sfide hanno portato alla creazione di banche cerebrali centrate sulla malattia, tra cui diverse si sono concentrate sulla raccolta di tessuti da individui con sclerosi multipla (MS). La SM è una malattia infiammatoria mediata del SNC che distrugge la mielina, gli oligodendrociti (cellule formanti mielina), i neuroni e gli assoni. La maggior parte dei pazienti affetti da SM ha un decorso della malattia bi-fasica che inizia con bout di disabilità neurologica con recupero variabile che alla fine si evolve in una malattia gradualmente progressiva che è probabilmente neurodegenerativa in natura¹. Per la maggior parte dei cervelli smstatunitensi donati, gli intervalli post-mortem (PMI) tra la morte e l'elaborazione dei tessuti superano i 24 ore. Mentre questi tessuti hanno fornito informazioni preziose per quanto riguarda i cambiamenti patologici nel cervello ms, non sono adatti per studi molecolari più avanzati che possono fornire potenti informazioni sulla fisiopatologia della malattia. Ciò è particolarmente vero per gli studi di profilazione genica, che richiedono RNA intatto.

Per superare i limiti di cui sopra, abbiamo sviluppato un programma di donazione rapida dei tessuti che consente la risonanza magnetica / correlazioni patologiche. Questo protocollo fornisce tessuti ben conservati adatti per moderni studi molecolari e consente il confronto diretto della patologia cerebrale e delle anomalie della risonanza magnetica nei cervelli della SM. Il programma di donazione di tessuti per la sclerosi multipla Cleveland è in vigore da oltre 20 anni. Questo programma di donazione rapida di tessuti procura cervelli e midollo spinale da individui con SM e altre condizioni neurologiche autoimmuni associate. Il programma mira ad ottenere risonanze magnetiche in situ entro 6 h dalla morte, seguite dalla rimozione del cervello e del midollo spinale per l'elaborazione dei tessuti.

arruolamento
Le donazioni sono ottenute tramite il consenso ante mortem ottenuto direttamente da pazienti (pre-aconsentiti) o dai parenti prossimi dopo la morte. I pazienti pre-consentiti sono tipicamente identificati dalla popolazione clinica presso il Mellen Center for Multiple Sclerosis Treatment and Research di Cleveland, Ohio. Anche se la preferenza nel reclutamento nel programma di donazione rapida dei tessuti è data ai pazienti che sono stati seguiti in studi di ricerca longitudinali, è aperto a tutti i pazienti visti al centro. Ai partecipanti che si iscrivono prima della morte vengono date istruzioni affinché i membri della famiglia o i fornitori di assistenza contattino il team di ricerca, al momento della morte o quando si ritiene che la morte sia imminente. Il secondo metodo per gli individui di entrare nel programma di donazione di tessuti è al momento della morte per consenso da parte dei parenti prossimi. Lo Stato dell'Ohio richiede che i decessi siano deferiti a un'organizzazione di approvvigionamento di organi con mandato federale chiamata LifeBanc, che opera in 20 contee dell'Ohio nord-orientale. LifeBanc esamina tutti i decessi per una diagnosi di SM, che è un'esclusione per la donazione di organi. Sono stati presi accordi per LifeBanc per informare gli investigatori del programma di donazione di tessuti MS per tutti i decessi con una diagnosi associata di SM che si verificano entro un raggio di 75 miglia dalla Cleveland Clinic. I parenti e il personale ospedaliero vengono quindi contattati dal personale del programma di donazione dei tessuti e il consenso viene ottenuto per la donazione di tessuti cerebrali e del midollo spinale. Questi due metodi di reclutamento ante-mortem e post-mortem attraverso LifeBanc si traducono in circa 10-12 donazioni cerebrali all'anno. Vengono apportate modifiche al limite massimo di età superiore di decesso per gestire il numero di referral derivati da LifeBanc.

Acquisto di donazioni
Il programma richiede una copertura di 24 ore, 365 giorni all'anno da parte dei membri del programma di donazione dei tessuti per l'approvvigionamento dei tessuti. Un sistema centralizzato di notifica di donazione di tessuti/ cercapersone/dispositivo mobile viene utilizzato dal team clinico che copre le donazioni di tessuti. LifeBanc viene fornito numeri per contattare il personale di chiamata per il programma di donazione di tessuti. I membri sono informati della morte dai fornitori ospedalieri/parenti prossimi (pre-acconsentiti) o da LifeBanc e altre fonti di riferimento. In primo luogo, viene fatta una determinazione dell'ora del decesso e la fattibilità della donazione dei tessuti. I decessi vengono quindi sottoposti a screening per condizioni che potenzialmente si traducono in tessuto di scarsa qualità, tra cui ipossia pre-mortem prolungata, tessuto cerebrale distruttivo massiccio (ad esempio, grandi emorragie intracraniche, lunghi ictus biemisferici, supporto prolungato del ventilatore (>3 giorni) e uso prolungato di agenti vasoattivi (>3 giorni) prima della morte. Quando un esaminatore medico è coinvolto in una morte, il neurologo dello studio può parlare con il medico legale per esplorare un modo per ricevere tessuti tempestivi senza compromettere la responsabilità del medico legale. Se si ritiene che il tessuto vitale sia presente, si ottiene il consenso scritto (se non ottenuto prima della morte) e vengono preparati per il trasporto del corpo. Un servizio di trasporto ingedente precedentemente contratto viene quindi contattato per il trasporto alle strutture di risonanza magnetica presso la Cleveland Clinic. Si presta attenzione a garantire che il corpo rimanga a temperatura ambiente e non venga messo in refrigerazione, poiché le temperature inferiori del corpo sono associate ad alterazioni delle caratteristiche del segnale di risonanza magnetica.

Storia clinica
La storia clinica comprende dettagli sulla diagnosi della SM, l'insorgenza dei sintomi, i trattamenti utilizzati, i risultati dei test clinici e paraclinici (potenziali evocati, risultati del liquido cerebrospinale, tomografia di coerenza ottica), la sclerosi multipla composita funzionale , e l'espansione della scala dello stato di disabilità (EDSS; effettiva o stimata), che vengono raccolte dalla cartella clinica (ove disponibile) e dal colloquio diretto dei parenti prossimi. Vengono raccolte anche la risonanza magnetica pre-mortem.

Protocol

Questo protocollo è stato approvato dal Cleveland Clinic Institutional Review Board e segue le linee guida del Comitato etico della ricerca umana Cleveland Clinic.

