Articolo metodologico

Studiare le dinamiche di Organelle nelle cellule B durante la formazione immunitaria di sinapsi

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DOI:

10.3791/59621

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1 giugno 2019

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Immune Cell Biology, Department of Cellular and Molecular Biology, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Faculty of Medicine, Pontificia Universidad Católica de Chile, 3Centro de Investigaciones en Biología Celular y Biomedicina, Facultad de Ciencia, Universidad San Sebastián

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui descriviamo due approcci per caratterizzare gli eventi di polarizzazione cellulare nei linfociti B durante la formazione di un IS. Il primo, comporta la quantificazione del reclutamento di organelli e riarrangiamenti del citoscheletro nella membrana sinaptica. Il secondo è un approccio biochimico, per caratterizzare i cambiamenti nella composizione del centrosome, che subisce la polarizzazione alla sinapsi immunitaria.

Abstract

Il riconoscimento degli antigeni legati alla superficie da parte del recettore delle cellule B (BCR) innesca la formazione di una sinapsi immunitaria (IS), in cui sono coordinati sia la segnalazione che l'assorbimento dell'antigene. La formazione dell'IS comporta un rimodellamento dinamico dell'actina accompagnato dal reclutamento polarizzato nella membrana sinaptica degli organelli centrocellulari e intracellulari associati come i lisosomi e l'apparato di Golgi. Le fasi iniziali del rimodellamento dell'actin consentono alle cellule B di aumentare la superficie cellulare e massimizzare la quantità di complessi antigene-BCR raccolti alla sinapsi. In determinate condizioni, quando le cellule B riconoscono gli antigeni associati alle superfici rigide, questo processo è accoppiato al reclutamento locale e alla secrezione di lisosomi, che possono facilitare l'estrazione dell'antigene. Gli antigeni assorbiti vengono internalizzati in compartimenti endolsomici specializzati per la lavorazione in peptidi, che vengono caricati su molecole principali del complesso di istocompatibilità II (MHC-II) per un'ulteriore presentazione alle cellule che aiutano T. Pertanto, studiare le dinamiche di orgelli associate alla formazione di un IS è fondamentale per comprendere come vengono attivate le cellule B. Nel presente articolo discuteremo sia l'imaging che una tecnica biochimica utilizzata per studiare i cambiamenti nel posizionamento degli organelli intracellulari e nei riarrangiamenti del citoscheletro associati alla formazione di una IS nelle cellule B.

Introduzione

I linfociti B sono una parte essenziale del sistema immunitario adattivo responsabile della produzione di anticorpi contro diverse minacce e dell'invasione degli agenti patogeni. L'efficienza della produzione di anticorpi è determinata dalla capacità delle cellule B di acquisire, elaborare e presentare antigeni incontrati in forma solubile o con tebranda superficiale1,2. Il riconoscimento degli antigeni attaccati alla superficie di una cellula di presentazione, da parte del BCR, porta alla formazione di uno stretto contatto intercellulare chiamato IS3,4. All'interno di questa piattaforma dinamica avviene sia la segnalazione a valle dipendente da BCR che l'internalizzazione degli antigeni in compartimenti endososomi. Gli antigeni assorbiti vengono elaborati e assemblati su molecole MHC-II e successivamente presentati ai linfociti T. Le interazioni B-T produttive, definite cooperazione cellulare B-T, permettono ai linfociti B di ricevere i segnali appropriati, che promuovono la loro differenziazione in plasmacellule o celle di memoria che producono anticorpi o cellule di memoria8.

