Articolo metodologico

Fabbricazione di microsfere algerine amiloidi -z-Secreting per l'uso nella modellazione del morbo di Alzheimer

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DOI:

10.3791/59597

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6 luglio 2019

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1Division of Pharmacy and Optometry, School of Health Studies, Faculty of Biology, Medicine and Health, University of Manchester, 2Division of Neuroscience and Experimental Psychology, School of Biological Sciences, Faculty of Biology, Medicine and Health, University of Manchester

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo illustra un metodo di incapsulamento delle celle mediante una rapida gelazione fisica di alginato per immobilizzare le cellule. Le microsfere ottenute consentono nel tempo una secrezione controllata e sostenuta dell'amiloide-z e possono essere utilizzate per studiare gli effetti dei modelli amiloidi-amiloidi secreti in vitro e in vivo.

Abstract

Secondo l'ipotesi della cascata di amiloidi, il primo innesco nello sviluppo del morbo di Alzheimer (AD) è l'accumulo di frammenti tossici di amiloide-z (A) , che alla fine porta alle caratteristiche classiche della malattia: placche amiloidi, grovigli neurofibrillari e perdita sinaptica e neuronale. La mancanza di modelli preclinici transgenici pertinenti che riflettano la progressione della malattia è uno dei principali fattori che ostacolano la scoperta di trattamenti farmacologici efficaci. A tal fine, abbiamo sviluppato un protocollo per la fabbricazione di microsfere alginate contenenti cellule di secernerazione di amiloidi utili per lo studio degli effetti della produzione cronica di A.

In questo studio sono state utilizzate cellule ovariche del criceto cinese precedentemente trasinate con un gene APP umano, che secernono l'AO (cioè 7 cellulePA2). Un modello tridimensionale (3D) in vitro per il rilascio prolungato di AA è stato fabbricato mediante incapsulamento di cellule 7PA2 in alginato. Il processo è stato ottimizzato per raggiungere un diametro del tallone di 500-600 m per ulteriori studi in vivo. L'ottimizzazione dell'incapsulamento delle celle 7PA2 in alginato è stata eseguita alterando i parametri di fabbricazione, ad esempio la concentrazione di alginato, la portata del gel, il potenziale elettrostatico, la frequenza di vibrazione della testa, la soluzione di gelling. I livelli di Az secreto sono stati analizzati nel corso del tempo e confrontati tra perline altanate e metodi di coltura cellulare standard (fino a 96 h).

Una concentrazione di 1,5 x 106 7PA2 cellule/mL e una concentrazione algerato del 2% (w/v) tamponata con HEPES e successiva gelazione in 0,5 M di cloruro di calcio per 5 minuti sono stati trovati per fabbricare le microsfere più stabili. Le microsfere fabbricate erano 1) di dimensioni uniformi, 2) con un diametro medio di 550 m, 3) contenenti circa 100-150 cellule per microsfera e 4) in grado di secernere A .

In conclusione, il nostro metodo ottimizzato per la produzione di microsfere alginate stabili contenenti 7cellule amiloidi che producono amiloidi potrebbe consentire la modellazione di aspetti importanti di AD sia in vitro che in vivo.

Introduzione

Modellare la malattia neurodegenerativa è impegnativo a causa della natura complessa e intricata del cervello. Nella malattia di Alzheimer (AD), la progressiva perdita di funzione sinaptica e la morte dei neuroni è ritenuta un effetto a valle della sovrapproduzione sostenuta e dell'accumulo di peptidi beta amiloidi (A) a seguito dell'elaborazione anomala del precursore dell'amiloide proteina (APP) secondo l'ipotesi della cascata amiloide1.

Per comprendere i meccanismi di questa patologia indotta dall'amiloide e per aiutare nell'identificazione di nuovi obiettivi di trattamento, gli scienziati hanno sviluppato vari modelli preclinici in vivo. Una categoria di modelli utilizza un'iniezione bolus di un peptide sintetico di A, nel cervello del ratto2,3,4. La limitazione principale di tali modelli è che si basano su un trattamento monopunto o ripetuto con peptidi di Az in alte concentrazioni depositate tutte in una volta. Ciò è incompatibile con la natura cronica e sostenuta del rilascio di A - nella malattia5. Un'altra categoria di modelli in vivo è costituita da modelli animali transgenici che esprimono una o più mutazioni genetiche legate alle variazioni familiari della malattia6,7,8,9, 10. Tuttavia, poiché l'AD familiare rappresenta solo meno del 5% di tutti i casi di Alzheimer11, la rilevanza di questi modelli nel tradurre in SPoradica AD nell'uomo è discutibile12. Un altro inconveniente dell'approccio transgenico è la formazione accelerata dell'AA dalla nascita, che si traduce in deficit nella funzione cognitiva e cambiamenti patologici troppo rapidamente e aggressivamente per assomigliare alla progressione della malattia in SPoradica AD nei pazienti12 . Ad esempio, il modello 5x FAD produce placche in soli 1,5 mesi13.

