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Articolo metodologico

Modello di impatto corticale controllato di lesioni cerebrali del topo con trapianto terapeutico di cellule neurali derivate da cellule staminali indotte dall'uomo

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⸱

DOI:

10.3791/59561

⸱

10 luglio 2019

 ,  , 
1Center for Neuroscience and Regenerative Medicine, Uniformed Services University, 2Department of Anatomy, Physiology, and Genetics, Uniformed Services University, 3Graduate Program in Neuroscience, Uniformed Services University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo dimostra le metodologie per un modello murino di lesioni cerebrali traumatiche a cranio aperto e il trapianto di cellule derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane coltivate nel sito della lesione. Test comportamentali e istologici dei risultati di queste procedure sono descritti anche in breve.

Abstract

La lesione cerebrale traumatica (TBI) è una delle principali cause di morbilità e mortalità in tutto il mondo. Patologia della malattia a causa di TBI progredisce dall'insulto meccanico primario ai processi di lesioni secondarie, tra cui apoptosi e infiammazione. La modellazione animale è stata preziosa nella ricerca di svelare i meccanismi di lesione e valutare potenziali terapie neuroprotettive. Questo protocollo descrive il modello di impatto corticale controllato (CCI) del TBI focale e a testa aperta. In particolare, vengono descritti i parametri per produrre una lieve lesione corticale unilaterale. Le conseguenze comportamentali del CCI vengono analizzate utilizzando il test di rimozione del nastro adesivo dell'integrazione sensoriale-continua bilaterale. Per quanto riguarda la terapia sperimentale per la patologia TBI, questo protocollo illustra anche un processo per il trapianto di cellule coltivate nel cervello. Le colture di cellule neurali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) sono state scelte per il loro potenziale per mostrare un ripristino funzionale superiore nei pazienti con TBI umana. La sopravvivenza cronica degli hiPSC nel tessuto cerebrale del topo ospite viene rilevata utilizzando un processo immunohistochimico DAB modificato.

Introduzione

Lesione cerebrale traumatica (TBI) è un termine generale per la lesione acquisita al cervello a causa di forze meccaniche indirette (accelerazione/decelerazione rotazionale o contro-colpo) da colpi alla testa o danni diretti da oggetti o onde di scoppio. La TBI è stata stimata essere la causa di circa il 9% dei decessi a livello mondiale e osservata in circa 50 milioni di casi all'anno1,2. Un rapporto del 2017 dei Centers for Disease Control and Prevention ha stimato che nel 2013 ci sono stati 2,8 milioni di visite ospedaliere e decessi dovuti a TBI negli Stati Uniti3. Molti TBI più lievi non vengono segnalati ogni anno. La TBI grave può portare a una compromissione permanente della cognizione, della funzione motoria e della qualità generale della vita. Le conseguenze del lieve TBI, in particolare il TBI sportivo ripetitivo, sono state apprezzate solo di recente per i loro insidiosi effetti sulla salute4,5.

La modellazione preclinica è una componente vitale dello sviluppo di nuove intuizioni meccanicistiche e di una potenziale terapia rigenerativa per la TBI. Il modello a impatto corticale controllato (CCI) di TBI è un modello a testa aperta di lesioni da contusione meccanica alla corteccia. I parametri di impatto possono essere modificati per produrre lesioni CCI che vanno da lievi a6. Le lesioni CCI sono focali piuttosto che diffuse, come si è visto con altri modelli a testa chiusa di TBI. CCI può essere eseguito per indurre una lesione unilaterale, in modo tale che la corteccia contralaterale può servire come un comparatore interno. Questo protocollo dimostra le caratteristiche di un CCI lieve a una porzione della corteccia che comprende le regioni somatosensoriali e motorie primarie. Questa zona corticale è stata scelta per il suo coinvolgimento nei comportamenti sensomotori per i quali numerosi test di comportamento possono rilevare deficit indotti da lesioni7. Miglioramenti comportamentali dovuti a interventi terapeutici per la TBI possono essere rilevati, pure.