Due meccanismi sono stati coinvolti nell'estrazione dell'antigene da parte delle cellule B. Il primo si basa sulla secrezione di proteasi provenienti da lisosomi che subiscono il reclutamento e la fusione presso la fessura sinaptica5,6. Il secondo, dipende da forze di trazione mediate Myosin IIA che innesca l'invaginazione dell'antigene contenente membrane che sono internalizzate in pozzi rivestiti di clathrin7 . La modalità di estrazione dell'antigene si basa sulle proprietà fisiche della membrana in cui si trovano gli antigeni. Tuttavia, in entrambi i casi, le cellule B subiscono due grandi eventi di rimodellamento: la riorganizzazione del citoscheletro actin e la polarizzazione degli organelli all'IS. Il rimodellamento del citoscheletro actina comporta una fase iniziale di diffusione, in cui le protrusioni dipendenti dall'actina nella membrana sinaptica aumentano la superficie a contatto con l'antigene. Segue una fase di contrazione, in cui le BCR accoppiate con gli antigeni sono concentrate al centro dell'IS dall'azione concertata dei motori molecolari e del rimodellamento del citoscheletro actina8,9,10, 11. La polarizzazione degli organelli si basa anche sulla ristrutturazione del citoscheletro actin. Ad esempio, il centrosore diventa disaccoppiato dal nucleo, dalla depolimerizzazione locale dell'actina associata,che consente il riposizionamento di questo organello all'IS 5,12. Nelle cellule B, il riposizionamento del centrosore a un polo cellulare (IS) guida il reclutamento di lisomi nella membrana sinaptica, che alla secrezione può facilitare l'estrazione e/o l'elaborazione di antigeni ad essere tesi dalla superficie6. I lisosomici reclutati all'IS sono arricchiti da MHC-II, che favorisce la formazione di complessi peptidi-MHC-II in compartimenti endosomici da presentare alle cellule T13. Inoltre, l'apparato di Golgi è stato osservato anche per essere reclutato da vicino all'IS14, suggerendo che le vesciche derivate da Golgi dal percorso secretoria potrebbero essere coinvolte nell'estrazione e/o nella lavorazione degli antigeni.

Complessivamente, i riarrangiamenti intracellulari di organelli e citoscheletri nelle cellule B durante la formazione di sinapsi sono i passi chiave che consentono un'efficiente acquisizione e elaborazione di antigeni necessari per la loro ulteriore attivazione. In questo lavoro introduciamo protocolli dettagliati su come eseguire l'imaging e l'analisi biochimica nelle cellule B per studiare il rimodellamento intracellulare degli organelli associati alla formazione di un IS. Queste tecniche includono: (i) Immunofluorescenza e analisi delle immagini delle cellule B attivate con perline rivestite di antigeni e su coverlips rivestiti di antigeni, che consente la visualizzazione e la quantificazione di componenti intracellulari mobilitati all'IS e (ii ) isolamento delle frazioni arricchite di centrosomi nelle cellule B mediante ultracentrifugazione su gradienti di saccarosio, che consente l'identificazione delle proteine associate al centroso, potenzialmente coinvolto nella regolazione della polarità cellulare.

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Protocollo

NOTA: i seguenti passaggi sono stati eseguiti utilizzando le celle IIA1.6 B.