È interessante notare che entrambe queste categorie si traducono in cambiamenti nella funzione cognitiva di rilevanza per la ricerca AD2,3,4,5,6, e talvolta sono accompagnati dal comparsa di segni di caratteristiche patologiche della malattia come placche amiloidi6,8, tau fosforolonazione6,7 e/o perdita sinaptica e neuronale7,9, 14. Ma mentre questi tipi di modelli possono darci una visione degli effetti degli alti livelli di amiloide nel cervello, che sono spesso associati con le fasi successive dell'AD, non riescono a riflettere i cambiamenti precedenti mostrati in risposta all'esposizione cronica e sostenuta all'A peptide12, come l'espressione alterata di marcatori sinaptici15 e componenti nella matrice extracellulare16. Pertanto, rimane ancora la necessità di creare un modello cronico che illustri più accuratamente gli effetti della secrezione A sostenuta sulla cognizione in vivo e illustri i cambiamenti nella patologia.

A tal fine, abbiamo sviluppato un sistema che permette la costante e sostenuta secrezione dell'AA in modo controllato immobilizzando le cellule di secernono amiloide all'interno delle microsfere di idrogel, che possono essere successivamente impiantate all'interno del cervello del ratto adulto per modellare gli aspetti di SPoradico AD.

L'alginato è stato il biomateriale selezionato in quanto è biocompatibile e non induce risposte avverse se impiantato in vivo17. L'incapsulamento cellulare negli idrogel algini è stato ben consolidato negli ultimi quattro decenni. Il primo esempio della sua traduzione alla clinica è stato riportato per il trattamento del diabete mellito di tipo 117. La prima relazione sull'incapsulamento riuscito delle isole di Langerhans risale al 1980. Il trapianto di microsfere contenenti cellule che secernono insulina ha rivoluzionato le opzioni di trattamento per i pazienti diabetici quando ha ripristinato la funzione pancreatica, eliminando la necessità di terapia per l'iniezione di insulina18. Questi lavori riferiscono su come l'incapsulamento delle cellule può proteggerli da sollecitazioni esterne, sia meccaniche che chimiche. Infatti, le perline altanate agiscono come una barriera e isolano le cellule dall'ambiente circostante preservandone il fenotipo, consentendo un accesso sufficiente ai media circostanti per le sostanze nutritive e lo sgombero dei sottoprodotti cellulari19. Inoltre, l'uso di alginato permette la corrispondenza delle proprietà meccaniche del tessuto molle20. Gli idrogel algerati possono essere sintonizzati per avere una rigidità di 1-30 kPa, semplicemente variando la concentrazione di alginati e la densità di collegamento incrociato20,21. Questo è un aspetto essenziale, non solo per mantenere l'espressione fenomenoica delle cellule incapsulate in vitro, ma anche per evitare effetti infiammatori dopo l'innesto in vivo22.

In questo protocollo vengono utilizzate 7 cellule PA2 - una linea cellulare dell'ovaio del criceto cinese che viene sfilviatamente trascurata da un gene 23 muto APP umano -. Queste cellule producono continuamente prodotti catalitici di APP, tra cui 1-4224A,25, e sono state utilizzate per generare l'AA come alternativa alla produzione sintetica in studi preclinici acuti in vivo26. Descriviamo un metodo di fabbricazione per immobilizzare 7cellule PA2 all'interno di microsfere altanate "morbide", progettate per consentire la secrezione sostenuta delle biomolecole. Come prova di concetto, riportiamo il rilascio del peptide A1-42 nel tempo. L'altnata che viene utilizzata è un alginato a bassa viscosità con un peso molecolare di 120.000-190.000 g/mol e un rapporto mannuronico a creurionico di 1,56 (M/G).

In altri studi, queste microsfere possono essere trapiantate in modo sicuro all'interno di regioni del cervello del ratto di rilevanza per l'AD (ad esempio, l'ippocampo) per studiare gli effetti della secrezione aalà cronica sul comportamento in vivo e patologia ex vivo. Inoltre, questo sistema può essere utilizzato per studiare gli effetti del rilascio cronico di A e a in applicazioni in vitro ed ex vivo. Per esempio, 7PA2-contenenti microsfere alginate possono essere co-coltivate in vitro con colture neuronali o astrocitiche per valutare gli effetti dell'esposizione cronica di Az sui meccanismi cellulari associati con l'AD. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per esaminare la relazione tra la produzione cronica di A e il potenziamento a lungo termine nell'elettrofisiologia ex vivo.

Il punto forte di questo protocollo è la modularità e la flessibilità del metodo di fabbricazione, che consente la fabbricazione di perline alginate con una dimensione target ottimizzando i parametri di fabbricazione. A seconda dell'applicazione, il protocollo può essere regolato per ottenere obiettivi su misura per quanto riguarda le dimensioni delle microsfere, la densità delle cellule incapsulate e la rigidità della microsfera. Questo protocollo può essere utilizzato per l'incapsulamento di una varietà di tipi di cellule, sviluppando modelli tridimensionali (3D) più rilevanti in vitro per studiare diverse patologie. Recentemente abbiamo riferito su come le cellule algerate-incapsulate possono essere utilizzate per modellare le prime fasi della progressione del cancro20.

