Presentiamo tecniche per isolare, coltivare, caratterizzare e differenziare le cellule progenitrici muscolari primarie umane (hMMP) ottenute dal tessuto della biopsia muscolare scheletrica. Gli hMPC ottenuti e caratterizzati attraverso questi metodi possono essere utilizzati per affrontare successivamente le domande di ricerca relative alla miogenesi umana e alla rigenerazione muscolare scheletrica.
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Articolo metodologico
Isolamento, cultura, caratterizzazione e differenziazione delle cellule del progenitore muscolare umano dalla procedura di biopsia muscolare scheletrica
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'uso di tessuti e cellule primarie è ideale per lo studio di processi biologici e fisiologici come il processo rigenerativo muscolare scheletrico. Ci sono sfide riconosciute nel lavorare con le cellule staminali adulte primarie umane, in particolare le cellule progenitrici del muscolo umano (hMC) derivate da biopsie muscolari scheletriche, tra cui un basso rendimento cellulare dal tessuto raccolto e un ampio grado di eterogeneità dei donatori parametri di crescita e di morte tra le culture. Pur incorporando l'eterogeneità nella progettazione sperimentale è necessaria una dimensione del campione più grande per rilevare effetti significativi, ci permette anche di identificare i meccanismi che sono alla base della variabilità nella capacità di espansione di hMPC, e quindi ci permette di comprendere meglio l'eterogeneità nella rigenerazione muscolare scheletrica. Nuovi meccanismi che distinguono la capacità di espansione delle colture hanno il potenziale per portare allo sviluppo di terapie per migliorare la rigenerazione muscolare scheletrica.
Introduzione
Il muscolo scheletrico è il più grande sistema di organi nel corpo umano, che rappresenta il 30-40% di tutta la massa corporea1. Oltre al suo ruolo ben riconosciuto nella locomozione, il muscolo scheletrico mantiene la temperatura corporea e la postura e svolge un ruolo centrale nell'omeostasi nutritiva di tutto il corpo. La ricerca che coinvolge partecipanti umani, animali e modelli di coltura cellulare sono tutti preziosi per affrontare le domande relative alla biologia muscolare scheletrica e alla rigenerazione. L'isolamento e la coltura delle cellule progenitrici muscolari primarie umane (hMCC) fornisce un modello robusto che consente di ap....
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Protocollo
Questo protocollo è stato approvato dall'Institutional Review Board della Cornell University. Tutti i partecipanti sono stati esaminati per le condizioni di salute sottostanti e hanno dato il consenso informato.
1. Ottenere tessuto muscolare umano tramite la biopsia muscolare scheletrica
- Identificare il muscolo laterale vasto tramite palpazione, punti di riferimento anatomici e contrazione attiva del muscolo.
- Palpate il vasto lateralis facendo stringere al partecipante il muscolo quadricipite e trovare la pancia del muscolo, circa 1/3 del modo dalla rotula all'anca, e solo ventrolateral al femore.
- Utilizzare un....
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Risultati
I risultati rappresentativi della citometria di flusso dell'isolamento da hMPC dal tessuto muscolare umano possono essere visualizzati nella Figura 1. Gli hMPC possono essere identificati mediante i primi eventi basati sulla dispersione laterale e sulla dispersione in avanti per eliminare le cellule morte o i detriti, seguiti dalla selezione solo delle cellule che sono negative per 7-AAD e quindi sono vitali. La selezione delle celle positive per entrambi i m.......