1. Attivazione a cellule B con perline rivestite di antigene

  1. Preparazione di perline rivestite di antigene
    1. Per attivare le cellule B, utilizzare le perline NH2rivestite covalentmente con antigene (Ag-coated beads), che vengono preparate utilizzando antigeni 50 (20 x 106) di 3 perline NH2con antigeni di attivazione (BCR-ligand) o non attivanti (BCR-ligand-).
    2. Per IIA1.6 le cellule B utilizzano il frammento anti-IgG-F(ab')2 come BCR-ligand e anti-IgM-F(ab')2 o albumina di siero bovina (BSA) come BCR-ligand-. Per attivare le cellule B primarie o IgM- B linea cellulare utilizzare anti-IgM-F(ab')2 come BCR-ligand e BSA come BCR-ligand-.
      NOTA: Per evitare il legame dei ligandi al recettore Fc, utilizzare F(ab') o F(ab')2 frammenti di anticorpi invece di anticorpi a lunghezza intera.
    3. Per procedere con la preparazione di perline rivestite di Ag, posizionare le perline in tubi di microcentrifuga a basso legame proteico per massimizzare il recupero delle perline durante la manipolazione del campione. Aggiungere 1 mL di 1x salina tampone di fosfato (PBS) per lavare le perline e centrifugare a 16.000 x g per 5 min. Aspirate il supernatante.
    4. Risospendere le perline con 500 luna dell'8% di glutaraldeide per attivare i gruppi NH2 e ruotare per 4 h a temperatura ambiente (RT).
      AVVISO: La soluzione di stock di glutaraldeide dovrebbe essere utilizzata solo in una cappa di fumi chimici. Seguire le istruzioni riportate nella scheda dati sulla sicurezza dei materiali (MSDS).
    5. Centrifuga perline a 16.000 x g per 5 min, rimuovere la glutaraldeide e lavare le perline altre tre volte con 1 mL di 1x PBS.
      AVVISO: La soluzione della glutaraldeide dovrebbe essere scartata come rifiuto chimico pericoloso.
    6. Risospendere le perline attivate in 100 -L di 1x PBS. Il campione può essere suddiviso in due tubi di microcentrifuga a basso legame proteico: 50 -L per il BCR-ligando e 50 -L per BCR-ligand-.
    7. Per preparare la soluzione dell'antigene, utilizzare due tubi di microcentriera a basso legame proteico da 2 mL contenenti 100 g/mL di soluzione antigene in 150 -L di PBS: un tubo con BCR-ligando e altro con BCR-ligand-.
    8. Aggiungete 50 - L di perline attivate in ogni tubo contenente 150 gradi di soluzione antigene, vortice e ruotare durante la notte a 4 gradi centigradi.
    9. Aggiungete 500 L di 10 mg/mL di BSA per bloccare i restanti gruppi reattivi DiH2 sulle perline e ruotare per 1 h a 4 gradi centigradi.
    10. Centrifugare le perline a 16.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e rimuovere il supernatante. Lavare le perline con 1x PBS freddo altre tre volte.
    11. Risospendere le perline attivate in 70 -L di 1x PBS.
    12. Per determinare la concentrazione finale di perline rivestite di Ag, diluire un piccolo volume di perline in PBS (1:200) e contare utilizzando un emocitometro. Quindi conservare a 4 gradi centigradi fino all'uso.
      NOTA: Le perline rivestite di Ag non devono essere conservate per più di 1 mese.
  2. Preparazione di coperture poli-L-lisine
    1. Prima del test di attivazione della cella B con perline rivestite di Ag, preparare i copricapi rivestiti in poli-L-lisina (PLL-coverslips). Utilizzare un tubo da 50 mL contenente 40 mL di 0,01% w/v della soluzione PLL e immergere i coperchi di 12 mm di diametro nella soluzione. Ruotare durante la notte a RT.
    2. Lavare i copricopertine con 1x PBS e lasciare asciugare su un coperchio a 24 pozze coperti di pellicola di paraffina. Procedere con l'attivazione della cella B.
  3. Attivazione delle celle B
    1. Per avviare l'attivazione delle cellule B con perline, diluire prima la linea cellulare IIA1.6 B a 1,5 x 106 celle/mL in CLICK media (RPMI-1640 integrato con 2 mM L-Alanine-L-Glutamine - 55 beta-mercaptoethanol - 1 pirava da 1 mM streptomicina) - siero bovino fetale inattivato dal calore [FBS]).
    2. Unire 100 l (150.000 cellule) di cellule IIA1.6 B con perline rivestite di Ag a 1:1 rapporto in tubi da 0,6 mL. Mescolare delicatamente utilizzando un vortice e un seme su PLL-coverslips. Incubare per diversi punti temporali in un'incubatrice di coltura cellulare (37 c / 5% di CO2). I punti temporali di attivazione tipici sono 0, 30, 60 e 120 min. Per il tempo 0, posizionare i copripla PLL nel coperchio della piastra 24-well sul ghiaccio. Aggiungere la miscela di perline rivestite di cellule-Ag e incubare per 5 min sul ghiaccio.
      NOTA: È importante mescolare per vortice invece di pipettare su e giù, perché questo potrebbe ridurre il numero di perline nel campione, a causa del loro accumulo nella punta di plastica della pipetta. Utilizzare perline rivestite con BCR-ligand- come controllo negativo per ogni saggio. Si consiglia di attivare prima il tempo di incubazione più lungo e poi i seguenti punti temporali. Calcolare gli intervalli di attivazione per i campioni in modo che siano pronti per la fissazione allo stesso tempo.
    3. Aggiungere 100 l of cold 1x PBS ad ogni coperchio per interrompere l'attivazione e continuare con il protocollo di immunofluorescenza. Vedere la sezione protocollo 3.