1. Risonanza magnetica in Situ

1. Portate il corpo donatore nella suite DI risonanza magnetica e conducite un protocollo di imaging RM di 2 ore presso il MS Imaging Facility. Condurre la risonanza magnetica su un imager da 3 T o 7 T.
   NOT: La priorità è data a 3T poiché la maggior parte dei dati legacy è stata eseguita su 3 T, ma quando non è disponibile, l'imaging viene condotto con 7T. Le sequenze di base designate vengono eseguite per tutti i casi (Tabella 1) e vengono eseguite sequenze aggiuntive che dipendono dagli interessi di ricerca attuali se i permessi di tempo (vincolati dal raggiungimento della fissazione dei tessuti inferiori a 12 h dopo la morte). Nella tabella 1 vengono descritte le sequenze principali.

2. Autopsia

NOT: Dopo la risonanza magnetica in situ, il corpo viene trasportato all'obitorio per l'estrazione del cervello e del midollo spinale da un diener e l'elaborazione dei tessuti da parte dei membri del laboratorio.

1. Eseguire i passaggi seguenti prima dell'arrivo del corpo all'obitorio. Due ore prima, preparare 3 L del 4% paraformaldeide (PFA) ed etichettare i contenitori e i sacchetti per lo stoccaggio dei tessuti. Preparare 3 L dell'8% PFA e diluire 1,5 L dell'8% PFA al 4% PFA. Collocare l'8% del PFA restante a 4 gradi centigradi per il giorno 2.
2. Prima di viaggiare all'obitorio, riempi 2 refrigeratori itineranti al 50% di capacità con ghiaccio secco (grandi blocchi rotti per adattarsi e piccoli pellet).
3. All'obitorio, riempire un contenitore in acciaio inossidabile a metà strada con 2-methylbutane e ghiaccio secco e coprire con un coperchio in preparazione per lo schiocco congelamento del tessuto.
4. Pesare e fotografare il cervello una volta rimosso dal diener.
5. Mettere qualsiasi dura attaccata in un contenitore pieno di PFA.
6. Separare il cervelletto e il tronco encefalico dal cervello e fotografare il cervello.
7. Identificare i nervi ottici, il chiasma e i tratti e separarli utilizzando una sonda e una pinzetta. Risedera la struttura con un bisturi.
   NOT: Il segmento distale di un lato del nervo ottico è contrassegnato con inchiostro di Higgins per l'identificazione.
8. Separare gli emisferi cerebrali longitudinalmente e fotografare ogni emisfero singolarmente.
9. Inchiostrare la corteccia motoria primaria (PMC) per l'emisfero sinistro, ri-fotografarlo e posizionarlo in un contenitore da 3,3 L per la fissazione a lungo. Documentare l'ora di inizio della fissazione del cervello.
10. Il PMC per l'emisfero destro può essere inchiostrato o espulso.
    1. Se viene emozionato, rimuovere prima le meningi di copertura.
    2. Ri-fotografare PMC inchiostrato o eccitato.
    3. Se PMC viene espulso, tagliare in 6 sezioni di dimensioni uguali.
    4. Inchiostrare l'aspetto rostrale di ogni sezione.
    5. Inserire le sezioni dispari in contenitori riempiti da PFA per la fissazione abbreviata.
    6. Blocca le sezioni pari e mettili in sacchetti congelatori sigillati in #1 di raffreddamento.
11. Tagliare l'emisfero destro dall'anteriore al posteriore in sezioni coronariche spesse 1 cm.
    1. Documentare le anomalie lorde (ad es. artefatto di taglio, emorragia e lesioni).
    2. Posizionare le sezioni dispari in contenitori riempiti con PFA per la fissazione abbreviata.
    3. Blocca le sezioni pari e mettili in sacchetti sigillati.
    4. Documento di fine del tempo di fissazione del cervello.
12. Separare il tronco encefalico dal cervelletto e posizionarlo in un contenitore riempito con PFA per una fissazione breve.
    1. Emisferi cerebellari separati longitudinalmente.
    2. Tagliare ogni emisfero in 4 sezioni sagittale altrettanto spesse.
    3. Fotografare viste mediali e laterali.
    4. Mettere le fette emisferiche del cerebellare sinistro in un contenitore riempito con PFA per una fissazione breve.
    5. Congela le fette emisferiche a cerebellare destra e mettili in sacchetti sigillati in #1 di raffreddamento.
13. Ottenere il midollo spinale con radici nervose dal diener.
    1. Rimuovere il midollo spinale dura mater e conservare la dura in un contenitore con PFA.
    2. Separare le radici nervose anteriori e destra sinistra e posteriore. Tagliare le radici nervose anteriori e posteriori anteriori e posteriori anteriori e posteriori tagliate dal midollo spinale e metterle in un contenitore riempito di PFA per una fissazione breve.
    3. Tagliare le radici nervose anteriori e posteriori anteriori e posteriori dal midollo spinale, bloccare-congelare, posto in sacchetti congelatori sigillati, e poi mettere in #2 più fresco.
    4. Fotografare la maggior parte dei 20 cm caudali del midollo spinale. Documentare la posizione dell'ingrandimento dello mbloso.
    5. Tagliare 2 cm sezioni trasversali del cavo procedendo da caudale a rostral.
    6. Inchiostrare l'aspetto rostrale di ogni sezione di taglio.
    7. Posizionare le sezioni dispari in contenitori riempiti con PFA per la fissazione abbreviata.
    8. Blocca le sezioni pari, mettili in sacchetti sigillati e poi in #2.
    9. Documentare l'ora di inizio della fissazione del midollo spinale ed eventuali anomalie gravi.
    10. Fotografare la restante parte rostrale del midollo spinale.
    11. Documentare la posizione dell'allargamento cervicale. Seguire i passaggi da 2.13.5–2.13.8 per il midollo spinale rimanente.
14. Dopo il posto dell'obitorio congelato tessuto in scatole etichettate in congelatori -80 . Conservare il tessuto fisso a 4 gradi centigradi.
15. A 24 ore dopo l'autopsia (giorno 2) diluire il restante 8% PFA al 4%.
16. Sostituire il 4% di PFA nei contenitori di fissaggio con un PFA appena diluito del 4%.
17. A 60 h post-autopsia preparare soluzioni di 2,5% glutaraldeide in 4% PFA da glutaraldeide, PFA, dH₂O e Sorenson buffer (preparato mescolando in sequenza: 0.2 M fosfato tampone pH 7.4, polivinylpyrolidone 1% w/v, saccarosio 30% w/v, e ethylene gcolly 30% v/v).
18. Rimuovere l'usato 4% PFA dai contenitori a fissaggio corto.
19. Risciacquare il tessuto nel buffer di Sorenson e inserirlo in soluzione di crioprotezione (glicerolo 20%, buffer di Sorenson 0,4 M 20% e 0,02% di azide di sodio in dH₂O).
20. Fotografa fette cerebrali fisse brevi, cervelletto, tronco encefalico e corteccia motoria (se applicabile).
21. Con una lama del bisturi tagliata 2 mm di spessore sezioni trasversali da ogni sezione del midollo spinale corto di 2 cm.
22. Mettere le sezioni in fiale scintillanti da 2 mL e riempirle con soluzione del 2,5% di glutaraldeide nel 4% di PFA.
23. Riportare la sezione rimanente alla fiala scintillata originale da 20 mL. Risciacquare la sezione con il tampone di Sorenson e sostituirla con una soluzione di crioprotezione.