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Discussione
Gli HMCC primari sono un importante modello di ricerca utilizzato per comprendere la biologia muscolare scheletrica e il processo rigenerativo. Inoltre, gli HMPC hanno il potenziale per essere utilizzati per la terapia. Tuttavia, ci sono sfide riconosciute nell'utilizzo di hMPC primari e terapeutici, compresa la comprensione limitata delle cellule derivate dagli esseri umani10. C'è anche un grande grado di variazione nella capacità di espansione tra le colture dei donatori, che limita il potenzial.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano la Cornell University, Biotechnology Resource Center Imaging Facility per il loro aiuto con lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza. Ringraziamo anche Molly Gheller per il suo aiuto con il reclutamento dei partecipanti ed Erica Bender per aver condotto le biopsie muscolari scheletriche. Infine, ringraziamo i partecipanti per il loro tempo e la partecipazione allo studio. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute on Aging of the National Institutes of Health con il award number R01AG058630 (a B.D.C. e A.E.T.), da una Glenn Foundation for Medical Research e dalla American Federation for Aging Research Grant for Junior....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,25% di tripsina, 2,21 mM EDTA | Corning | 25-053-Cl | Tripsina utilizzata per rimuovere le hMPC aderenti dai recipienti per colture cellulari Piastra |
| coltura cellulare da 10 cm | VWR | 664160 | Piastre utilizzate per la coltura di hMPC |
| Provetta Falcon da 15 mL | Falcon | da 352196 | da 15 mL utilizzate in tutti i protocolli di isolamento e coltura hMPC |
| piastra per coltura cellulare a 24 pozzetti | Grenier Bio-One | 662 160 | piastre utilizzate per la coltura di hMPCs |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | Colorazione di vitalità per l'identificazione di cellule viventi durante lo smistamento FACS |
| Alexa Fluor 488 anti-umano CD29, clone: TS2/16 | BioLegend | 303016 | Anticorpo coniugato per FACS |
| Piastra nera per colture cellulari a 96 pozzetti | Grenier Bio-One | 655079 | Piastra per colture cellulari a 96 pozzetti ideale per l'imaging fluorescente con il citometro Celigo |
| S Celigo S | Nexcelcom Bioscience | Imaging utilizzato per tracciare le colture hMPC | |
| Filtro cellulare | VWR | 352350 | Filtro cellulare per eliminare grandi pezzi di detriti durante l'elaborazione della biopsia muscolare |
| Collagene di tipo I (Rat Coda) | Corning | 354236 | Collagene per il rivestimento di piastre di coltura cellulare |
| Collagenasi D | Roche | 11 088 882 001 | Utilizzato per la degradazione del collagene e di altro tessuto connettivo nel tessuto bioptico del muscolo scheletrico |
| Dimetilsolfossido | VWR | WN182 | Utilizzato per la crioconservazione di hMPCs |
| Dispase II | Sigma Life Sciences | D4693 | Una proteasi utilizzata per la digestione enzimatica del tessuto |
| bioptico del muscolo scheletricoDulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose in polvere | Gibco | 31600-034 | DMEM a basso contenuto di glucosio per l'elaborazione di biopsie muscolari |
| Gibco | salino tamponato con fosfato di Dulbco | 21600-010 | PBS per l'elaborazione di biopsie muscolari |
| EDTA Sale disodico diidrato | J.T. Baker | 4040-01 | Necessario per il buffer FACS |
| Siero fetale bovino | VWR | 89510-186 | Siero fetale bovino utilizzato per i terreni di crescita hMPC |
| Ham's F12 | Gibco | 21700-026 | Terreni di base per hMPCs |
| Siero equino inattivato a caldo | Gibco | 26-050-070 | Siero di cavallo utilizzato per produrre hMPC Mezzi di differenziazione |
| Emocitometro | iNCyto | DHC-N0105 | Utilizzato per contare le cellule |
| Ibernazione A | Gibco | A1247501 | Terreni per la conservazione della biopsia del muscolo scheletrico per tessuti |
| Hoechst 33342, tricloridrato, triidrato | Life Technologies | H21492 | Colorante per DNA per l'identificazione di tutte le cellule utilizzando l'isopropanolo Celigo S |
| Fisher Scientific | A416P-4 | Utilizzato per il congelamento a velocità controllata di hMPCs | |
| Tampone Moxi | Orflo | MXA006 | Tampone per contatore cellulare automatizzato |
| Cassette Moxi | Orflo | MXC002 | Casse per contatore di cellule automatizzato |
| Moxi z Mini Contatore di cellule automatizzato | Orflo | Contatore di cellule automatizzato | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | Contenitore per il congelamento delle cellule a velocità controllata disponibile in commercio |
| Siero di capra normale (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Siero di capra utilizzato nel tampone |
| FACSPE-Cy7 Topo Anti-umano CD56, clone: B159 | BD Pharmingen | 557747 | anticorpo coniugato per FACS |
| Soluzione di penicillina/streptomicina 100x | Corning | 30-002-CI | Antibiotici aggiunti ai terreni di coltura |
| Ioduro di propidio | Thermo Fisher Scientific | P3566 | Colorazione del DNA per l'identificazione delle cellule morte utilizzando il |
| fattore di crescita dei fibroblasti basici umani ricombinante | Promega | G5071 | Integratore in hMPC per prevenire la differenziazione spontanea |
| Terreno di congelamento per colture cellulari di recupero | Gibco | 12648-010 | Terreni utilizzati per crioperseve per biopsia muscolare Fanghi |
| Bicarbonato di sodio | Fisher Scientific | S233-3 | |
| provette da 5 mL sterili a fondo tondo | VWR | 60818-565 | Tubi utilizzati per FACS |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | Perline di compensazione per calibrare le impostazioni FACS del flusso |
Riferimenti
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- D'Souza, D. M., et al.
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Ristampe e permessi