2. Attivazione di cellule B su copricapi rivestiti di antigene

  1. Preparazione di coperture rivestite di antigene
    1. Prima dell'attivazione, preparare la soluzione di antigene (1x PBS contenente 10 g/mL BCR-ligando e 0,5 ratti anti-topo CD45R/B220).
      NOTA: Si consiglia di preparare i coperchi il giorno prima del saggio. B220 migliora l'adesione delle cellule B, tuttavia, il BCR-Ligand è sufficiente a generare la risposta di diffusione.
    2. Posizionare il coperchio da 12 mm su un coperchio a piastre da 24 pozzetti ricoperto di pellicola di paraffina, aggiungere 40 gradi di soluzione antigene su ciascun coperchio e incubare a 4 gradi durante la notte. Sigillare la piastra per evitare l'evaporazione della soluzione dell'antigene.
    3. Lavare i copricopro con 1x PBS e aria asciutta.
  2. Attivazione delle celle B
    1. Per avviare l'attivazione, diluire le celle IIA1.6 B a 1,5 x 106 celle/mL nel mezzo CLICK : 5% FBS.
    2. Aggiungete 100 celle su un coperchio rivestito di antigene (Ag-coverslip) e attivate per diversi punti temporali in un'incubatrice cellulare a 37 gradi centigradi / 5% di CO2. I punti temporali di attivazione tipici sono 0, 30 e 60 min.
      NOTA: Come nella sezione 1, si consiglia di iniziare con il punto temporale di attivazione più lungo per correggere tutti i campioni contemporaneamente.
    3. Per il tempo 0, posizionare il coperchio della piastra 24-well contenente l'Ag-coverslip sul ghiaccio e aggiungere le cellule. Incubare per 5 min sul ghiaccio.
    4. Aspirare con attenzione il supporto su ogni Ag-coverslip e quindi aggiungere 100 l'l di freddo 1x PBS per fermare l'attivazione. Continuare con il protocollo di immunofluorescenza. Vedere la sezione 3.

3. Immunofluorescenza

NOTA: Per evitare la reattività incrociata dell'anticorpo secondario con il BCR delle cellule IIA 1.6 B, non utilizzare anticorpi primari derivati dal topo.

  1. Rimuovere il 1x PBS e procedere con la fissazione di ogni coverslip.
    NOTA: Per decidere quale supporto di fissaggio utilizzare, controllare il foglio dati anticorpo/tintura. Ad esempio, per l'etichettatura actina da phalloidin use paraformaldedede (PFA) supporto di fissazione, e per l'etichettatura centroso per fissazione di metanolo pericentrino.
    1. Aggiungere 50 - L di 1x PBS integrato con 4% PFA e incubare per 10 min a RT.
      AVVISO: La formaldeide è tossica. Si prega di leggere l'MSDS prima di lavorare con questa sostanza chimica. Le soluzioni PFA devono essere realizzate solo sotto una cofatura con fumi chimici che indossa guanti e occhiali di sicurezza. La soluzione PFA dovrebbe essere scartata come rifiuto chimico pericoloso.
    2. In alternativa, aggiungere 50 l di metanolo freddo e incubare per 20 min.
  2. Lavare tre volte con 1x PBS.
    NOTA: i coverlips possono essere conservati a 4 gradi centigradi a questo punto per un massimo di tre giorni in 1 x PBS.
  3. Rimuovere 1x PBS e aggiungere 50 - L di buffer di blocco (2% BSA - 0,3 M glicina in 1x PBS) su ogni coverslip. Incubare a RT per 10 min.
  4. Aspirate delicatamente e aggiungere 50 L di buffer di permeabilizzazione (PB) (0,2% BSA - 0,05% di saponina in 1x PBS). Incubare a RT per 20 min.
  5. Preparare gli anticorpi o i coloranti in PB (usare 30 L per coverslip) e incubare a RT per 1 h o peruna durante la notte a 4 gradi centigradi. Fare riferimento alla Tabella dei materiali per ulteriori dettagli.
    1. Per etichettare il centro di organizzazione dei microtubuli (MTOC) o il centrosori, utilizzare i seguenti anticorpi: anti-Tubulina (1:500), anti-Cep55 (1:500), anti-tubulina (1:500), anti-pericentrina (1:1000).
      NOTA: Per l'etichettatura centroso le cellule B possono essere trascate con un plasmide di espressione centrina-GFP.
    2. Per l'etichettatura Golgi apparatus utilizzare anti-Rab6a (1:500).
      NOTA: Possono essere utilizzati anche altri anticorpi o coloranti.
    3. Per l'etichettatura dei lisosomi, utilizzare anti-Lamp1 (1:200).
      NOTA: possono essere utilizzati anche anti-H2-DM e anti-MHC-II per etichettare i compartimenti di elaborazione dell'antigene15,16.
    4. Per l'etichettatura dell'endolasmico reticulum utilizzare anti-Sec61a (1:500).
    5. Per l'actina citoscheletro considerare quanto segue: actina polimerizzata può essere visualizzata da Phalloidin coniugata a coloranti fluorescenti.
      NOTA: le cellule B trascate da un plasmid di espressione LifeAct-GFP/RFP possono essere utilizzate anche per etichettare actin.
  6. Lavare i coperchi tre volte con PBS.
  7. Diluire l'anticorpo secondario o i coloranti in PBS (utilizzare 30 - L per coverslip) e incubare 1 h a RT.
    NOTA: Evitare di esporre i campioni alla luce diretta per preservare la qualità del segnale di fluorescenza.
  8. Lavare i coperchi tre volte con PBS.
  9. Rimuovere la soluzione PBS dai copricoperture.
  10. Aggiungere 4 -L di reagente di montaggio in un vetrino del microscopio. Montare la coverslip sulla diapositiva con il lato cella rivolto verso il basso. Lasciare asciugare i vetrini per 30 min a 37 o durante la notte.
    NOTA: è consigliabile utilizzare un reagente di montaggio "anti-dissolvenza" (vedere la tabella dei materiali).
  11. Acquisire immagini di fluorescenza su un microscopio confocale o epifluorescenza con un obiettivo di immersione ad olio 60x o 100x. Per ogni acquisizione considerare la luce trasmessa o campo luminoso per identificare facilmente le cellule B che interagiscono con le perline.
    NOTA: Prendi immagini tridimensionali (3D), che coprono l'intera cella utilizzando z-stack. Si consiglia di prendere 0,5 m di spessore, tuttavia questo dipende dal microscopio.

