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Articolo metodologico

In Vivo Avanti Schermo Genetico per Identificare Nuovi Geni Neuroprotettivi in Drosophila melanogaster

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DOI:

10.3791/59720

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11 luglio 2019

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1Department of Biological Sciences, University of Alabama, 2Department of Genetics, University of Wisconsin-Madison

In questo articolo

Sommario

Vi presentiamo un protocollo utilizzando un approccio genetico in avanti allo screening per i mutanti che mostrano neurodegenerazione in Drosophila melanogaster. Incorpora un saggio di arrampicata, analisi istologica, mappatura genica e sequenziamento del DNA per identificare in ultima analisi nuovi geni legati al processo di neuroprotezione.

Abstract

C'è molto da capire sull'insorgenza e la progressione delle malattie neurodegenerative, compresi i geni sottostanti responsabili. Lo screening genetico in avanti utilizzando mutageni chimici è una strategia utile per mappare i fenotipi mutanti ai geni tra la Drosophila e altri organismi modello che condividono le vie cellulari conservate con gli esseri umani. Se il gene mutato di interesse non è letale nelle fasi iniziali dello sviluppo delle mosche, è possibile eseguire un'analisi in aumento per esaminare gli indicatori fenotipici del funzionamento del cervello in diminuzione, come i bassi tassi di arrampicata. Successivamente, è possibile eseguire un'analisi istologica secondaria del tessuto cerebrale per verificare la funzione neuroprotettiva del gene segnando fenotipi di neurodegenerazione. Le strategie di mappatura genica includono la mappatura meiotica e di carenza che si basa su questi stessi assegni può essere seguita dal sequenziamento del DNA per identificare possibili cambiamenti nucleotidi nel gene di interesse.

Introduzione

I neuroni sono per la maggior parte post-mitotici e incapaci di dividere1,2. Nella maggior parte degli animali, esistono meccanismi neuroprotettivi per mantenere queste cellule per tutta la durata della vita dell'organismo, soprattutto in età avanzata quando i neuroni sono più vulnerabili ai danni. I geni alla base di questi meccanismi possono essere identificati in mutanti che presentano neurodegenerazione, un indicatore fenotipipico per la perdita di neuroprotezione, utilizzando un protocollo genetico in avanti. Gli schermi genetici in avanti che utilizzano mutageni chimici come il metaesonte etilare (EMS) o N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) sono particolarmente utili a causa delle mutazioni casuali che inducono, con conseguente un approccio intrinsecamente imparziale che ha fatto luce numerose funzioni geniche negli organismi del modello eucariotico3,4,5 (al contrario, la mutagenesi a raggi X crea rotture del DNA e può provocare riarrangiamento piuttosto che mutazioni puntiformi6).

Il comune filo della frutta Drosophila melanogaster è un soggetto ideale per questi schermi grazie alla sua alta qualità, sequenza genomica ben annotata, la sua lunga storia come organismo modello con strumenti genetici altamente sviluppati, e più significativamente, la sua comune storia evolutiva con gli esseri umani7,8. Un fattore limitante nell'applicabilità di questo protocollo è la letalità precoce causata dai geni mutati, che impedirebbe i test ai9anni . Tuttavia, per le mutazioni non letali, un saggio di arrampicata, che sfrutta il geotassi negativo, è un metodo semplice, anche se esteso, per quantificare il funzionamento motorio alterato10. Per mostrare una sufficiente reattività locomotoria, le mosche dipendono dalle funzioni neurali per determinare la direzione, percepire la sua posizione e coordinare il movimento. L'incapacità delle mosche di salire sufficientemente in risposta agli stimoli può quindi indicare difetti neurologici11. Una volta identificato un particolare fenotipo dell'arrampicata difettosa, ulteriori test utilizzando uno schermo secondario come l'analisi istologica del tessuto cerebrale, possono essere utilizzati per identificare la neurodegenerazione nelle mosche difettose dell'arrampicata. La successiva mappatura genica può quindi essere utilizzata per rivelare la regione genomica sul cromosoma che porta il gene neuroprotettivo difettoso di interesse. Per restringere la regione cromosomica di interesse, è possibile eseguire la mappatura meiotica utilizzando linee di mosca mutanti che trasportano geni marcatori dominanti con posizioni note sul cromosoma. I geni marcatori fungono da punto di riferimento per la mutazione, poiché la frequenza di ricombinazione tra due loci fornisce una distanza misurabile che può essere utilizzata per mappare la posizione approssimativa di un gene. Infine, l'attraversamento delle linee mutanti con linee che trasportano carenze equilibrate sulla regione cromosomica meioticamente mappata crea un test di complemento in cui il gene di interesse può essere verificato se il suo fenotipo noto è espresso5. Le sequenze di nucleotidi polimorfici nel gene identificato, eventualmente risultanti in sequenze di amminoacidi alterate, possono essere valutate sequenziando il gene e confrontandolo con la sequenza del genoma della Drosophila. La successiva caratterizzazione del gene di interesse può includere test di ulteriori alleli mutanti, esperimenti di salvataggio delle mutazioni e l'esame di fenotipi aggiuntivi.