Il concetto del processo di incapsulamento si basa sull'estrusione di un getto laminare di cellule sospese in soluzione altanata attraverso un ugello. Una testa vibrante interrompe il getto con una frequenza controllata con conseguenti goccioline a base di alginate di dimensioni uguali. Un campo elettrico esterno permette la separazione delle goccioline a base di alginate formate, che a contatto con una soluzione arricchita in ioni divalenti, come gli ioni di calcio, possono rapidamente incrociarsi, preservando la loro forma sferica. L'incubazione nella soluzione di gelazione consente la formazione di microsfere sferiche contenenti cellule all'interno di un idrogel fisico omogeneo27. La dimensione target delle microsfere e degli idrogel algerati consente lo scambio di nutrienti e ossigeno con i mezzi di coltura cellulare per lunghi periodi di tempo (settimane). Figura 1 Una mostra una rappresentazione schematica dell'apparato di incapsulamento utilizzato (Figura 1B).

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Figura 1 : Il sistema di incapsulamento. (A) Rappresentazione schematica del sistema di incapsulamento. Una sospensione a celle algerite viene caricata in una siringa (2) e alimentata attraverso un serbatoio ad una velocità di estrusione impostata alla pompa della siringa (1). Nel serbatoio, un cappello da vibrazione (3) vibra ad una frequenza impostata da un generatore di forma d'onda (4) per interrompere il flusso a intervalli uguali, formando goccioline di dimensioni uguali. Man mano che la soluzione viene alimentata attraverso un ugello (5) e si formano goccioline, viene applicato un potenziale elettrostatico attraverso un elettrodo (7) impostato da un generatore di tensione (6), che carica leggermente la superficie delle goccioline, consentendo al flusso di diffondersi a seguito di repellemento forze elettrostatiche. Mentre le goccioline si impegnano con il bagno di gelazione (8), il collegamento incrociato di alginati di Ca2 o piùdi Ca 2 o più si traduce nella formazione di microsfere sferiche. ((B) Fotografia dell'incapsulatore prima della fabbricazione di microsfere alginate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le dimensioni del microfara possono essere modificate a seconda dell'uso previsto. Al fine di controllare le dimensioni del microsfero, i vari parametri descritti nella Figura 1A e nel protocollo vengono regolati di conseguenza. Il diametro interno dell'ugello utilizzato ha un impatto sostanziale sulle dimensioni delle goccioline; l'ulteriore regolazione dei parametri di incapsulamento, vale a dire la velocità di estrusione, la frequenza di vibrazione e la tensione, è fondamentale per ottenere una distribuzione delle dimensioni coerenti. Tabella 1 illustra in che modo i diversi parametri possono alterare le dimensioni delle microsfere ottenute con questo sistema.

parametroDimensione dell'ugelloFrequenza di vibrazionePortataTensione elettrodo
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Dimensioni del tallone figure-introduction-6figure-introduction-7 figure-introduction-8figure-introduction-9–

Tabella 1: Parametri di fabbricazione e la loro influenza sulle dimensioni della microsfera. La tabella illustra come ogni parametro può influenzare le dimensioni risultanti delle microsfere fabbricate, indipendentemente dall'ugello e dalla viscosità della soluzione utilizzata.

Protocollo

1. Preparativi

  1. Preparare una soluzione azionaria algerata di 100 mL del 4% (w/v).
    1. Pesare 4,4 g di sale di sodio algerato e aggiungere la polvere secca a 100 mL di salina tamponata HEPES (HBS, 20 mM HEPES (0,477 g) con 150 mM NaCl (0,877 g) in idratazione dell'acqua deionizzata.
    2. Utilizzare un agitatore magnetico a 500 giri al minuto (rpm) e riscaldare fino a 50 gradi centigradi per consentire una completa idratazione algerata.
      NOTA: l'alginato potrebbe richiedere una o due ore per essere completamente idratato. Per risparmiare tempo, la soluzione alginata può essere costituita con un giorno di anticipo rispetto al protocollo di incapsulamento e conservata a 4 gradi centigradi fino al giorno successivo. Quando l'alginato è stato refrigerato, scaldare delicatamente a 37 gradi centigradi utilizzando un bagno d'acqua o una piastra calda e agitare con un agitatore magnetico immediatamente prima dell'uso.
    3. Filtrare sterile la soluzione algerata utilizzando un filtro in poliethersulfone di pori (PES) da 0,22 m prima dell'uso. Il filtraggio è raccomandato a 37 gradi centigradi per consentire un facile flusso di alginato. La viscosità aumenterà se la temperatura è lasciata scendere.
  2. Preparare 1.000 mL di 0,5 M CaCl2.
    1. Pesare 55,49 g di anhydrous CaCl2 e sciogliere in 1.000 mL di HBS (20 mM HEPES e 150 mM NaCl in 1.000 mL di acqua deionizzata).
    2. Filtro sterile utilizzando un filtro PES di 0,22 m.
  3. Preparare 100 mL di miscela di dissoluzione.
    1. Preparare una soluzione da 100 mM HEPES (23,83 g) e una soluzione salina di citrato di trisofi di trisofi (147,05 g) da 107,05 g in salina con buffer fosfati.
    2. Regolare su pH 7.4 utilizzando NaOH o HCl.