4. Analisi dell'immagine

NOTA: per il software ImageJ vengono descritti i seguenti algoritmi. Tuttavia, questo può essere eseguito utilizzando un software equivalente. Inoltre, si consideri che per tutte le misurazioni di intensità di fluorescenza usiamo la densità di fluorescenza integrata ("RawIntDen" in ImageJ), perché questo parametro considera la quantità totale di fluorescenza in ogni pixel dell'immagine, tenendo conto dell'area.

  1. Analisi della distribuzione degli organelli nelle cellule B attivate con perline rivestite con Ag
    NOTA: Per quantificare la polarizzazione dei componenti cellulari all'IS, definiamo un valore arbitrario come misura di prossimità all'IS. L'indice varia tra -1 (antipolarizzato) e 1 (completamente polarizzato, oggetto sul tallone), come è stato precedentemente presentato da Reversat et al.12 mila.
    1. Stimare l'indice di polarità per l'apparato centrosome e Golgi (Figura 1B).
      NOTA: questo algoritmo può essere utilizzato per gli organelli che sono limitati a un punto.
      1. Definire innanzitutto le aree del tallone e delle celle da analizzare utilizzando la selezione dello strumento cerchio per delimitare i confini di entrambi e quindi salvarli come aree di interesse (ROI). Vedere Figura 1, Figura 2, Figura 3e Figura 4.
      2. Determinare il centro della cella (CC) e il centro del tallone (BC) eseguendo Analizza . Misurare rispettivamente sulle aree delle celle e dei talloni. I valori X e Y ottenuti dalla finestra Risultati determinano le coordinate centrali.
      3. Determinare manualmente il centro dell'apparato centroso o Golgi (Organelle) utilizzando la selezione dello strumento punto in ImageJ ed eseguire Analizza Misurare. I valori X e Y ottenuti dalla finestra Risultati determinano le coordinate.
      4. Quindi, disegnate un angolo da CC a Organelle (a) e da CC a BC (b) utilizzando la selezione dello strumento Angolo ed eseguite Analizza Misurare. Il valore dell'angolo nella finestra dei risultati mostra l'angolo ()tra entrambi i vettori (a e b).
      5. Calcolare l'indice di polarità utilizzando la seguente formula:
        figure-protocol-1
    2. Stimare l'indice di polarità per i lisosomi (Figura 1F).
      NOTA: utilizziamo questo algoritmo per analizzare la polarità degli organelli che mostrano una distribuzione più dispersa, come i lisosomi.
      1. Definire le aree del tallone e delle celle da analizzare, utilizzando la selezione dello strumento cerchio per delimitare i limiti di entrambi e salvarli come ROI. Una volta che le aree del tallone e delle cellule sono state determinate, impostare il canale di fluorescenza e proiettare l'immagine in una z-stack (Immagine Proprietà Stacks . -Project [Somma sezioni]), quindi eseguire Analizza Misurare ed estrarre le coordinate del centro di massa (MC) (MX e MY) dalle finestre dei risultati.
      2. Applicare lo stesso algoritmo menzionato prima di cambiare Organelle per MC. Di conseguenza, l'angolo ()è definito da CC-MC (a) e CC-BC (b).
      3. Calcolare la polarità utilizzando la seguente formula:
        figure-protocol-2
    3. Stimare il reclutamento lisososo sobbelper l'area sinaptica (Figura 2B).
      NOTA: questo algoritmo viene utilizzato per quantificare un organello adiacente all'IS.
      1. Una volta determinate le aree del tallone e della cella, determinare l'angolo del vettore tra IL CC e il BC e quindi ruotare l'immagine per ottenere un angolo di 0 gradi.
      2. Impostare il canale fluorescente e proiettare l'immagine in una serie z(Immagine Proprietà Stacks . - Progetto [Somma sezioni]), eliminare tutta la fluorescenza che non rientra nella cella e nell'area del tallone insieme (esegui modifica e chiara all'esterno in ImageJ).
      3. Utilizzando la selezione dello strumento rettangolo, disegnate un rettangolo adiacente al tallone e misurate la fluorescenza dell'area sinaptica (SAF). Questo rettangolo è un quarto della larghezza della cella.
      4. Selezionare l'intera immagine ed eseguire Analizza Misurare per ottenere la fluorescenza dell'intera cella (WCF).
      5. Calcolare la percentuale di fluorescenza dell'organelle adiacente all'IS utilizzando la seguente formula:
        figure-protocol-3
    4. Quantificare il reclutamento di componenti cellulari nel centrosome.