3. Patologia

NOT: Le fette fisse brevi dell'emisfero destro e l'emisfero sinistro a lungo fisso (posizionato nel 4% di PFA per diversi mesi) vengono tagliate in 30 sezioni (definite free-floating) o incorporate nella paraffina e tagliate come sezioni da 12 a 14m (chiamate sezioni da 12 a 14m incorporato in paraffina). Queste sezioni vengono lavorate di solito con proteina proteolipida (PLP) per rilevare lesioni demielinanti e grande complesso di istocompatibilità II (MHC-II) per l'attività immunitaria utilizzando il metodo di diaminobenzindine (DAB). Questi protocolli sono stati standardizzati e utilizzati in diverse pubblicazioni^{2,3,4,5,6,7,8,9 , 10} del sistema ^{, 11 Del} sistema di ^{, 12}.

1. Free-Floating (30 m) DAB-Avidin-Biotin Complex (ABC) Tissue Coloring (30 m)
   1. Rimuovere le sezioni dalla soluzione criostorage, trasferire le sezioni in una piastra a sei pozze e lavarle 3 x per 5 min ciascuna in 2 mL di 1x fosfato tampone buffered pH 7.0 (PBS). Durante il trasferimento al pozzo successivo nel pozzo a sei pozze, fare attenzione a non strappare il tessuto. Durante ogni passaggio di lavaggio e incubazione, posizionare la piastra a sei pozzetto su uno shaker e lasciare che il tessuto tremi delicatamente.
      NOT: Le sezioni di tessuto incubate in volumi più piccoli e in piastre più grandi (ad esempio, piastre da 12 e 24 pozze) tendono a presentare lacerazioni superficiali e di bordo.
   2. Eseguire il recupero dell'antigene mediante microonde in un becher di vetro contenente circa 30 mL di 10 mM di tampone di citrato (pH 6.0). Assicurarsi che i tessuti non siano piegati manipolando con un pennello e le sezioni a microonde per 2-3 min o fino a quando il tampone di citrato inizia a bollire. Lasciare raffreddare le sezioni a temperatura ambiente (20 min).
   3. Trasferire le sezioni in una piastra a sei pozzetti e lavare le sezioni 3x per 5 min ciascuna in 2 mL di PBS/0,3% Triton X-100. Bloccare le perossie endogene incubando sezioni in 2 mL del 3% H₂O₂/0,3% Triton X-100/PBS per 30 min a temperatura ambiente (RT).
   4. Lavare le sezioni 3x per 5 min ciascuna in 2 mL di PBS/0,3% Triton X-100. Sezioni di blocco in 2 mL del 3% di siero di capra normale/0,3% Triton X-100/1x PBS per 1 h a RT.
   5. Incubare sezioni durante la notte a 5 giorni (a seconda dell'anticorpo) negli anticorpi primari diretti contro microglia e mielina epitopi per rilevare l'infiammazione (MHCII) e la demielinizzazione (PLP) (vedi tabella deimateriali) a 4 gradi centigradi.
      NOT: Assicurarsi che le sezioni non siano piegate durante l'incubazione in questa fase o nei passaggi successivi in quanto ciò porterà ad aree all'interno delle sezioni prive di macchie.
   6. Lavare le sezioni 3x per 5 min ciascuna in 2 mL di 1x PBS. Poi incubare sezioni in anticorpi biotinylati secondari (vedi la Tabella dei Materiali) per 1 h a RT. Preparare la soluzione del complesso Avidin-Biotin (ABC) durante l'incubazione circa 45 minuti prima della prossima fase di lavaggio per consentire la formazione di complessi ABC.
   7. Lavare le sezioni 3x per 5 min ciascuna in 2 mL di 1x PBS. Quindi incubare sezioni in ABC per 1 h a RT.
   8. Lavare le sezioni in 2 mL di 1x PBS tre volte per 5 min ciascuna. Incubare sezioni nel DAB filtrato (2 mL/pozzo/sezione) contenenti H₂O₂ (1:500 diluizione del 30% H₂O₂ in DAB) fino a quando il colore non si sviluppa adeguatamente (3-8 min).
   9. Lavare le sezioni 3x per 5 min ciascuna in 2 mL di 1x PBS. Per migliorare il segnale (opzionale), osmicate utilizzando 0.04% OsO₄ (30 s).
   10. Lavare le sezioni tre volte per 5 min ciascuno in 1x PBS. Singolarmente, trasferire ogni sezione dalla piastra a sei pozzetti in un piccolo contenitore pieno di 1x PBS e posizionare la sezione di tessuto su un vetrino di vetro il più piatto possibile.
   11. Sollevare delicatamente il vetrino dal PBS garantendo al contempo che la sezione del tessuto sia il più piatta possibile. Utilizzando due pennelli, appiattire delicatamente e allungare il tessuto sul vetrino e tamponare via l'acqua in eccesso con un tovagliolo di carta. Montare le sezioni di tessuto con glicerolo (o un supporto di montaggio equivalente) e sigillare la coverslip con uno smalto trasparente.