2. Impostazione del sistema di incapsulamento

  1. Pulire il cappuccio del flusso laminare.
    1. Sterilizzare la cappa di flusso laminare contenente l'incapsulatore utilizzando l'esposizione ai raggi UV seguita da spruzzatura con soluzione di etanolo v/v del 70%.
    2. Sciacquare il sistema di incapsulatore con 10 mL di soluzione di etanolo 70% v/v seguita da 10 mL di acqua sterile deionizzata.
    3. Fissare l'ugello di 300 m e ripetere il passaggio 2.1.2.
    4. Spruzzare la bottiglia contenente la soluzione algerata algerata filtrata, la bottiglia contenente la soluzione filtrata di cloruro di calcio e tutti gli strumenti, le attrezzature e le piastre di coltura vuote che verranno utilizzati con soluzione di etanolo v/v del 70% e metterli nel cofano del flusso laminare. Prima dell'uso, accendere nuovamente una luce UV per 30 minuti per sterilizzare completamente.
    5. Preparare un becher di rifiuti riempito con una soluzione disinfettante di grado biologico e posizionare il becher nel cofano.
    6. Riempire un becher con 100 mL di soluzione sterile CaCl2 (aqueous) e aggiungere un agitatore magnetico. Impostare la velocità di agitazione a 100 rpm. Posizionare il becher su una piattaforma magnetica ad un'altezza di 18 cm dalla punta dell'ugello. Questo becher sarà utilizzato per raccogliere perline alginate e consentire la loro gelazione.
  2. Preparare le celle per l'incapsulamento.
    1. Rimuovere le cellule dall'incubatrice e staccarsi dal flacone quasi confluente utilizzando la soluzione trypsin-EDTA dello 0,25% e incubare a 37 gradi centigradi per 5-10 min.
    2. Isolare un campione per la stima della densità cellulare e quindi centrificare le cellule rimanenti a 1.000 rpm per 5 min per ottenere un pellet cellulare.
    3. Risospendere il pellet in HBS (20 mM HEPES e 150 mM NaCl) per raddoppiare la concentrazione cellulare finale desiderata (ad esempio, per una concentrazione finale di 1,5 x 106 cellule/mL, risospendere le cellule in HBS per ottenere una concentrazione di 3 x 106 cellule /mL).
    4. In un tubo di centrifugazione da 50 mL, mescolare la sospensione cellulare in un rapporto 1:1 con una soluzione algerata del 4% (w/v) per ottenere una sospensione finale contenente la concentrazione cellulare desiderata (ad esempio, 1,5 x 106 cellule/mL) in una soluzione alnatidel del 2% (w/v).
  3. Impostare i parametri di incapsulamento.
    1. Impostare la velocità della macchina di incapsulatore alla velocità massima di estrusione (8,9 mL/min), la tensione a 1,0 kV e la frequenza a 5.500 Hz.
      NOTA: Questi parametri sono stati precedentemente ottimizzati per ottenere microsfere di 550 m di diametro.

3. Fabbricazione

  1. Fabbricare le microsfere.
    1. In una siringa da 20 mL, caricare 5 mL della sospensione cell-alginate e attaccare una siringa all'incapsulatore.
    2. Avviare l'incapsulatore attivando il flusso che spingerà la sospensione cellulare-alginata attraverso l'alimentatore. Un flusso di goccioline verrà estruso attraverso l'ugello.
    3. Raccogliere il primo 1 mL nel becher di rifiuti per annullare il flusso iniziale non uniforme.
    4. Continuare a eseguire i restanti 4 mL permettendo alle goccioline di cadere nel bagno di gelazione CaCl 2. Ogni millilitore può essere eseguito separatamente (ma successivamente) e raccolto in quattro diversi bagni di gelazione, se necessario.
      NOTA: Al contatto con il bagno di gelazione, l'alginato nelle goccioline si ricollegherà istantaneamente con gli ioni di calcio nel bagno di gelazione e formerà microsferie sferiche.
    5. Dopo un minuto, rimuovere il becher di gelazione dalla piattaforma magnetica e lasciare che le microsfere si siedano per altri 4 minuti senza agitazione (tempo necessario per consentire la gelazione completa attraverso le microsfere a temperatura ambiente).
  2. Recuperare le microsfere.
    1. Rimuovere eventuali detriti o artefatti di algerino di grandi dimensioni utilizzando un paio di pinzette sterili, quindi utilizzare una pipetta di plastica sterile per trasferire a un filtro a rete di 74 m per recuperare le microsfere dal bagno di gelazione.
    2. Trasferire le microsfere in un tubo di centrifuga utilizzando il mezzo di coltura appropriato e lasciare che sia possibile eguagliare 5 min nel mezzo di coltura cellulare.
    3. Trasferire su un pallone, piatto o piatto Petri per incubazione e ulteriori esperimenti.
      NOTA: Il bagno di gelazione non deve essere riutilizzato.