      NOTA: Questo algoritmo, adattato da Obino et al.5, viene utilizzato per quantificare l'arricchimento di organelli nell'area centrosorata. In breve, consideriamo l'area centrosoica come il dominio in cui la fluorescenza dell'orgelli associata al centroso rimane costante o superiore al 70% nella trama fluorescenza/raggio. È essenziale impostare questo parametro in condizioni di riposo perché questo raggio potrebbe cambiare al momento dell'attivazione.
      1. Una volta determinate le aree di perline e le celle, definire la localizzazione del centrosome utilizzando la selezione dello strumento punto ( Figura3B).
      2. In primo luogo, determinare l'area massima intorno al centrosome che è possibile quantificare, disegnando un cerchio di 3 m-radius che circonda il centrosome.
      3. Utilizzare il plugin ImageJ Profilo radiale, che misura la fluorescenza nei cerchi concentrici e visualizza un grafico a fluorescenza/raggio.
      4. Identificare il raggio massimo entro il quale viene mantenuta almeno il 70% dell'intensità della fluorescenza.
      5. Calcolare il rapporto di densità di fluorescenza utilizzando la seguente formula:
        figure-protocol-4=figure-protocol-5
        NOTA: Il rapporto di densità di fluorescenza indica la concentrazione di un organello al centrosore rispetto alla sua distribuzione in tutta la cellula.
  2. Analisi della diffusione cellulare e distribuzione degli organelli nelle cellule B attivate su Ag-coverslips
    1. Stimare la distribuzione di organelle all'IS (Figura 4B).
      NOTA: Questo algoritmo consente la quantificazione della distribuzione XY degli organelli e la loro concentrazione al centro dell'IS. Definiamo un rapporto di densità di fluorescenza tra l'area centrale e l'area sinaptica totale. I valori ottenuti possono variare da negativo a positivo, indicando rispettivamente una periferica o una distribuzione centrale dell'organello.
      1. Determinare la sezione in cui la cella è in contatto con il coperchio.
        NOTA: Per delimitare i confini cellulari si può etichettare la membrana plasmatica o actin che è arricchita nella periferia dell'IS.
      2. Modificare il tipo della sezione a 8 bit, quindi binario (Processo Proprietà Binary . Make Binary) e collegare i punti esterni più vicini Process Proprietà Binary . aspetti mpl generali. Delimitare i limiti dell'area della cella (CA) utilizzando la selezione dello strumento poligono.
        NOTA: questo passaggio è utile per aumentare il contrasto dei contorni delle celle e semplificarne l'identificazione. Inoltre, a questo punto, è possibile applicare il plugin Analizza particelle di ImageJ per determinare automaticamente la CA. Tuttavia, altre celle nello stesso campo possono interferire con i risultati.
      3. Prendere i parametri CA (altezza e larghezza) e delimitare un'area arrotondata centrale, separata dai contorni da un quarto dei valori di altezza e larghezza, considerare quest'area come l'area del centro della cella (CCA).
      4. Calcolare la distribuzione della densità di fluorescenza al centro dell'IS utilizzando la seguente formula:
        figure-protocol-6
    2. Misurare la distribuzione dell'organanei nei piani di z (Figura 4C).
      NOTA: Questa analisi determina la distribuzione generale della fluorescenza dell'orgelli attraverso i piani delle cellule B attivate su ag-coverslips, mostrando la percentuale di fluorescenza per frazione z.
      1. Per quantificare la distribuzione della fluorescenza in , determinare innanzitutto il piano dell'IS in cui la cella è in contatto con l'Ag-coverslip e quindi il piano corrispondente al limite superiore della cella.
      2. Disegnare una linea al centro della cella.
      3. Reslice l'immagine in : (Immagine) Proprietà Stacks . Reslice), per ottenere un'immagine X.
      4. Misurare l'altezza e dividere l'immagine x in 10 rettangoli consecutivi della stessa altezza (frazione z) dal basso (interfaccia IS) verso l'alto (lato superiore della cella) e quantificare il segnale di fluorescenza in ciascuno di essi.
      5. Normalizzare l'intensità di fluorescenza di ogni frazione z per la somma della fluorescenza totale delle 10 frazioni.
      6. Tracciare la percentuale di intensità di fluorescenza per frazione di cella.