Un segno distintivo della TBI è diffusa disfunzione neurale nella regione ferita. I neuroni feriti subiscono la morte cellulare, e la connettività della rete neuronale viene interrotta8,9. La TBI interrompe il reclutamento di cellule staminali endogene, il che porta a ulteriori deficit di comportamento a valle10,11.  Il trapianto di cellule staminali neurali e cellule derivate da cellule staminali è stato esplorato come una possibilità per ripristinare la funzione nel cervello ferito. Oltre al potenziale per ripristinare i circuiti neurali danneggiati, le cellule trapiantate esercitano effetti paracrini che promuovono la sopravvivenza neuronale e il recupero funzionale da TBI12. Una varietà di tipi di cellule sono stati trapiantati preclinicamente per valutare il loro potenziale rigenerativo in modelli di disturbi neurologici13,14,15. La recente divulgazione della tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotta16 ha facilitato lo sviluppo di numerose linee di cellule staminali umane per uso sperimentale. Il test preclinico con cellule derivate da hiPSC è un primo passo importante per caratterizzare la potenziale efficacia terapeutica di una data linea cellulare contro le malattie umane. Questo laboratorio ha sviluppato protocolli per differenziare gli hiPSC ai fenotipi neurali17 alla ricerca di cellule trapiantate per aiutare il recupero da lesioni cerebrali traumatiche.

Gli esperimenti in questo protocollo utilizzano un CCI unilaterale per indurre la TBI alla corteccia somatosensoriale e motoria sinistra dei topi adulti. Una lieve lesione CCI si traduce in un deficit funzionale sostenuto nella pedina destra che viene utilizzato per monitorare gli effetti dell'innesto di cellule neurali derivato da hiPSC sul recupero funzionale. Il forepaw sensorimotor testing in questo protocollo è stato adattato dalla metodologia stabilita da Bouet e colleghi18 e dimostrato in precedenza da Fleming e colleghi19.  Questo protocollo delinea un flusso di lavoro completo per l'esecuzione di una lesione cerebrale sperimentale, il trapianto terapeutico di cellule hiPS e l'analisi comportamentale e istologica delle misure di esito sperimentale.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti descritti in questo protocollo sono stati esaminati e approvati dall'Uniformed Services University Animal Care and Use Committee.