4. Sezioni emisferiche incorporate in paraffina: colorazione DAB

1. Sciogliere la paraffina dagli scivoli in un forno da 60 gradi centigradi per 5-10 min.
2. De-paraffinare le sezioni incubando in xilene 3x per 5 min ciascuna.
3. Reidratare il tessuto in etanolo graduato al 100% (2x per 5 min ciascuno), 95% (2x per 5 min), 70% (2x per 5 min ciascuno) e 50% (1x per 5 min ciascuno). Coprire le diapositive in PBS.
4. Antigene recuperare da diapositive microwaving in un becher di 10 mM citrate buffer (pH 6.0).
5. Lavare i vetrini in 1 x PBS (3x per 5 min ciascuno) una volta raffreddati a temperatura ambiente. Bloccare le perossie endogene incubando tessuto nel 3% H₂O₂/1% Triton-X 100/PBS per 30 min.
6. Lavare il tessuto in 1x PBS tre volte per 5 min ciascuno. Bloccare il tessuto con il 6% del siero di capra normale in PBS per 1 h.
7. Incubare sezioni nell'anticorpo primario (vedi la Tabella dei Materiali) in PBS a temperatura ambiente (RT) durante la notte (max 20 h).
8. Lavare le sezioni 3x per 5 min ciascuna in 1x PBS. Quindi incubare le sezioni nell'anticorpo secondario corrispondente (vedere la tabella dei materiali) in PBS per 1 h a RT.
9. Preparare la soluzione ABC circa 45 minuti prima della prossima fase di lavaggio durante l'incubazione.
10. Lavare le sezioni 3x per 5 min ciascuna in 1x PBS e poi incubare in ABC per 1 h a RT.
11. Lavare la sezione 3x per 5 min ciascuno in 1x PBS.
12. Incubare le sezioni in DAB filtrato (dimensione dei pori del filtro 0,45 m) contenente H₂O₂ (1:500 diluizione del 30% H₂O₂ in DAB) fino a quando il colore non si sviluppa adeguatamente (3-8 min).
13. Sezioni di lavaggio (3x 5 min) in 1x PBS. Per migliorare il segnale, osmicate utilizzando 0.04% tetrossido di osmio (OsO₄; circa 30 s).
14. Sezioni di lavaggio (3x 5min) in 1x PBS.
15. Tessuto disidratato in una serie graduata di etanolo 50% (1x 5min), 70% (1x 5min), 95% (2x 5min), 100% (2x 5 min), e 100% xilene (1x 5min). Lasciar evaporare gli xileni.
16. Montare sezioni con supporti di montaggio a secco a secco a base di toluene. Si raccomandano le formulazioni che contengono antiossidanti per prevenire lo sbiancamento delle macchie. Rimuovere il supporto di montaggio in eccesso dai bordi della diapositiva con un rasoio per la successiva conservazione.

5. Correlazioni RM/Patologia

NOT: Per correlare la risonanza magnetica con la patologia, eseguiamo prima la risonanza magnetica ex vivo dell'emisfero cerebrale intatto a lungo fissato (passaggio 2.9 sopra) in una scatola regolabile con marcatori visibili alla RISONANZa magnetica che indicano fessure di taglio. Poi tagliamo il cervello e fotografiamo le fette di 1 cm per consentire la co-registrazione delle risonanze magnetiche in situ alle singole fette di cervello. Possiamo quindi eseguire analisi guidate dalla risonanza magnetica, in cui le regioni di interesse (ROI) vengono identificate sulla risonanza magnetica per l'analisi diretta dei tessuti. Possiamo anche eseguire analisi guidate da istopatologia, in cui i ROI sono identificati sui tessuti (ad esempio, lesioni di materia bianca, materia bianca senza demielinazione, ecc.) e poi caratterizzati dalle misure di risonanza magnetica co-localizzate (tabella1).

1. Identificazione dei ROI basati sulla risonanza magnetica
   NOTA: Negli studi precedenti, abbiamo identificato roi in materia bianca^{11,12,13,14,15} e materia grigia^{16,17, 18}. L'esempio seguente è per l'analisi della materia bianca.
   1. Le lesioni iperintense del segmento T2 sulle risonanze magnetiche in situ (dal passaggio 1.1), inizialmente elaborate da un algoritmo automatico, e quindi corrette manualmente dagli utenti esperti.
   2. Le lesioni ipointense del segmento T1 all'interno delle lesioni T2 come voxel con un'intensità del segnale inferiore o uguale all'80% dell'intensità del segnale del tessuto cerebrale che appare normalmente circostante.
   3. Aree ipointense del segmento nelle mappe del rapporto di trasferimento di magnetizzazione (MTR) con una soglia dell'80%.
   4. Creare tre classificazioni utilizzando le suddette segmentazioni: (a) lesioni solo T2 che sono anormali sulle scansioni T2-pesate/FLAIR ma normali su scansioni T1 o MTR, (b) lesioni T2T1MTR, che sono anormali su tutte le scansioni T2-pesate, t1-pesate e MTR; e (c) materia bianca (NAWM), che sono normali su tutte le scansioni T2-pesato/FLAIR, T1-pesato, e MTR.
      NOT: La nostra selezione di sezioni si basa sull'esistenza di tutti e tre i tipi di regioni di interesse (solo T2, T2T1MTR e NAWM) sulle stesse sezioni.
   5. Calcolare le intensità normalizzate per ogni ROI per ridurre al minimo la variabilità derivante da diversi cervelli e diverse posizioni del cervello.
2. Co-registrazione della risonanza magnetica in situ alle fette cerebrali
   1. Scansiona l'emisfero cerebrale fisso in una scatola di taglio personalizzata con quattro file di marcatori sensibili alla risonanza magnetica che localizzano le fessure in cui è possibile inserire un coltello per tagliare il cervello. Eseguire un'acquisizione MPRAGE 3D ponderata T1 con risoluzione isotropica di 1 mm che copra il cervello fisso e tutti i marcatori.
      NOT: Questo è chiamato risonanza magnetica post-fissazione e viene utilizzato solo come passaggio intermedio per la co-registrazione delle risonanze magnetiche in situ alle fette cerebrali.
   2. Subito dopo la scansione, tagliare l'emisfero cerebrale in fessure situate a 1 cm di distanza, ottenendo circa 15 fette.
   3. Fotografa le fette cerebrali sia sul lato anteriore che su quello posteriore.
   4. Coregistrare la risonanza magnetica in situ e le fotografie delle fette cerebrali con i seguenti passaggi.
      1. Per la segmentazione della non-fissazione e dell'MPRAGE in situ, pre-elaborare sia le RISONANZe MPRAGE post-fissazione e in situ per la non uniformità di intensità¹⁹.
         1. Segmentare il cervello e quattro righe di marcatori da MPRAGE pre-elaborato post-fissazione.
         2. Segmentare l'emisfero corrispondente alla risonanza magnetica post-fissazione^20,21 dall'MPRAGE in situ pre-elaborato.
      2. Coregistrare le risonanze magnetiche in situ e post-fissazione estraite dal cervello attraverso una serie di processi di registrazione lineare fino a 12 gradi di libertà (registrazione affine) utilizzando FSL FLIRT²². I componenti di ridimensionamento e taglio tengono conto dell'effetto del ritiro della fissazione.
      3. Trovare la direzione normale del piano di sezionamento riducendo al minimo la somma delle intensità massime proiettate utilizzando i marcatori segmentati. Questi angoli di riorientamento sono incorporati nella matrice di trasformazione ottenuta dal passaggio precedente.
      4. Abbina visivamente le immagini della risonanza magnetica alle fotografie di sezioni cerebrali posteriori fisse utilizzando un visualizzatore di immagini interno che consente di modificare la profondità e l'orientamento dei vettori normali. Piccole modifiche sono necessarie perché il taglio del cervello è imperfetto.
      5. Applicare la trasformazione dell'immagine AFFINE¹³ per ogni sezione per trasformare le risonanze magnetiche in situ nelle stesse posizioni di sezionamento delle fotografie delle sezioni del cervello.