4. Test e utilizzo di microsfere

  1. Qualità della microsfera di prova.
    1. Per valutare la vitalità cellulare (o altre letture biologiche) dopo l'incapsulamento e la coltura, interrompere delicatamente le microsfere per rilasciare le cellule incapsulate utilizzando il mix di dissoluzione.
      NOTA: Il volume richiesto di miscela di dissoluzione dipende dal numero di microsfere utilizzate per ogni test. Una razione suggerita è di 4 mL di mix di dissoluzione a ogni 1 mL di cellule incapsulate. Questo passaggio deve essere eseguito solo su un singolo campione per ogni popolazione di microsfere.
    2. Incubare le cellule in un'incubatrice a coltura cellulare integrata con 5% di CO2 a 37 gradi centigradi per 10 min.
    3. Stimare la vitalità delle cellule per le cellule ora in soluzione come al solito macchiando le cellule con trypan blu e utilizzando una camera emocitometro.
      NOTA: Se si utilizzano contatori cellulari automatizzati per le stime della vitalità cellulare, è necessario prestare attenzione per evitare artefatti alginati che interferiscono con i conteggi. In questi casi, si consiglia il conteggio delle cellule nauali.
    4. Per valutare la stabilità delle microsfere, misurare il diametro medio di un campione di ogni popolazione di microsfere in un corso di tempo utilizzando un microscopio e un software di imaging. Variazioni successive drammatiche del diametro possono essere indicative della degradazione alginata.
  2. Utilizzare microsfere per il rilevamento di A .
    1. Esempio di coltura cellulare da 7CELLULE 7PA2 coltivate in condizioni standard (2D) a intervalli di 24 h e conservate a -20 gradi centigradi per ulteriori analisi.
    2. Esempi di colture cellulari provenienti da cellule incapsulate 7PA2 coltivate in condizioni standard (3D) a intervalli di 24 h e conservano a -20 gradi centigradi per ulteriori analisi.
    3. Rilevare la secrezione di cellule di AAe dalle cellule 7PA2 in supporticondizionati raccolti mediante un saggio immunosorbent legato agli enzimi (ELISA) (Figura 4).
  3. Utilizzare le microsfere per ulteriori studi in applicazioni pertinenti.
    NOTA: Le cellule 7PA2 incapsulate possono essere utilizzate per valutare gli effetti della secrezione di A sè sostenuta in qualsiasi modello.
    1. Per l'innesto di microperade all'interno dell'ippocampo del ratto nei cervelli, generare sezioni coronali spesse 1 mm del cervello del ratto e utilizzare strumenti chirurgici per inserire microsfere nell'area desiderata (Figura 5).
    2. Incapsulare diversi tipi di cellule in microsfere alginate seguendo i protocolli descritti per valutare il rilascio prolungato delle biomolecole di interesse. I relativi sistemi in vitro e in vivo possono essere ulteriormente modellati.
    3. Rilevare l'espressione di marcatori legati alla membrana di cellule incapsulate utilizzando la citometria di flusso e/o l'immunofluorescenza.
      NOTA: Un esempio dell'uso di un metodo simile per la fabbricazione di microsfere che modellano le prime fasi della crescita della massa tumorale e l'espressione del biomarcatore è descritto da Rios 20.

Risultati

7CELLULE PA2 sono incapsulate con successo in microsfere altnate
Dopo la preparazione, le microsfere altanate uniformi e sferiche vengono generate con successo utilizzando questo protocollo. Le immagini in Figura 2A riportate di seguito mostrano un esempio di come l'alterazione di uno dei parametri (ad esempio, tensione) modifica il flusso e la dispersione del flusso di goccioline alginate. Figura 2 B mostra un esempio di perline algerate ottenute immediatamente dopo il processo di gelazione.

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Figura 2 : ottimizzazione del metodo di fabbricazione. (A) Fotografie che mostrano i cambiamenti nella dispersione del flusso. (B) Immagine del campo luminoso che mostra microsferiche sferiche alginate subito dopo la fabbricazione. (C) Esempio di fase di ottimizzazione: ottimizzazione dei parametri di fabbricazione selezionati per ottenere la dimensione della microsfera di destinazione. Grafici selezionati per illustrare la relazione tra ogni parametro e la dimensione delle microsfere risultanti (distribuzione delle dimensioni da almeno n e 100 microsfere). Si noti che il diametro interno dell'ugello, viscosità della soluzione espulsa e condizioni di gelling possono influenzare anche le dimensioni delle perline fabbricate. Le barre di errore rappresentano S.D. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il protocollo descritto è flessibile e consente la fabbricazione di diverse dimensioni di microsfere a base di alginate, variando nella composizione a seconda dell'applicazione. Nella Figura 2C, riportiamo l'influenza della portata algerata, della tensione e della frequenza sulle dimensioni della microsfera utilizzando una soluzione algerina del 2% (w/v) in HEPES (pH 7.2) estrusa attraverso un ugello di 300 m.