1. Craniectomia e impatto corticale controllato

  1. Preparazione del dispositivo a impatto corticale controllato e delle forniture chirurgiche.
    1. Caricare una siringa a punta di scivolamento da 1 mL con 0,5 mL di salina sterile per l'irrigazione delle ferite. Attaccare un ago da 25 G alla siringa per controllare l'irrigazione.
    2. Preparare una soluzione diluita della CsA in DMSO alla concentrazione finale di 1 mg/mL. Caricare una seconda siringa a punta di scivolamento da 1 mL con 0,5 mL di ciclospificina A (CsA) per l'immunosoppressione. Attaccare un ago da 25 G o più grande alla siringa CsA.
    3. Attaccare il pistone a impatto corticale controllato a un braccio su un telaio stereotassico e impostare ad un angolo di 15 gradi. Attaccare una sonda impattatrice da 3 mm al pistone.
    4. Impostare la velocità di impatto a 1,5 m/s e il tempo di perdono dell'impatto a 0,1 s per produrre una lieve lesione corticale.
  2. Eseguire una craniectomia unilaterale
    1. Posizionare il topo in una camera di induzione per anestesia collegata a un vaporizzatore isoflurano con fonte di ossigeno compresso. Indurre l'anestesia con il 3% di isoflurane a 0,7 dollari l/min di ossigeno. Controllare la profondità dell'anestesia per la mancanza di risposta al dito-pizzico.
    2. Rasare il cuoio capelluto con clipper elettrici e pulire via qualsiasi pelliccia sciolta.
    3. Posizionare il mouse in una cornice stereotassica con collegato anestetico consegna naso cono.
      1. Posizionare un pad riscaldante impostato a 37 gradi centigradi sul telaio stereotaxic sotto il mouse per mantenere la temperatura corporea in anestesia. Fissare la testa in posizione con barre auricolari e una barra morso e orientare la testa in modo che l'osso frontale cranio è orizzontale. Mantenere l'anestesia a 1,5%-2% isoflurano per tutta la durata dell'intervento.
    4. Per eseguire cure preoperatorie e preparazione chirurgica asettica, applicare unguento oftalmico antibiotico agli occhi utilizzando un tampone di cotone sterile. Applicare una soluzione a base di iodio per l'area del cuoio capelluto rasata. Rimuovere questo con 70% di etanolo. Coprire l'animale con un drappo chirurgico fenerato in modo che la parte superiore della testa sia visibile, ma gli occhi siano coperti.
    5. Fare un'incisione mediana (1,5-2 cm) sul cuoio capelluto utilizzando un bisturi o forbici.  Utilizzare tamponi di cotone sterili per pulire la ferita e per cancellare la fascia sinistra della linea mediana a bregma.
    6. Utilizzare la sonda dell'impatto per identificare il sito della craniectomia.
      1. Impostare il punto di riferimento stereotaxic (X , 0, Y e 0) su bregma.  Regolare la sonda lateralmente a 2 mm a sinistra della linea mediana. Delineare un cerchio di 5 mm di diametro intorno alla sonda utilizzando un pennarello chirurgicamente sicuro. Sollevare e ruotare l'ursolo fuori posizione.
    7. Utilizzare lo strumento a mano del kit a micromotore rotante ad alta velocità per fare un foro aperto nel cranio utilizzando una punta rotonda di 0,6 mm o una punta di perforazione da 0,8 mm a una velocità massima del 70%-80%. Applicare una leggera pressione sul cranio durante la perforazione lungo il contorno circonferenziale di 5 mm per diradare questo bordo.
      1. Non applicare la pressione in eccesso durante la perforazione. Ciò può causare lesioni corticali a causa di vibrazioni, compressione o penetrazione accidentale. Lasciare la velocità della punta di perforazione per fare il lavoro.
      2. Non forare in un dato punto per troppo tempo per evitare il riscaldamento in eccesso di attrito del cranio. Irrigare la craniectomia di tanto in tanto con sterile salina per rimuovere i detriti e per ridurre il riscaldamento dallo strumento rotante.
      3. Prestare molta attenzione durante la perforazione sulla linea di sutura coronale come questi punti sono vulnerabili all'emorragia.
    8. Utilizzare un paio di pinzette fini per rimuovere il lembo del cranio quando il contorno cranico è sufficientemente assottigliato. Afferrare il lembo mediamente, e sollevare delicatamente e tirare lateralmente con un movimento radiale.
      1. Non danneggiare la dura mater durante il sollevamento del lembo; questo può causare gravi lesioni ed emorragie.
  3. Eseguire una lesione d'impatto corticale leggermente controllata
    1. Pulire la sonda dell'impattante con un cuscinetto sterile per la preparazione dell'alcool. Spostare la sonda dell'impatto in posizione sulla corteccia esposta. Abbassare la sonda fino a toccare la superficie dura mater. Contrassegnare questa posizione come .
    2. Ritirare il pistone e spostarsi a -1,0 mm. Scarico del pistone per avere un impatto sulla corteccia.
    3. Sollevare rapidamente il pistone e spostare il braccio fuori posizione. Applicare generose quantità di salina per irrigare la corteccia dopo l'infortunio. Sciacquare il sito di chirurgia con la salata in base alle esigenze e suturare l'incisione del cuoio capelluto utilizzando semplici stiches interrotte con sutura di seta 5.0.
  4. Eseguire la cura postoperatoria del mouse
    1. Interrompere l'anestesia. Consegnare la CsA con iniezione sottocutanea in missuria a 10 mg/kg di dose. Posizionare il mouse in una gabbia postoperatoria pulita e preriscaldata.
    2. Fornire analgesico di acetaminofene nell'acqua potabile a 1,0 mg/mL.
      NOTA: Fornire analgesia secondo la procedura operativa standard IACUC appropriata e in considerazione delle variabili di risultato sperimentale (ad esempio, sedazione, neuroinfiammazione).
    3. Fornire cibo inumidito chow in una gabbia di recupero riscaldata per aiutare nella reidratazione e recupero.
  5. Procedere dalla sezione 2 alla sezione 4 precedente quando si eseguono controlli solo craniectomia (sham).