Results

Come accennato in precedenza, quasi la metà dell'emisfero cerebrale è congelato e disponibile per studi molecolari che utilizzano DNA, RNA o proteine. Storicamente, è stato dimostrato che studi che utilizzano tessuti cerebrali postmortem sono stati influenzati da condizioni pre-mortem, età, sesso, pH tissutale, integrità dell'mRNA (RIN), intervallo postmortem (PMI), certezza diagnostica, uso di sostanze comorbide e trattamento stato²³. Sulla base di studi che utilizzano tessuti cerebrali, il DNA e le proteine sembrano essere influenzati da una minore misura rispetto all'RNA. Sulla base della nostra esperienza, l'isolamento dell'RNA e l'analisi a valle, tuttavia, sono stati trovati per essere più colpiti dalle condizioni pre-mortem e intervallo post-mortem del tessuto cerebrale. Discutiamo quindi alcune delle condizioni da seguire per condurre l'analisi basata sull'RNA utilizzando tessuti MS postmortem.

Per tutti i nostri studi, dopo che il cervello è raccolto all'autopsia, viene tagliato (1 cm di spessore) e quindi fissato nel 4% di paraformaldeide per studi morfologici o rapidamente congelato per analisi biochimiche. Tutti i blocchi di tessuto sono caratterizzati per la demielinazione mediante immunostaining utilizzando PLP come descritto sopra. Uno schema di analisi rappresentativo è illustrato nella Figura 1. Le sezioni tissutali vengono esaminate per la presenza di lesioni di materia bianca (Figura 1A). Le regioni selezionate sono macchiate per l'attività immunitaria (Figura 1B) e la demielinazione (Figura 1C). Il tessuto congelato è montato sul criostato (Figura 1D) e vengono tagliati i tratti congelati da 30 m. Questo è seguito da raccolta di 3-4 sezioni successive, separazione dai tessuti adiacenti, e stoccaggio per il DNA, RNA, o isolamento delle proteine. Utilizzando questo protocollo, abbiamo isolato con successo DNA^24,25, RNA^5,6,7,8,9 così come proteine²⁶. Mentre vengono discussi i principali risultati di alcuni degli studi che analizzano l'RNA dai cervelli della SM, ecco alcune delle questioni relative all'analisi dei cervelli DELLA SM postmortem dell'RNA.

Figura 1: Raccolta di campioni per l'analisi dell'mRNA. (A) Il tessuto dell'autopsia viene selezionato per l'analisi. Le aree di tessuto sono selezionate e una porzione di tessuto viene eccitata. Tutte le sezioni sono colorate con (B) MHC-II (Major histocompatibility complex (MHC) di classe II HLA-DR CR3/43) anticorpo per rilevare l'attività infiammatoria e con (C) proteina proteolipida (PLP) per determinare lo stato della mielina utilizzando protocolli pubblicati. In base allo stato della mielina, il blocco viene segnato da un bisturi (D). Le sezioni (60 m) vengono tagliate (E) e le aree precedentemente segnate vengono rimosse, separate in tubi ed etichettate (F). Le macchie PLP e MHC-II vengono ripetute dopo ogni 5 sezioni per garantire una corretta raccolta dei tessuti. La materia bianca che appare normalmente (NAWM) è nota e le lesioni della materia bianca (WML) sono evidenziate in rosso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Transezione assonale nelle lesioni di MS¹⁰. Un primo obiettivo scientifico di questo programma era la caratterizzazione dei componenti cellulari delle lesioni demielinated della materia bianca. Tra gli antigeni localizzati vi erano neurofilamenti non fosforati (NF). La maggior parte delle NF sono fosforilate negli assoni mielinati. Dopo la demielinazione, gli assoni sono depforolilati. Abbiamo rilevato l'espressione prevista di NF non fosforiliati negli assoni demielinati. Nelle lesioni acute della SM, molti di questi assoni demielinati terminarono come bulbi di retrazione assonale (Figura 2A), che riflettono le estremità prossimali degli assoni transected. Gli assoni transected superano gli 11.000 mm³ nelle lesioni acute rispetto alle regioni normali adiacenti¹⁰. Queste osservazioni hanno aiutato a catalizzare un cambiamento di paradigma nella ricerca sulla SM che ha spostato il campo verso la caratterizzazione della neurodegenerazione come principale causa di disabilità neurologica permanente negli individui con SM.

Figura 2: transezione assule durante la demielinazione infiammatoria. La transezione assonale si verifica durante la demielinazione infiammatoria (A, le punte di freccia) e induce la formazione di ovoidi assonali terminali (A, frecce). Quando quantificati (B), gli assoni transected sono abbondanti nelle lesioni da SM e sembrano correlare con l'attività infiammatoria della lesione. Pannello A riprodotto da Trapp et al.¹⁰ con il permesso. Rosso: proteina proteolipida, verde: neurofilamento antifosforillato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Remielination nei cervelli sminissici³. La remielinazione può essere robusta durante le prime fasi della SM. Molte lesioni croniche di SM, tuttavia, non sono remielinated. Abbiamo studiato se la presenza di cellule progenitrici oligodendrocite (OPC) o la generazione di nuovi oligodendrociti limita la remielinazione delle lesioni della materia bianca cronicamente demielinate. Mentre la densità OPC era spesso diminuita, erano presenti in tutte le lesioni cronicamente demielinate³. Gli oligodendrociti appena generati erano presenti anche in molte lesioni croniche della SM. Processi oligodendrociti associati, ma non ha mielinato assoni demielinati (Figura 3). Questi studi indicano che gli OPC e la loro capacità di produrre nuovi oligodendrociti non limitano la remielinazione delle lesioni croniche della materia bianca. Abbiamo ipotizzato che gli assoni cronicamente demielinati, che spesso apparivano distrofici, non fossero ricettivi alla remielinizzazione da parte degli oligodendrociti di nuova produzione.