Poiché lo scopo di questo studio era quello di produrre microsfere che possono essere incorporate all'interno del cervello del ratto, abbiamo regolato i parametri di fabbricazione per ottenere un diametro medio delle microsfere nell'intervallo di 500-600 m. Ai fini del controllo qualità, il metodo è stato ottimizzato per avere una variabilità minima tra la popolazione di perline fabbricate (cioè una distribuzione di dimensioni ridotte). Si prega di notare che (1) perline prodotte possono essere iniettate nel cervello del ratto utilizzando una siringa Hamilton dotata di un ago 20G; e (2) un emisfero del cervello del ratto può ospitare fino a due o tre perline di queste dimensioni.

Dopo l'ottimizzazione, incapsulare 7cellule PA2 a una concentrazione di 1,5 x 106 cellule/mL sospese in una soluzione algerata del 2% (w/v) tamponata con HEPES e caduta in un bagno di gelazione di cloruro di calcio da 0,5 M ha prodotto le microsfere desiderate. Figura 3 Un sotto mostra incapsulate 7CELLULE 7PA2 distribuite uniformemente nelle microsfere dopo un giorno in condizioni di coltura cellulare standard. La proliferazione delle cellule 7PA2 è stata testata utilizzando un test MTS secondo il protocollo del produttore. Non c'era alcuna differenza significativa tra il comportamento delle cellule 7PA2 cresciute con o senza alginazione per un periodo di sette giorni (Figura 3B). Durante l'incubazione di cellule incapsulate in condizioni di coltura standard, ci si aspetta che le cellule continuino a proliferare per tutta la durata dell'esperimento e ci si può aspettare piccoli gradi di fuga cellulare come risultato, come riportato in altre opere28. Gli effetti di questo possono essere attenuati incapsulando ad una densità di cellule più piccola o riducendo la concentrazione di siero in cui le microsfere vengono incubate.

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Figura 3 : celle 7PA2 incapsulate. (A) Immagine a campo luminoso di cellule 7PA2 incapsulate che mostrano la distribuzione uniforme delle cellule in tutta la microfara alunata. I parametri di fabbricazione sono stati impostati per ottenere 150 celle 7PA2 per tallone. Nessuna variazione significativa nelle perle alginate è stata osservata in 7 giorni di cultura. (B) Non è stata osservata alcuna differenza tra la proliferazione complessiva di 7 cellule PA2 incubate con cellule alginate e cellule incubate senza alginate. 7CELLULEPA2 crescono e migrano attraverso il volume delle perline alginate; riduzione della concentrazione di siero può essere considerata per rallentare la crescita cellulare. Le barre di errore rappresentano S.D. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le microsfere algerine che incapsulano le cellule 7PA2 sono stabili nel tempo
Per studiare le dimensioni e la forma delle microsfere algerine ottenute, l'analisi del microscopio è stata eseguita dopo la fabbricazione e la gelazione. Il diametro medio per le microsfere ottenute utilizzando il protocollo selezionato è di 550 x 2 m.

Teoricamente, il numero di cellule previsto in una microfara di 550 m-diametro può essere calcolato come segue:

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dove V è il volume e r è il raggio. Il volume di una singola microsfera è V x 8,8 x 10-5 mL; pertanto, il numero di cellule per microsfera al momento dell'incapsulamento (1,5 x 106) x (8,8 x 10-5)- 130 celle.

Sperimentalmente, abbiamo contato il numero di cellule incapsulate subito dopo la fabbricazione. Le perle algerate sono state delicatamente interrotte utilizzando il mix di dissoluzione e le cellule sono state macchiate con soluzione blu trypan. La stima della vitalità e il conteggio delle cellule sono stati eseguiti utilizzando un emocitometro; i risultati ottenuti hanno mostrato una media di 116 x 17 cellule vive per microsfara (n - 5, dati non segnalati). Come previsto, è stata osservata una differenza minore tra il conteggio teorico e quello sperimentale immediatamente dopo l'incapsulamento. Per alcune applicazioni, e in particolare per determinare la quantità di A s rilasciato nel tempo, è importante prevedere il numero di cellule incapsulate in ogni perline altato.

È interessante notare che, il processo di incapsulamento non ha un impatto significativo sulla vitalità delle cellule. I risultati sono riportati in un lavoro precedente, in cui le cellule tumorali del colon-retto (cioè HCT-116) sono state incapsulate utilizzando un metodo simile, senza differenze nella vitalità cellulare nelle microsfere algerine rispetto ai controlli 2D20.