2. Trapianto stereotaxico di sospensione cellulare

  1. Iniziare la procedura di trapianto di cellule circa 24 h dopo craniectomia.
  2. Preparare le attrezzature per il trapianto di cellule e le forniture chirurgiche
    1. Riempire una siringa a punta di scivolamento da 1 mL con una salina sterile per l'irrigazione delle ferite. Attaccare un ago da 25 G alla siringa per controllare l'irrigazione.
    2. Riempire una siringa a punta di scivolamento da 1 mL con una soluzione CsA per l'immunosoppressione. Attaccare un ago da 25 G o più grande alla siringa CsA. Ricaricare la siringa CsA in base alle esigenze tra un intervento chirurgico e l'altro.
    3. Preparare aghi di vetro da 1,0 mm OD borosilicate vetro capillary pipette utilizzando metodi standard.
    4. Utilizzare una pinzetta fine per rompere le punte degli aghi a circa un diametro di circa 200 m. Assicurarsi che l'albero cilindrico dell'ago non sia più lungo di 2,5 cm.
  3. Calibrare la pompa della siringa per l'uso con una siringa da 10 ll.  Immettere una portata di 0,2 l/min per fornire un volume totale di 2,0 l.
  4. Preparare la sospensione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC).
    1. Eseguire tutta la gestione cellulare in una coltura cellulare BSL-2 cofano utilizzando tecniche di manipolazione sterile standard.
    2. Preparare le colture cellulari in anticipo in base alle condizioni standard definite per il tipo di cella. Fare riferimento a Lischka et al.17 come esempio.
      NOTA: Gli esperimenti illustrati in questa dimostrazione hanno utilizzato varie cellule fenotipi neurali derivate da hiPSC.
    3. Dissociare delicatamente le cellule in una sospensione a cella singola utilizzando una soluzione di distacco cellulare o altri mezzi enzimatici o chimici preferiti.
    4. Contare le celle in sospensione, quindi diluire la sospensione a 5 x 104 celle/L nel mezzo di coltura cellulare minima (ad esempio, DMEM) in una provetta superiore flip 1.7 mL.
    5. Osservare le seguenti note per il trapianto:
      1. Mantenere le cellule in sospensione a 37 gradi centigradi per la durata delle procedure.
      2. Caricare la siringa solo immediatamente prima di eseguire l'iniezione intraparenchymicmica (passaggio 4.5 sotto).
        NOTA: La gravità può causare la sospensione della cella di stabilirsi o di aggrapparsi al lato della siringa se posata su un lato. Questo porta a irregolarità nel numero di cellule iniettate.
      3. Allocare 5 x 105 cellule (10 ssuspensionre) per topo se si eseguono più procedure di trapianto di cellule in un giorno.
  5. Eseguire la chirurgia dei trapianti stereotassici
    1. Posizionare il topo in una camera di induzione per anestesia collegata a un vaporizzatore isoflurano con fonte di ossigeno compresso. Indurre l'anestesia con il 3% di isoflurane a 0,7 dollari l/min di ossigeno.
    2. Posizionare il mouse in una cornice stereotassica con il cono del naso anestetico collegato.
      1. Fissare la testa in posizione con barre auricolari e una barra morso e orientare la testa in modo che l'osso frontale cranio è orizzontale. Mantenere l'anestesia a 1,5%-2% isoflurano per tutta la durata dell'intervento.
    3. Eseguire cure preoperatorie e preparazione asettica
      1. Applicare unguento oftalmico idratante contenente antibiotico agli occhi utilizzando un tampone di cotone.
      2. Lavare il sito di incisione con salina sterile per pulire il sito e allentare le suture. Applicare delicatamente il 70% di etanolo con un tampone di cotone per sterilizzare il sito di incisione.