Figura 3: Processi di oligodendrociti pre-mielinatori associati agli assoni. Vengono mostrate le micrografie confocali delle lesioni MS macchiate con anticorpi PLP (rosso nei pannelli A, B) e anticorpi neurofilamenti (verde nei pannelli A, B). Un oligodendroctide pre-miellinante (rosso nel pannello A) nella zona subventricolare (SV) processi estesi nella regione degli assoni demielinati (verde nel pannello A) in una lesione smabile cronica. Molti di questi processi (frecce nel Pannello A) hanno fatto una spirale intorno agli assi, come mostrato con maggiore ingrandimento (Pannello B). Le barre della scala rappresentano 20 m (A) e 5 m (B). Riprodotto da Chang et al.³ con il permesso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Disfunzione mitocondriale in MS⁶. Abbiamo eseguito una ricerca imparziale dei cambiamenti genici neuronali nella corteccia motoria congelata rapidamente ottenuta da pazienti con smandamine cronici (Figura 4A). Una ricerca imparziale di questo set di dati ha identificato riduzioni significative in 23 mRNA mitocondriali con codifica nucleare in MS (Figura 4B). Gli studi sulle credenziali che utilizzano l'immunocitochimica e l'ibridazione in situ hanno indicato che questi geni erano altamente arricchiti nei neuroni di proiezione corticale (Figura 4C) e che i mitocondri isolati dagli assoni di proiezione mostrano una glicolisi ridotta ( Figura 4D). Questo documento ha catalizzato un focus sulla disfunzione mitocondriale e ha ridotto la produzione di ATP come un importante contributo alla degenerazione assonale nella SM.

Figura 4: Dati microarray e tecniche di convalida a valle eseguite nella corteccia motoria MS. (A) Clustering gerarchico di trascrizioni significativamente modificate dai campioni di corteccia motoria di controllo (C1-C6) e SPMS (MS1-MS6), che supportano separatamente i modelli di espressione genica correlati alla malattia. Tra le trascrizioni in diminuzione nella corteccia motoria MS, ventisei appartenevano alla catena di trasporto degli elettroni (B). L'mRNA complesso mitocondriale I (NDUFA6) è stato diminuito nei neuroni (n - 55-130) nella corteccia motoria MS (CII) rispetto al controllo (CI), mentre le densità di mRNA PLP erano simili tra il controllo (CIII) e la corteccia cerebrale MS (CIV). L'attività dei complessi di trasporto elettronico I e III è stata diminuita in frazioni arricchite mitocondriali dalla corteccia motoria dei pazienti affetti da SM (n - 3) (D). Ristampato da Dutta et al.⁶ con il permesso. Le barre di errore rappresentano SEM; La barra della scala in CI-IV è di 25 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Patogenesi della disfunzione cognitiva in MS⁸. Dal quaranta al 60% dei pazienti affetti da SM ha un declino cognitivo e una ridotta funzione esecutiva. Abbiamo identificato l'ippocampo, che è un sito funzionale di memoria/apprendimento, come un sito comune per la demielinazione nella SM. Abbiamo poi confrontato l'espressione genica neuronale negli ippocampi mielinati e demielinati e abbiamo trovato riduzioni significative nei mRNA neuronali che codificano le proteine coinvolte nella memoria/apprendimento. Abbiamo esteso questi dati dimostrando che i microRNA selezionati sono aumentati nell'ippocampo demielinato e che questi microRNA possono diminuire l'espressione dei recettori del glutammato. Abbiamo riprodotto ed esteso queste osservazioni nei modelli di roditori. Abbiamo poi confrontato l'espressione genica neuronale negli ippocampi mielinati e demielinati e abbiamo trovato riduzioni significative nelle proteine di codifica dell'mRNA neuronale coinvolte nella memoria/apprendimento.

Figura 5: Raccolta dei tessuti, analisi istologica e studi sull'espressione genica nell'ippocampo della SM. Le fette cerebrali contenenti ippocampo vengono selezionate durante l'autopsia (A) e l'ippocampo e la regione adiacente vengono rimossi (scatola rossa) per ulteriori analisi. L'immunostaining per PLP ha mostrato la conservazione della mielina in tutti i controlli (B) e il 40% degli ippocampi MS (C). È stata rilevata un'estesa demielinazione nel 60% degli ippocampi MS (D). Rispetto agli ippocampi di controllo (E, G, I), non è stata rilevata una significativa perdita neuronale nelle regioni CA1, CA3 o CA4 di ippocampi DEmielinati (F, H, J) come mostrato dalla immunohistochimica HuR. L'immunofluorescenza a doppia etichettatura per la mielina di base (MBP), verde) e gli assoni (SMI32, rosso) ha mostrato una perdita di mielina (L) con relativa conservazione degli assoni (N) nell'ippocampo ms demyelinated rispetto all'ippocampo di controllo ( MBP, K; SMI32, M). Il doppio clustering dei livelli di espressione dell'mRNA ha disposto i campioni in cluster discreti in base allo stato di mielina (mielinato e demielinato) e alla posizione (ippocampo vs corteccia motoria) (O). Alti livelli di mRNA sono indicati da rosso e blu denota bassi livelli di espressione. Pannelli C-O Adattato da Dutta et al.⁸ con il permesso. B-D: 2 mm, E-J: 100 m, K-N: 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Correlazioni patologiche dei cambiamenti di risonanza magnetica¹². Mentre la risonanza magnetica è un indicatore prezioso della diagnosi di SM e della risposta al trattamento, ed è anche un predittore della progressione della malattia di SM, le correlazioni patologiche dei cambiamenti della risonanza magnetica sono poco comprese. I nostri studi di risonanza magnetica post-mortem si sono concentrati su due ROI di risonanza magnetica. ROI cerebrali di materia bianca che erano solo iperintensi T2 (solo T2) e ROI che avevano una combinazione di ipointensità T1, iperintensità T2 e rapporto di trasferimento magnetizzazione ridotto (MTR) (T2T1MTR). Circa il 45% dei ROI cerebrali solo T2-materia bianca sono stati mielinati, confermando la loro natura non specifica. Al contrario, l'83% dei ROI T2T1MTR erano cronicamente demielinati e apparivano come buchi neri. I valori T1 e MTR sono semi-quantitativi e i loro valori variavano ampiamente nei ROI T2T1MTR. Se la perdita della mielina è l'unico contributore a questi cambiamenti di risonanza magnetica, allora i valori dovrebbero essere costanti. Assoni demielinati swollen erano correlati a i valori T1 e MTR.