5. Isolamento della frazione arricchita centroso dalle cellule B attive e di riposo

NOTA: Durante l'esperimento, tenere tutte le soluzioni a 4 gradi centigradi per evitare la degradazione delle proteine. Questo protocollo è stato adattato dal lavoro precedente17,18.

  1. Attiva 2 x 107 celle B con perline rivestite di Ag in 2 mL di media CLICK : FBS inattivato dal calore del 2% (rapporto 1:1). Considerare le cellule B non attivate come celle B a riposo.
  2. Aggiungete la citochalasina D (2 m) e la nocodazolo (0,2 m) e incubate per 1 h a 37 gradi centigradi.
    NOTA: Questi farmaci sono utilizzati per staccare delicatamente il centrosore dal nucleo, depolinizzando il citoscheletro e i microtubuli, rispettivamente, per evitare la contaminazione nucleare.
  3. Lavare ogni campione con 5 mL di 11 TBS freddo (50 mM MM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl) e poi con 1 mL di 0,1x TBS integrato con 8% di saccarosio.
  4. Risospendere le cellule con 150 % di buffer di lisi centroso (1 mM HEPES, pH 7.2, 0,5% NP-40, 0,5 mM MgCl2, 0,1% beta-Mercaptoethanol, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) o cocktail inibitore proteassi) e pipetate verso il basso fino alla vicosità diminuisce, che indica che la lisi delle cellule è identificata nel campione. Mettere il campione in un tubo da 1,5 mL.
  5. Centrifuga a 10.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi, per separare gli organelli dal nucleo.
  6. Recuperare con attenzione il supernatante e posizionarlo sopra un tubo da 1,5 mL con 300 l of gradient buffer (GB) (10 mM PIPES pH 7.2, 0.1% Triton X-100, 0.1% beta-mercaptoethanolo) contenente il 60% di saccarosio.
  7. Centrifuga a 10.000 x g per 30 min a 4 gradi centigradi per concentrare i centrisomi nella frazione di saccarosio 60%.
  8. Nel frattempo, preparate un gradiente discontinuo in tubi di ultracentrifuga da 2 mL sovrapponendo 450 - L di GB , 70% di saccarosio con 270 , l'l di GB, 50% di saccarosio e poi 270 l undisa ( 40% di saccarosio).
  9. Dopo la prima centrifugazione (frazione centro-concentrata), scartare la frazione superiore (porzione meno densa) fino a raggiungere l'interfaccia e vortice il campione rimanente nel tubo. Quindi, sovrapponi sopra il gradiente discontinuo precedentemente preparato con il campione arricchito per il centrosome.
    NOTA: Fare attenzione a non interrompere il gradiente, tutte le procedure di pipettaggio devono essere eseguite con attenzione.
  10. Centrifuga a 40.000 x g per 1 h a 4 gradi centigradi con un'accelerazione minima e con il freno centrifuga impostato, per evitare di interrompere la pendenza.
  11. Raccogliere 12 frazioni di 100 gradi in tubi separati a partire dall'alto.
  12. Identificare le frazioni arricchite centrosome con immunoblot usando la z-tubulina come marcatore centroso.
    NOTA: Di solito troviamo estratti arricchiti di centrosome tra le frazioni 6 e 8.