    4. Rimuovere le suture con pinzette sottili e forbici oftalmiche. Irrigate sito di chirurgia e craniectomia con abbondante salina sterile.
      1. Considerare l'animale per l'esclusione se la corteccia mostra caratteristiche squalificanti tra cui ernia eccessiva, scolorimento, vascolarizzazione interrotta, o emorragia.
    5. Caricare la siringa del trapianto di cellule
      1. Spostare la sospensione cellulare dall'incubatore a 37 gradi centigradi a un cofano di biosicurezza per la coltura cellulare. Ruotare delicatamente o toccare il tubo per garantire una sospensione omogenea delle cellule.
      2. Utilizzare un micro pipettor per caricare le sospensioni cellulari da 7,5 dollari nella siringa di Hamilton attraverso l'estremità dello stantuffo.
        1. Tenere la siringa con un angolo di 120 dollari con l'estremità dello stantuffo rivolta verso il basso. Inserire lo stantuffo, facendo attenzione a non introdurre una bolla d'aria tra la sospensione e la punta dello stantuffo.
      3. Fissare l'assemblaggio della guarnizione all'ago della pipetta, quindi attaccare l'ago alla siringa.
      4. Spingere lo stantuffo per spostare la sospensione cellulare nell'ago della pipetta.  Se c'è resistenza contro il deflusso delle sospensioni, utilizzare una pinzetta fine per rompere la punta dell'ago per ingrandire il diametro.
    6. Fissare la siringa alla pompa di siringa stereotassica.  Avanzare lo stantuffo per assicurarsi che l'assemblaggio della pompa di siringa funzioni correttamente.
    7. Spostare l'ago nelle coordinate per l'iniezione.
      1. Allineare la punta dell'ago al bregma. Impostare le coordinate X e Y su 0. Quindi spostare la punta dell'ago sopra la craniectomia a 2,0 mm laterale e -1,0 mm posteriore al bregma.  Toccare la punta dell'ago sulla superficie dura mater e impostare la coordinata stereotassica su .
      2. Spingere lo stantuffo per assicurarsi che la sospensione cellulare scora adeguatamente prima di introdurre l'ago nel cervello.
      3. Introdurre l'ago nel cervello ad una profondità di -1,4 mm. Queste coordinate stereotassiche collocano l'innesto sul bordo grigio materia-materia bianco della corteccia profonda20.
    8. Avviare la pompa della siringa per infondere la sospensione cellulare. Impostare il timer del banco di laboratorio su 15 min e avviarlo. Utilizzare un microscopio a lunga distanza di lavoro per monitorare il deflusso delle sospensioni cellulari.
      1. Irrigare il sito di chirurgia con salina sterile durante l'iniezione per mantenere l'idratazione dei tessuti.
      2. A 15 min, ritirare lentamente l'ago del trapianto.  Irrigare il sito di chirurgia con salina e chiudere l'incisione con suture.
    9. Eseguire le cure postoperatorie
      1. Interrompere l'anestesia. Consegnare la CsA con iniezione sottocutanea in missuria a 10 mg/kg di dose. Posizionare il mouse in una gabbia postoperatoria pulita e preriscaldata.
      2. Fornire analgesico di acetaminofene nell'acqua potabile a 1,0 mg/mL.
        NOTA: fornire analgesia in base al protocollo operativo standard IACUC appropriato (SOP) e in considerazione delle variabili di risultato sperimentale.
      3. Fornire gabbia di recupero cibo chow inumidito per aiutare nella reidratazione e recupero.
  6. Continuare le iniezioni giornaliere di CsA a 10 mg/kg per tutta la durata di sopravvivenza del topo.