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Protocollo

1. Preparazione e invecchiamento delle mosche

  1. Ottenere o generare6 una raccolta di mutanti Drosophila che verranno utilizzati per lo schermo genetico. Qui vengono utilizzate linee ENU-mutagenized mappate al secondo cromosoma e bilanciate rispetto al CyO.
  2. Amplificate le linee di genotipo sperimentale in un'incubatrice fissata a 25 gradi centigradi, 12 h ciclo chiaro/scuro sul mezzo della farina di mais-melassa.
  3. Raccogli circa 20 progenie omozionali tra 0-2 giorni di eclosione adulta da ogni genotipo sperimentale. Elimina i pregiudizi sessuali raccogliendo costantemente mosche maschili o femminili.
  4. Età le mosche su melassa di farina di mais come desiderato a 29 gradi centigradi, capovolgendo le fiale ogni 2-3 giorni al fine di mantenere le mosche sul cibo fresco come invecchiano. Nella schermata qui presentata, le mosche sono state invecchiate per 10-12 giorni.
  5. Assemblare una camera di prova di prova di prova di prova di arrampicata utilizzando due fiale e nastro come descritto in precedenza10. Le fiale devono essere collegate ad entrambe le estremità aperte. Utilizzare un righello per contrassegnare una linea di 5 cm su un'estremità della camera.

2. Protocollo 1: Ansaggio dell'arrampicata (Adattato da Ali et al.10)

  1. Convalidare il test di arrampicata. In questo studio, testare il test di arrampicata basato sulla metodologia precedentemente descritta da Ali et al.10, utilizzando ElavC155>UAS-TauR406W (che presenta tassi di passaggio di salita più bassi) e ElavC155>UAS-GFP ( e ElavC155>UAS-mCherry (controllo) vola.
  2. Capovolgere le mosche in una camera di prova, una linea alla volta (non utilizzare l'anestesia CO2) e consentire loro di recuperare per 5 min. Se il test viene eseguito in giorni diversi, eseguire il test alla stessa ora del giorno. In questo studio, tutti i saggi di arrampicata sono stati eseguiti nel pomeriggio per controllare gli effetti circadiani sulla locomozione12.
    NOT: Evitare di esporre le mosche alla luce solare diretta durante i test; questo interferirà con la loro capacità di salire.
  3. Toccare con la punta la camera (contrassegnata lateralmente) su un mouse pad posizionato su una superficie solida 3 volte in modo che tutte le mosche inizino il saggio nella parte inferiore. Osservare la locomozione a mosca per un periodo di 10 s.
  4. Registrare il numero di mosche che raggiungono o superano la linea di 5 cm entro questo periodo, così come il numero totale di mosche testate. Ripetere il protocollo, in attesa di 1 min tra ogni prova, per un minimo di 3 repliche di prova per linea.
    NOT: Nel presente studio, ogni fiala conteneva tra 2 e 19 mosche per lo screening iniziale (mosche maschili) e tra 6 e 21 mosche per l'analisi della carenza mutante di linee femminili incrociate (Sezione 5.3.).