Per misurare la stabilità dell'algerino utilizzato nel processo di incapsulamento, abbiamo misurato i diametri delle microsfere in un periodo di 14 giorni (n - 100). Non sono state osservate variazioni del diametro medio 14 giorni dopo l'incapsulamento rispetto a subito dopo l'incapsulamento (dati non segnalati).

Le cellule incapsulate 7PA2 rilasciano az nel tempo
I supporti condizionati analizzati da colture 2D e 3D di cellule 7PA2 rivelano un costante aumento dei livelli diA-1-42. I mezzi di coltura cellulare sono stati campionati ogni 24 ore e fino a quattro giorni, e analizzati utilizzando ELISA. I nostri dati mostrano che la velocità di rilascio di A-1-42 da microsfere (3D) è simile di profilo a quella rilasciata dalla cultura 2D (Figura 4).

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Figura 4 : Tasso di secrezioneA 1-42 da 7cellule PA2. (A) Il rilascio di A (% normalizzato dopo 4 giorni) da modelli 2D e 3D in vitro ha un profilo simile. Entrambi i modelli mostrano un costante aumento dei livelli di A- nel periodo di quattro giorni e, come previsto, non viene raggiunta una concentrazione costante. (B) Concentrazione di A-1-42 normalizzata al numero di cellulare iniziale, mostrando una simile secrezione di A -1-42 nel tempo, indipendentemente dai metodi di coltura. Né la presenza di alginato né il processo di incapsulamento (modello 3D in vitro) alterano la secrezione di A -1-42. Le barre di errore rappresentano S.D. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Potenziale applicazione di cellule 7PA2 incapsulate
Riportiamo che le 7 cellule PA2 incapsulate in microsfere altnate possono essere efficacemente utilizzate per il rilascio prolungato di A -1-42, e quindi utilizzate per testare l'effetto della secrezione cronica A in qualsiasi modello preclinico. Nella Figura 5 qui sotto, mostriamo i vantaggi dell'utilizzo di microsfere alginate che possono essere facilmente iniettate e situate all'interno del cervello di un ratto. Le sezioni ex vivo sono qui utilizzate per scopi illustrativi, confrontando una perlina alginata millimetrica con microsfere altanate fabbricate.

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Figura 5 : Utilizzo di microsfere per applicazioni precliniche pertinenti. Microperse per l'innesto nel cervello del ratto devono essere abbastanza piccole da essere incorporate senza creare una lesione troppo grande per evitare danni al parenchyma cerebrale e influenzare negativamente la normale funzione cerebrale. Immagine (A) mostra un confronto di dimensioni tra un tallone in scala millimetrico e un tallone in scala micrometrica affiancata. (B) L'impianto di una perlina scalata al millimetro all'interno del cervello per scopi in vivo non funzionerebbe. Immagine (C) mostra una microcono fabbricata con questo protocollo. La dimensione è adatta per l'inserimento all'interno dell'ippocampo del ratto senza avere un effetto dannoso sulla fisiologia normale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le immagini di cui sopra evidenziano l'importanza di controllare le dimensioni della microsfera per tali studi. Qui, dimostriamo il vantaggio di utilizzare microsfere di diametro inferiore a 600 m. Ciò consente l'uso di iniezione minimamente invasiva (ad esempio, siringa Hamilton) per controllare meglio la posizione delle perline iniettate all'interno del cervello.

In sintesi, l'incapsulamento delle cellule 7PA2 dà il controllo sulle dimensioni delle microsfere, sul numero di cellule incapsulate e sulla previsione di A , secreta dalle microsfere (ad esempio, concentrazione, profilo di rilascio). Il controllo delle dimensioni delle microsfere è essenziale per due motivi: 1) per consentire un controllo messo a punto sulla concentrazione di Ao rilasciato, e 2) per consentire l'impianto in una regione controllata del cervello del ratto. I risultati ottenuti qui descrivono la facile messa a punto delle microsfere alginate ed evidenziano potenziali applicazioni per ulteriori studi.

Discussione

Il metodo descritto in questo articolo è utile per incapsulare le celle ottenendo una distribuzione di dimensioni ridotte di microsfere alginate27. Offre anche il vantaggio di coltivare cellule in un ambiente immuno-isolato17,19, proteggendole dallo stress esterno. Inoltre, l'incapsulamento delle cellule in alginato imita più da vicino le condizioni fisiologiche, in particolare per quanto riguarda le interazioni tra cellule e la rigidità della matrice20. Questi fattori sono tutti particolarmente cruciali per il successivo utilizzo in applicazioni pertinenti, come l'innesto in vivo, precludendo potenziali reazioni immunitarie nel tessuto circostante17. Inoltre, un grande vantaggio di questo protocollo è la facile ottimizzazione in base all'applicazione di interesse: è possibile modificare il protocollo e ottimizzare i parametri per la fabbricazione di più grandi o più piccoli, e perline più morbide o rigide. Il metodo descritto è usato per fabbricare perline abbastanza piccole da essere iniettate con metodi minimamente invasivi, e sufficientemente grandi da ospitare un certo numero di cellule e fornire un rilascio sufficiente di A , per provocare effetti comportamentali e patologici osservabili dopo l'iniezione in modelli animali.