3. Test di rimozione del nastro adesivo di integrazione sensomotoria

  1. Tagliare il nastro elettrico in strisce da 3 mm x 5 mm utilizzando un piccolo coltello da rasoio prima di eseguire il test del comportamento. Utilizzare una superficie di vetro liscia per tagliare le strisce adesive.
    NOTA: Utilizzare la gialla e la burocrazia, poiché i topi hanno difficoltà a distinguere tra questi colori21.
    1. Selezionare un piccolo specchio che si adatta bene all'interno della scatola di plastica trasparente.
      1. Fissare lo specchio in posizione con un angolo di circa 45 gradi con la modellazione di argilla o nastro adesivo al fine di visualizzare il comportamento animale dal basso.
    2. Posizionare l'assemblaggio di scatola e specchio su una panca in una tranquilla sala di prova del comportamento dedicato.  Disporre il cilindro sulla scatola di plastica sopra lo specchio.
    3. Disporre il panno di movimentazione, le pinzette e le strisce adesive sul banco accanto alla scatola di prova del comportamento.
    4. Pulire la scatola e il cilindro con il 70% di etanolo e asciugamani di carta.  Lasciare asciugare accuratamente le superfici.
    5. Portare i topi nella sala prove del comportamento. Lasciare che i topi si acclimati noto alla sala prove per almeno 30 minuti prima del test del comportamento.
    6. Rimuovere l'approvvigionamento idrico dalle gabbie per ridurre al minimo gli eventi di minzione durante i test, che possono interferire con prestazioni di test efficienti.
  2. Eseguire il test di rimozione dell'adesivo
    NOTA: Questo test di comportamento viene eseguito al meglio da due o tre ricercatori: uno per azionare i cronometri e uno o due per gestire i topi e osservare il comportamento.
    1. Utilizzare ogni pinzetta per sbucciare una striscia adesiva di ogni colore.
      1. Scegliere quale colore striscia corrisponde a cui pazon e rimanere coerenti per tutta la prova.
    2. Utilizzare il panno di manipolazione per trattenere un topo dalla mischia del collo e della schiena in modo che il mouse tiene le zampe anteriori lontano dal suo corpo e dalla testa.
    3. Utilizzare una pinzetta per posizionare una striscia adesiva sulla superficie plantare di ogni zampa anteriore. Utilizzare una pressione delicata e coerente delle dita per fissare le strisce alle zampe.
    4. Posizionare rapidamente il mouse nel cilindro di plastica. Avviare i due cronometri quando il mouse ha tutte e quattro le zampe sulla scatola di plastica.
    5. Utilizzare i due cronometri per registrare le latenze per i seguenti quattro eventi: avviso zampa sinistra, rimozione della zampa sinistra, avviso zampa destra, rimozione della zampa destra.
      1. Registrare un evento di avviso quando l'animale fa un riconoscimento inequivocabile della striscia adesiva scuotendo o indietreggiando la zampa o mordendo la striscia.
      2. Registrare un evento di rimozione quando l'animale rimuove efficacemente la striscia dalla superficie del plantare della zampa anteriore.
        NOTA: l'evento remove non viene squalificato dalla leggibilità della striscia o se la striscia si aggrappa alla superficie laterale della zampa anteriore.
      3. Arrestare il timer a 120 s se la striscia corrispondente non è stata rimossa.
      4. Registrare i tempi trascorsi per i quattro eventi nel foglio dati.
    6. Eseguire una seconda prova su ogni mouse
      1. Lasciare trascorrere un minimo di 5 minuti tra le prove di un singolo topo per ridurre lo stress, che può interferire con le prestazioni efficienti durante il test.
      2. Pulire l'apparecchio con gli asciugamani di carta tra i topi di prova per rimuovere i rifiuti durante il test di più topi da una singola gabbia.
        1. Pulire accuratamente l'apparecchio con il 70% di etanolo e asciugamani di carta durante il test dei topi da più gabbie.
      3. Invertire l'ordine di posizionamento della zampa di colore per la seconda prova della sessione per randomizzare qualsiasi effetto di colore.
    7. Calcolare la latenza media di ogni evento tra due prove per sessione giornaliera per ogni animale.
  3. Pulire accuratamente l'apparecchio e maneggiare accuratamente il panno con acqua, sostituire le riserve d'acqua della gabbia e riportare i topi al loro impianto di detenzione.
  4. Ripetere i passaggi da 3.1-3.2 in tempi sperimentali successivi per una progettazione di prove a misure ripetute.
    NOTA: ripetere i passaggi 3.2.1-3.2.5.3 al giorno per 5 giorni prima della raccolta dei dati per acclimatare gli animali all'attività. Si raccomanda l'acquisizione dei dati di base prima dell'intervento chirurgico.