3. Protocollo 2: Selezione dei ceppi di Drosophila per ulteriori analisi

  1. Inserisci i dati di analisi in salita in Microsoft Excel o in un software simile e calcola la frequenza di passaggio per l'arrampicata su tutte le repliche come percentuale.
  2. Eseguire analisi statistiche per rilevare linee mutanti che si discostano in modo significativo dal valore medio di arrampicata percentuale di tutte le linee utilizzando il pacchetto software R13.
    1. Leggere i file di dati curati per i file R (file con estensione csv o txt con una colonna per ogni variabile o fattore e le righe che rappresentano i valori specifici).
      NOT: Qui, i dati per i maschi (analisi iniziale) e le femmine (linea 867 attraversata per linee di carenza) sono stati inseriti in fogli .xlsx separati come due colonne, una in cui le righe della colonna identificano la linea mutante e quante volte il saggio è stato replicato e l'altro in cui le righe rappresentano il successo medio dell'arrampicata (in percentuale) per ogni fiala replicante delle mosche.
    2. Leggere i dati in R usando il codice seguente:Read the data into R using the following code:
      mali<-read.csv(".. /male_init.csv")
      femdef<-read.csv(".. /fem_def_cross.csv")
      NOT: Il ".." nelle directory path sono percorsi assoluti dalla directory radice del computer dell'utente e devono essere specificati dal singolo utente per i percorsi di directory del computer.
    3. Eseguire la modellazione lineare
      1. Eseguire la regressione variabile fittizia con la funzione lm in R. Per l'analisi iniziale delle linee mutanti, valuta il significato degli effetti a livello di fattore (linee mutanti) sulla percentuale di successo dell'arrampicata contro la grande media per una variabile di risposta centrata media zero (percentuale di successo).
        NOT: Il "-1" alla fine della chiamata di funzione lm nella sezione 3.2.3.2. rimuove l'intercetta e ci permette di testare tutti i livelli di fattore contro la media zero centrata tasso di percentuale di arrampicata tasso di passaggio.
      2. Stampare i risultati sullo schermo utilizzando la funzione di riepilogo R:
        mali_anova<-lm(scala(mali-Successo_P)
        summary(mali_anova)
      3. Utilizzare le righe di controllo (se presenti) come linea di base per testare gli effetti a livello di fattore rispetto all'utilizzo del seguente codice R: x<-relevel(femdef-Mutant_line, ref-a867_plus")
        femdef_anova<-lm(femdef'P_success'x)
        riepilogo(femdef_anova)
        NOT: La prima riga di codice riordina i livelli dei fattori in modo che la linea di controllo negativa diventi l'intercetta di base in cui vengono testati tutti gli altri livelli di fattore (linee mutanti) con i test tincorporati nella funzione lm.
  3. Scegliere una soglia per le righe candidate in base all'età al momento del test. Per determinare la soglia, eseguire un test preliminare all'età desiderata utilizzando mutanti noti che mostrano neurodegenerazione e bassi tassi di passaggio di arrampicata rispetto al tipo selvaggio, il controllo vola10.
    NOT: Un tasso di superamento inferiore al 50% può essere appropriato per le mosche di 10 giorni, come riportato in precedenza per le linee della Drosophila che sovraesprimono il gene Tau correlato alla neurodegenerazione umana nel sistema nervoso10. Le mosche più vecchie dovrebbero avere una soglia di superamento più alta poiché si prevede che mostrino una ridotta locomozione, quindi, una maggiore neurodegenerazione.