Figura 6: I rapporti di trasferimento di magnetizzazione (MTR) e i rapporti di contrasto T1 sono linearmente correlati alla percentuale di assoni^{naci-positivi}di Na -/K^- ATPase nelle lesioni smetriche croniche. Le lesioni cronicamente demielinate macchiate per Na^:/K^- ATPase (verde) variavano da quasi il 100% (A) a zero (B) nel neurofilamento (rosso). Molti assoni senza Na^s/K^- ATPase avevano aumentato i diametri (B). Un confronto tra lapercentuale di assoni na ,/K^- Assoni positivi all'ATPase nelle lesioni MS cronicamente demielinate, è correlata al rapporto di contrasto quantitativo postmortem (p < 0.0001, C) e T1 (p < 0.0006, D). Ogni punto dati proviene da una singola lesione e ogni combinazione colore-simbolo unica denota uno dei cervelli studiati. Barre di scala - 5 m. Riprodotte da Young et al.¹² con il permesso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Neurodegenerazione indipendente dalla demielinazione¹¹. Storicamente, la neurodegenerazione nella SM è stato pensato per derivare dalla demielinazione. Studi di imaging cerebrale, tuttavia, hanno sollevato la possibilità che la neurodegenerazione e la demielinazione possano essere eventi indipendenti. Recentemente abbiamo identificato una sottopopolazione di pazienti affetti da SM che hanno la demielinazione del midollo spinale e della corteccia cerebrale, ma non della materia bianca cerebrale. Abbiamo coniato questo sottotipo MS come MS mielocorticale (MCMS). I casi di MCMS hanno fornito una piattaforma per studiare la relazione tra la demielinazione cerebrale della materia bianca e la perdita neuronale corticale. Rispetto alle cortice di controllo, la perdita neuronale corticale è stata significativamente maggiore nelle cortice MCMS rispetto alle tipiche cortice MS. Il tessuto cerebrale di controllo è stato ottenuto dal Dipartimento di Patologia della Cleveland Clinic. Questo studio fornisce la prima prova patologica per la neurodegenerazione in assenza di demielinazione.

Figura 7: Perdita neuronale in assenza di demielinazione cerebrale di materia bianca. Una sezione emisferica coronale color viola cresyl da un individuo classificato come aventi la sb tipica (A). Le densità neuronali sono state confrontate negli strati corticali III, V e VI in ciascuna delle cinque aree etichettate. I neuroni con un'area superiore a 60 m² (giallo) sono mostrati in un'immagine rappresentativa della corteccia temporale superiore (B). L'etichettatura per il PLP e la distribuzione delle lesioni demielinate (la demielinazione in materia bianca è evidenziata in blu; la demielinizzare subpiale è evidenziata in rosa) in sezioni emisferiche da individui con sM(C) e MS mielocorti (D ) vengono visualizzati. Una correlazione significativa tra ridotta densità neuronale corticale e aumento del volume di lesione della materia bianca cerebrale è stata trovata nella MMs tipica, ma non nella MS mielocorticale (E); linee tratteggiate indicano un intervallo di confidenza del 95% (CI). IFG - giro frontale inferiore. STG - giro temporale superiore. INi - insula inferiore. IM: insula superiore. CG - cingulate giro. Riprodotto da Trapp et al.¹¹ con il permesso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Durata sequenza	Sequenza Descrizione	Uso della sequenza
0:09 (in detto: 09)	Localizer	Localizzazione per sequenze successive
9:14	Magnetizzazione 3D ha preparato l'eco a gradiente rapido (MPRAGE)	Imaging strutturale Stima volumetrica delle strutture cerebrali
05:14	Recupero dell'inversione attenuata del fluido 3D (FLAIR)	Identificazione delle lesioni lesioni Valutazione delle lesioni volumetriche
02:35	2D T2 ponderato	Identificazione delle lesioni lesioni Valutazione delle lesioni volumetriche
05:12	Eco 3D richiamata a gradiente con trasferimento magnetizzazione pre-impulso ( MT-ON)	Misura presunta del contenuto di mielina nel normale acomparsa e tessuto lesionale
05:12	Eco 3D richiamata a gradiente senza trasferimento magnetizzazione pre-impulso ( MT-OFF)
0:27 (in detto 0:27)	Mappatura dei campi DTI (Diffusion Tensor Imaging)	Misura della diffusione dell'acqua nel tessuto cerebrale pensato per riflettere l'integrità del tessuto cerebrale.
10:27	Multi-shell Diffusion Tensor Imaging (DTI)
1:18 (in detto il 18 o il	Multi-shell Diffusion Tensor Imaging (DTI)
39:48:00	SUBTOTALE: CORE

Tabella 1: Protocollo di imaging postmortem.

Discussion

Descriviamo un protocollo che è stato utilizzato per procurare ed elaborare rapidamente tessuti da oltre 150 individui con SM. Una caratteristica importante di questo protocollo è che gli scienziati che utilizzano il tessuto sono anche incaricati di stabilire il protocollo e di eseguire la raccolta dei tessuti. Ciò offre flessibilità nel soddisfare le esigenze scientifiche dei singoli progetti di ricerca. Diversi aspetti di questo protocollo ne migliorano l'utilità. I pazienti sono di solito ben caratterizzati prima della morte, poiché molti di loro sono stati seguiti da neurologi nel nostro centro. Un passo critico è l'elaborazione delle donazioni di tessuti subito dopo la morte, che aumenta la qualità del tessuto congelato rispetto ad altre banche cerebrali. Ciò consente studi molecolari di grande valore nel descrivere i cambiamenti nei prodotti genici trascrizionali e traslazionali, che sono essenziali per la giustificazione delle osservazioni istologiche e immunocitochimiche. L'utilizzo di dati morfologici/immunocitochimici e molecolari in più casi migliora l'affidabilità delle conclusioni. Questo è meglio illustrato dalla nostra descrizione dei cambiamenti genici mitocondriali nella corteccia cerebrale e nei cambiamenti dei geni neuronali negli ippocampi demielinati. Nuovi protocolli di profilazione genica sono in fase di sviluppo a un ritmo rapido e il tessuto congelato nella nostra banca dovrebbe fornire RNA di alta qualità per l'analisi dei tessuti e delle singole cellule.