4. Analisi immunohistochimica di diaminobenzidina (DAB) della sopravvivenza dell'innesto e della patologia delle lesioni

  1. Eutanasia gli animali ed esegui una perfusione transcardiale.
    1. Preparare soluzioni di 0,1 M di salina tampina tampone di fosfato (PBS) e 4% paraformaldeide (PFA) in PBS. Bilanciare il pH di entrambe le soluzioni a 7.4.
    2. Posizionare le due soluzioni sul ghiaccio in una cappa di fumi. Mettere una pompa peristaltica nel cofano del fume, e far funzionare la pompa per riempire il tubo con PBS. Impostare la portata della pompa su 7 ml/min.  Collegare un ago da 25 G al tubo di uscita della pompa.
    3. Mettere un vassoio di drenaggio con un substrato morbido nel cofano. Sollevare un'estremità del vassoio con una leggera angolazione in modo che i fluidi di perfusione si scarichino all'estremità inferiore.
    4. Posizionare un topo in una camera di induzione per anestesia. Riempire la camera con il 4% di isoflurane utilizzando gas compresso 100% gas a ossigeno veicolo.
    5. Spostare il topo anestesizzato dalla camera ad un cono naso di anestesia. Diminuire l'isoflurana al 2%.
    6. Eseguire una toracotomia per esporre il cuore. Interrompere l'anestesia, come la toracotomia provoca eutanasia.
    7. Posizionare con attenzione l'ago di deflusso della pompa di perfusione nel ventricolo sinistro lungo il lungo asse del cuore. Non perforare il setto cardiaco, in quanto ciò causerà una cattiva perfusione.
    8. Utilizzare piccole forbici per tagliare l'atrio destro, quindi accendere immediatamente la pompa peristaltica.
    9. Continuare il flusso PBS fino a quando il fluido lasciando l'atrio destro esaurisce il sangue.
      1. Spegnere la pompa. Spostare il tubo di assunzione della pompa nel contenitore di PFA. Riavviare la pompa. Continuare a perfinere la PFA fino a quando l'animale non è sufficientemente rigido o fino a quando non è stato pompato un volume di 20 mL.
      2. Spegnere la pompa. Rimuovere l'ago di deflusso dal cuore. Spostare il tubo di assunzione dal PFA al PBS, e lavare completamente PFA dal tubo.
  2. Togliere il cervello dal cranio con un'attenta dissezione. Posizionare il cervello in un piccolo contenitore pieno di 4% di paraformaldeide, e consentire al cervello di post-fissare durante la notte a 4 gradi centigradi.
  3. Il giorno dopo la post-fissazione, sostituire la P con PBS e 0,1% azide di sodio. Memorizzare i cervelli in questa soluzione fino alla preparazione per il sezionamento istologico.
  4. Raccogliere 40-50 m di tessuto cerebrale fissato di formaldeide attraverso un microtoma di congelamento o vibratoma a temperatura ambiente.
  5. Pretratta i tessuti in 0,3% di perossido di idrogeno nell'acqua per inattivare le perossi endogene, che possono produrre macchie non specifiche.
  6. Eseguire il recupero dell'antigene utilizzando il tampone di acido citrico (10 mM di citrato di sodio, 0,05% polispoli-20, pH 6,0) a 60 gradi centigradi per 30 min.
  7. Eseguire l'etichettatura degli anticorpi con metodi standard.  Fare riferimento a Lundell et al. s relazione22 da questo laboratorio per maggiori dettagli.
    1. Utilizzare un kit di neutralizzazione IgG del mouse (vedere Tabella deimateriali) per ridurre la reattività incrociata con anticorpi endogeni. Incubare i tessuti nel buffer di neutralizzazione IgG per almeno 1 h a temperatura ambiente (RT), seguendo le indicazioni del produttore.
    2. Utilizzare un antigene primario anti-uomo anti-uomo (hNA; 1:500 diluizione) durante il trapianto di cellule umane derivate da iPSC per individuare le cellule trapiantate. Incubare i tessuti con l'anticorpo primario a 4 gradi centigradi per 48-72 h utilizzando agitazione delicata.
    3. Dopo aver risciacquato la soluzione primaria anticorpale, incubai i tessuti con anticorpo secondario anti-tono coniugato HRP a 1:250 di diluizione per 2 h a RT.
    4. Eseguire la reazione al cromogeno DAB con metodi standard per rivelare l'immunoetichettatura. Lasciare che la reazione DAB si sviluppi per 5-10 min alla RT.
  8. Attaccare i tessuti macchiati ai vetrini e applicare gli scivoli di copertura utilizzando metodi standard.
  9. Quantificare il numero di cellule etichettate utilizzando la stereologia imparziale come descritto in precedenza23,24. Eseguire l'analisi utilizzando 20 sezioni ottiche di 20 m e un intervallo tra tre sezioni.

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Risultati

La chirurgia della craniectomia facilita la lesione cerebrale sperimentale e il trapianto di cellule terapeutiche: il modello di impatto corticale controllato della lesione cerebrale e la successiva terapia per il trapianto di cellule richiedono un'attenta rimozione del cranio sovrastante. La craniectomia può essere eseguita su qualsiasi superficie dorsale del cranio per consentire manipolazioni alla regione di interesse del cervello. Il diagramma in Figura 1 illustra uno sc...