Il successo di questo protocollo dipende da una serie di fasi critiche. Un'attenta gestione cellulare e tecniche ottimali di coltura cellulare sono importanti per mantenere la vitalità cellulare e la funzione20,28. L'uso di condizioni di coltura standard garantisce la conservazione della normale funzione delle cellule 7PA2, come osservato. In questo modo è possibile ottenere un profilo di rilascio simile per le cellule incapsulate a1-42 a -42. Inoltre, affinché il protocollo funzioni in modo ottimale, una soluzione alginata a bassa viscosità garantisce risultati migliori rispetto a una soluzione alginata ad alta viscosità. Questo assicura che un getto laminare omogeneo venga estruso attraverso l'ugello e una distribuzione uniforme delle cellule all'interno della matrice delle perline fabbricate27. I materiali utilizzati per incapsulare le cellule devono avere un meccanismo di gelazione molto rapido, che consente la ritenzione della forma.

Un altro passo critico in questo protocollo è la gestione di microsfere fabbricate dopo la gelazione. Qui, mostriamo il recupero di microsfere utilizzando una grande pipetta di plastica di apertura per trasferire le perline. In alternativa, per il recupero del tallone è possibile utilizzare la soluzione di cloruro di calcio contenente le microsfere in un filtro a rete. Una pipetta sierologica grande (5, 10 o 25 mL) può essere utilizzata per disegnare le microsfere e poi lavato attraverso il filtro mesh invece di versare. Il vantaggio di questo è una maggiore fiducia nella sterilità della procedura rispetto al versamento. Tuttavia, delle limitazioni è che alcune perline possono essere distorte se sono compresse dalla pipetta, oltre a rischiare una resa inferiore se una grande percentuale di microsfere non viene salvata.

Questo approccio è stato utilizzato per incapsulare diverse linee cellulari per modellare e studiare diverse malattie (ad esempio, il rilascio di insulina da isolotto pancreatico incapsulato). La novità del nostro approccio è l'innesto delle microsfere generate utilizzando questo protocollo come metodo utile per modellare aspetti importanti del morbo di Alzheimer in vivo. Quando si confronta il profilo di rilascio di A , da cellule incapsulate (Figura 4) con i livelli di A , generato da un'iniezione di bolus (come quello riportato in altri studi3,26), un rilascio più cronico e prolungato di A Previsto. La figura 6 illustra la tendenza prevista che può essere raggiunta. L'utilizzo di questo sistema per la modellazione in vivo è più rilevante per il modo in cui la malattia progredisce e può essere più utile nella scoperta e nello sviluppo di farmaci.

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Figura 6 : Profilo di rilascio previsto di1-42 A- 42 da cellule 7PA2 incapsulate rispetto a un'iniezione di bolus. Il profilo del rilascio di Az a 7PA2 consente di testare gli effetti dell'AA cronica e sostenuta in un modello animale di rilevanza per l'AD. Al contrario, un'iniezione di bolus creerebbe un picco nei livelli di A - in un breve periodo di tempo, seguito da una rapida distanza di Aa dal cervello. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Kajen Suresparan, il Dr. Jonathan Wubetu, Dominik Grudzinski, La signorina Chen 'hao e il Dr Thierry Pilot per il loro aiuto nell'ottimizzazione della fabbricazione di microbeade algerita, della coltura cellulare e del rilevamento di Discussioni.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
µ Software di gestioneVale Lab, UCSF, USAv.1.46
0.22 um Filtro PESMerck, Regno UnitoSLGP033RS
Inserto Netwell da 15 mm Filtro a rete da 74 umConstar, usa#3477
Acido alginico sale sodico da alghe bruneSigma-Aldrich, ukA0682
Cloruro di calcioSigma-Aldrich, ukC1016
CellTiter96  Saggio di proliferazione cellulare AQueous One SolutionPromega, USAIncapsulatore G3580
InotechIE-50numero di serie 05.002.01-2005
HEPESSigma-Aldrich, ukH4024
Hu Aβ 1-42 ELISAThermoFisher, UKKHB3441
Software ImageJImageJv1.49p
Microscopio a luce invertitaMicroscopio Leica OlympusCKX41
Microsystems Leica, Regno UnitoDMI6000B
Neo sCMOS CameraAnder, Regno Unito5,5
Soluzione salina tamponata con fosfatoSigma-Aldrich, Regno UnitoD1408
Cloruro di sodioSigma-Aldrich, Regno Unito433209
Citrato di trispdio diidratoSigma-Aldrich, Regno UnitoSoluzione W302600-K
Tripsina-EDTASigma-Aldrich, ukT4049

Riferimenti

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