Un altro aspetto apprezzato del nostro protocollo sono le fette cerebrali fisse brevi. Questi tessuti sono tagliati in sezioni di 30 m di spessore e galleggianti. Queste sezioni sono ideali per l'utilizzo della microscopia confocale per analizzare due o più antigeni in tre dimensioni. Buoni esempi includono l'interazione di processi oligodendrociti pre-mielinanti con assoni distrofici nelle lesioni croniche della SM, nonché l'identificazione di singole connessioni assonali ai bulbi di retrazione assonale transected. Questo è in contrasto con l'uso di routine di 7 sezioni di paraffina di spessore m, dove le immagini 3D non sono fattibili. I tessuti incorporati nella paraffina hanno un grande valore per alcune domande, in particolare la quantificazione delle densità neuronali nelle sezioni emisferiche 7 di m di spessore. I nostri protocolli di lavorazione dei tessuti, quindi, sono diversi e forniscono flessibilità per assicurare tessuti fissi e rapidamente congelati.

Un'altra caratteristica unica del nostro protocollo è la risonanza magnetica cerebrale post-mortem in situ. Le risonanze magnetiche cerebrali sono un biomarcatore insostituibile della malattia ms. È quindi essenziale stabilire le correlazioni patologiche dei segnali di risonanza magnetica anormali. I nostri studi hanno stabilito che sia T2 solo e T2T1MTR ROIs sono spesso mielinati. Questa scoperta supporta la necessità di modalità di imaging più specifiche che distinguano in modo affidabile tra materia bianca cerebrale mielinato e demielinato. La risonanza magnetica sembra essere sensibile per la rilevazione della mielina, ma i nostri studi dimostrano che anche una combinazione di T1/T2/MTR non è specifica per identificare la mielinazione. Il nostro protocollo postmortem fornisce una piattaforma ideale per testare la capacità di nuove modalità di imaging per distinguere tra materia bianca cerebrale mielinata e demielinata. La risonanza magnetica fornisce anche il veicolo ideale per la traduzione dei risultati scientifici di base nella pratica clinica, dato l'uso della risonanza magnetica nella nostra ricerca traslazionale e il suo uso clinico diffuso nei pazienti viventi.

Mentre il taglio di fette corte e lunghe fisse e congelate offre un vantaggio per la lavorazione del tessuto in più modalità per diversi studi, ci sono alcune limitazioni con questo metodo. La valutazione dell'intera struttura può essere limitata in quanto parti di essa possono essere elaborate in modo diverso su sezioni adiacenti. Il grande volume della banca dei tessuti, tuttavia, offre la capacità di studiare una struttura di interesse in più soggetti per migliorare il campionamento. Un'altra limitazione generale agli studi che utilizzano tessuti postmortem è che sono trasversali. Le conclusioni relative alla tempistica e alla progressione dei cambiamenti devono essere interpretate in questo contesto. Ci può essere un pregiudizio di selezione per i pazienti che donano i loro tessuti, che può limitare la generalizzazione dei dati a tutti i pazienti con SM. Poiché la maggior parte dei donatori muore a nome di complicazioni della SM avanzata, potrebbe non essere appropriato estrapolare i risultati da questi pazienti a quelli nelle fasi precedenti della SM. Tuttavia, abbiamo ricevuto tessuti da pazienti più giovani che sono morti per patologie non correlate alla SM (ad esempio, infarto miocardico acuto, sovradosaggio di droga, suicidio). L'ambito del nostro protocollo non comprende il campionamento di altri organi (ad esempio, il midollo gastrointestinale e osseo) che sono stati implicati nella SM. Crediamo che i punti di forza del programma superino di gran lunga i suoi limiti.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticorpi
Capra biotinilata anti-topo	IgG Vector Laboratories	BA-9200	diluizione 1:500 per emisferico; 1:1.000 per 30µ m free-floating. RRID: AB_2336171
	Diluizione 1:500	IgG Vector Laboratories	anti-coniglio di capra biotinilata
Capra biotinilata anti-ratto IgG	Vector Laboratories	BA-9400	diluizione 1:500 per emisferico; 1:1.000 per 30µ m free-floating. RRID: AB_2336208
Proteina dell'acido fibrillare gliale (GFAP)	Dako	Z0334	diluizione 1:700 per emisferico. RRID: AB_10013382
HuR, IgG di topo, clone 3A2	Santa Cruz	SC-5261	1:500 per 30µ m free floating. RRID: AB_627770
Complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) classe II HLA-DR CR3/43	Dako	Mo746	diluizione 1:250 per emisferico; 1:500 per 30 µ m free floating. RRID: AB_2313661
Neurofilamento non fosforilato (SMI32)	Biolegend	801701	diluizione 1:5.000 per emisferico; 1:2.500 per 30 &; m free-floating. RRID: AB_2564642
Neurofilamento fosforilato (SMI31)	Biolegend	801601	diluizione 1:5.000 per emisferico; 1:2.500 per 30 µ m free-floating. RRID: AB_2564641
Proteolipid protein (PLP)	Regalo da Wendy Macklin		Diluizione 1:250 per IHC; anticorpi anti-PLP alternativi disponibili in commercio.
Reagenti
125 mm carta da filtro	Whatman	1452-125	Per filtrare PFA.
microscopia elettronica	glutaraldeide	16320	Grado di microscopia elettronica.
Cytoseal	ThermoScientific	8310-16
Glicole etilenico	Fisher Chemical	BP230-4
Glicerolo	Sigma-Aldrich	G7893	400 mL/2 L Soluzione di crioprotezione.
Millex-HV Unità filtro per siringhe, 0,45 &; micro; m, PVDF, 33 mm, sterilizzato a raggi gamma	Millipore-Sigma	SLHV033RB
Paraformaldeide	Microscopia elettronica Scienze	19200	Forma Prills.
Polivinilpirolidone (PVP-40)	Fisher Chemical	BP220-212
Sodio azide	Fisher Chemical	S227I	2 g/2 L tampone di Sorenson.
Sodio fosfato bibasico	Sigma-Aldrich	S0876	98,8 g/2 L tampone di Sorenson.
Sodio fosfato monobasico monoidrato	Sigma-Aldrich	S9638	14.352 g/2 L tampone di Sorenson.
Saccarosio	Sigma-Aldrich	PVP40-500G
VectaStain ABC Kit	Vector Laboratories	PK-6100	Diluizione 1:1.000 di A e B. RRID: AB_2336819
Inchiostro nero da disegno impermeabile	Higgins	44201
Xylene	Fisher Chemical	X3S	Grado istologico.
Equipment
3T Magnetom Magnetom Prisma	Siemens Healthineers
7T MRI Agilent 830AS	Siemens Healthineers