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Discussione

CCI mite come sistema modello per testare la terapia rigenerativa sperimentale
Il modello CCI è uno strumento prezioso per studiare i meccanismi di disfunzione tissutale dopo lesioni meccaniche alla corteccia. La sintonabilità dei parametri di lesione è una caratteristica interessante di questo modello. Alterare la profondità di impatto, la velocità o il tempo di dimora può aumentare o diminuire la gravità della lesione come desiderato dall'investigatore10,

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del Center for Neuroscience and Regenerative Medicine (CNRM, numero di sovvenzione G170244014). Apprezziamo l'assistenza di Mahima Dewan e Clara Selbrede negli studi pilota di rimozione adesiva. Kryslaine Radomski ha eseguito interventi chirurgici preliminari per il trapianto di cervello e trapianto di cellule. Amanda Fu e Laura Tucker del laboratorio centrale USU CNRM Preclinical Studies hanno fornito preziosi consigli rispettivamente su interventi chirurgici e test di comportamento per animali.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringhe da 1 mlBecton Dickinson (BD) 
1,7 ml provette flip topDenvilleC2170
siringa da 10 microlitriHamilton7635-01
25G Precision Glide aghi per siringaBecton Dickinson (BD) 
70% di etanoloProdotto a scelta; varia a seconda della regione
paracetamolo sospensione oraleTylenol (per bambini)Diluire a 1 mg/ml in acqua
vaporizzatore per anestesiaVetland521-11-22
pannoAcquisto dai grandi magazzini
BetadinePurdue ProdottiNDC-67618-151-32
ossigenoProdotto a scelta; varia in base alla regione
ciclosporina ASigma-Aldrich30024-100mg
Kit di colorazione DABVector LaboratoriesSK-4100
dimetil solfossido (DMSO)Sigma-AldrichD8418-500ml
DMEMInvitrogen (ThermoFisher)A14430-01
anticorpo IgG anti-topo asino, HRP coniugatoJackson ImmunoResearch715-035-151
nastro isolante3M CorporationAcquisto da grandi magazzini
pinzette finiFine Science Tools11254-20
pinzeFine Science Tools91106-12
pipette capillari in vetro, diametro esterno 1 mm, ID0,58 mmWorld Precision Instruments1B100F-3
Kit micromotore rotativo ad alta velocitàForedom Electric Co.K.1070 - K.107018
Ideal Micro Drill Fresa Set Di 5Punte Cellulari Scientific 60-1000
Impact One Stereotaxic Impactor per CCI Leica Biosystems39463920
isofluranoBaxterNDC-10019-360-60
timer da banco da laboratorioFisher Scientific14-649-17
Estrattore per micropipetteMicroData Instruments, Inc.PMP-102Qualsiasi estrattore sarà sufficiente
Vetrini coprimicroscopioFisherbrand12-545-E
Supporto di montaggioProdotto di scelta
specchioAcquisto dal grande magazzino
Topo anticorpo antigene nucleare umanoAnticorpo MilliporeMAB1281
Mouse on Mouse Kit di bloccoVector LaboratoriesBMK-2202
porta-aghi emostaticoFine Science Tools12002-12
unguento oftalmicoFalcon PharmaceuticalsNDC-61314-631-36
forbici a molla oftalmicaFine Science Tools15018-10
scatolaAcquista dal cilindro
di plasticaAcquisto dal grande magazzino
Pompa a siringa motorizzata QSIStoelting53311
Raccordo a compressione con ago rimovibileHamilton55750-01
piccolo telaio stereotassico per roditoriStoelting51925
piccole forbiciFine Science Tools14060-09
StemPro AccutaseInvitrogen (ThermoFisher)
Tamponi sterili per la preparazione dell'alcolFisherbrand06-669-62
tamponi di cotone sterili/Kendall Q-tipsTyco Healthcare540500
Soluzione salina sterileHospiraNDC-0409-1966-07
Cronometri (2)Fisher Scientific06-662-56
Superfrost Plus Gold vetrini per microscopioFisherbrand15-188-48
suture - seta 5.0 con ago curvoOasisMV-682
309659305122 per la manipolazione degli animali compresso per vetrini per microscopio di plastica del grande magazzinoA1110501

Riferimenti

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