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Risultati

Il presente articolo mostra come le cellule B possono essere attivate utilizzando antigene immobilizzato su perline o coverlips per indurre la formazione di un IS. Forniamo informazioni su come identificare e quantificare la polarizzazione di diversi organelli mediante immunofluorescenza e come caratterizzare le proteine che subiscono cambiamenti dinamici nella loro associazione al centrosome, che si polarizza all'IS, approccio biochimico.

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Discussione

Descriviamo un metodo completo per studiare come i linfociti B riorganizzano la loro architettura intracellulare per promuovere la formazione di un IS. Questo studio include l'uso di tecniche di imaging per quantificare la distribuzione intracellulare di organelli, come centrosome, apparato di Golgi e lisosomi durante l'attivazione della cellula B, e come si polarizzano all'IS. Inoltre, descriviamo un approccio biochimico allo studio dei cambiamenti nella composizione centrosoria dopo l'attivazione delle cellule B.

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

M.-I.Y. è supportato da una borsa di ricerca di FONDECYT #1180900. J.I., D.F. e J.L. sono stati sostenuti da borse di studio del Comisiàn Nacional de Ciencia y Tecnolog. Ringraziamo David Osorio della Pontificia Universidad Catalia de Chile per la registrazione video e l'editing.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cellsATCCTIB-208Linfoma B murino di origine Balb/c che esprime un BCR contenente IgG sulla sua superficie senza FcγIIR
100% methanolFisher ScientificA412-4
10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circularMarienfield-Superior111500
2-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific21985023
Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG LifeTech A21206Si raccomanda una diluizione 1:500 ma dovrebbe essere ottimizzata
Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit  IgGThermo Fisher Scientific A-11071Si raccomanda una diluizione 1:500 ma dovrebbe essere ottimizzata
Alexa Fluor 647-conjugated phalloidinThermo Fisher Scientific A21238Si raccomanda una diluizione 1:500 ma dovrebbe essere ottimizzata
Amaxa Nucleofection kit VLonzaVCA-1003Seguire le istruzioni del produttore per la miscelazione dei reagenti di trasfezione con il DNA
Amaxa Nucleofector model 2bLonzaAAB-1001Usato il programma L-013
Amino- DynabeadsThermoFisher14307D
Anti-pericentrin Abcamab4448 Si raccomanda una diluizione 1:200 ma dovrebbe essere ottimizzata
Anti-rab6Abcamab95954Si raccomanda una diluizione 1:200 ma dovrebbe essere ottimizzata
Anti-sec61Abcamab15575Si raccomanda una diluizione 1:200 ma dovrebbe essere ottimizzata
BSA Winkler BM-0150
CaCl2WinklerCA-0520
Culture plate T25BD353014
Fiji SoftwareFiji col.
Fluoromount GElectron Microscopy Science17984-25
GlutamineThermo Fisher Scientific35050061
GlutaraldehydeSigma G7651 
GlycineWinkler BM-0820
Goat-anti-mouse IgG antibodyJackson ImmunoResearch315-005-003Legante positivo per IIA1.6
Goat-anti-mouse IgM antibodyThermo Fisher Scientific31186Legante negativo per IIA1.6
HyClone Fetal bovine serumThermo Fisher ScientificSH30071.03Disattivare a caldo a 56 oC per 30 min
KClWinklerPO-1260
Leica SP8 TCS microscopeLeica
NaClWinklerSO-1455
Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope Nikon
ParafilmMP1150-2
ParaformaldehydeMerck30525-89-4Diluire al 4% con PBS in un gabinetto di sicurezza, usare al momento
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Liquido
Polybead Amino Microspheres 3.00μmPolyscience17145-5
Poly-L-LysineSigmaP8920Diluire con acqua sterile
Rabbit anti- alpha tubulin antibodyAbcamab6160Si raccomanda una diluizione 1:1000 ma dovrebbe essere ottimizzata
Rabbit anti mouse lamp1 antibodyCell signaling3243Si raccomanda una diluizione 1:200 ma dovrebbe essere ottimizzata
Rabbit anti-cep55 Abcamab170414Si raccomanda una diluizione 1:500 ma dovrebbe essere ottimizzata
Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody Abcamab16504 1:1000 per Western Blot
RPMI-1640Biological Industries01-104-1A
Saponin Merck558255
Sodium pyruvateThermo Fisher Scientific11360070
SucroseWinkler SA-1390 
Triton X-100 Merck9036-19-5
Tube 50 mlCorning353043

Riferimenti

  1. Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
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  6. Yuseff, M. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
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  9. Wang, J. C., et al. The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).
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  19. Obino, D., et al. Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).
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