4. Protocollo 3: Analisi dell'istologia

  1. Indossare guanti, tagliare le teste a mosca con una lama chirurgica seguendo il saggio di arrampicata e utilizzare un pennello per metterli delicatamente in 1 mL del fissativo di Carnoy (6:3:1 di 100% EtOH: cloroformio: acido acetico glaciale) in un tubo di micro centrifuga da 1,5 ml O/N a 4 gradi centigradi. Assicurarsi che le teste affondino nella soluzione fissativa.
  2. Sostituire la soluzione fissativa il giorno successivo con 1 mL del 70% di EtOH e mantenere i campioni ancora a 4 gradi centigradi per le analisi future.
    NOT: Il protocollo può essere sospeso in questo passaggio.
  3. Posizionare le testine dal punto 4.2. un massimo di cinque per cassetta microbiosa. Posizionare immediatamente le cassette in un contenitore riempito con il 70% di EtOH. Conservare il contenitore a 4 gradi centigradi prima della spedizione in un impianto di istologia per l'elaborazione e l'incorporamento della paraffina delle testine. Se sono disponibili apparecchiature per l'elaborazione e l'incorporamento dei tessuti, seguire il passaggio 4.4.
  4. Incorporare le testine in paraffina per la sezionazione microtoma:
    1. Seguire le impostazioni del programma per una macchina automatizzata per l'elaborazione dei tessuti nell'ordine presentato nella Tabella 1 per disidratare, pulire e infiltrarsi con paraffina le testine.
    2. Trasferire i campioni in stampi di base metallici che si adattano alla cassetta utilizzando la paraffina riscaldata a 60 gradi utilizzando una stazione di incorporamento di paraffina.
    3. Orientare le teste (orientamento antero-posteriore rivolto verso la parte superiore) nello stampo di base utilizzando pinze sottili per consentire una corretta visualizzazione del tessuto cerebrale dopo la sezione. Questo può essere fatto riscaldando la paraffina a 60 gradi centigradi e riposizionando le testine, se necessario.
      NOT: Gli stampi metallici possono essere sostituiti da stampi di base usa e getta.
    4. Posizionare la cassetta sulla parte superiore dello stampo di base corrispondente e spostarle delicatamente sul lato refrigerato della stazione di incorporamento della paraffina (4 gradi centigradi). Attendere che il blocco si indurisce prima di rimuoverlo dalla stazione.
    5. Rimuovere il blocco formare lo stampo dissociando delicatamente lo stampo dalla cassetta.
  5. Tagliare ogni blocco di paraffina prima della sezionamento per ridurre al minimo la superficie che verrà sezionata.
  6. Impostare il microtoma per tagliare 5 sezioni m di ciascun blocco.
  7. Posizionare il nastro di paraffina sezionato contenente il tessuto in un bagno d'acqua riscaldata (35 gradi centigradi) per un massimo di 5 min.
  8. Immergere un vetrino rivestito in poli-lysina (aiuta a trattenere il tessuto) nel bagno d'acqua riscaldata, posizionando il nastro sezionato sul vetrino utilizzando applicatori di legno. Lasciare asciugare l'aria dello scivolo o/N a temperatura ambiente.
  9. Riscaldare i vetrini per 15 minuti a 63 gradi centigradi utilizzando uno scaldavele.
  10. Posizionare i vetrini su un rack di colorazione scivoloe e macchia con ematossilina e eosina (H&E) sotto un cappuccio fuma rispettando i seguenti passaggi.
    1. Posizionare il rack in Histochoice (sostituzione non tossica di Xylene, che aiuta a rimuovere la paraffina dal campione) per 5 min.
    2. Trasferire il rack in un contenitore pieno di Histochoice per 5 min.
    3. Trasferire il rack in un contenitore riempito con 100% EtOH 1 per 5 min.
    4. Trasferire il rack in un contenitore riempito con 100% EtOH 2 per 5 min.
    5. Trasferire il rack in un contenitore riempito con 95% EtOH per 3 min.
    6. Trasferire il rack in un contenitore riempito con 70% EtOH per 3 min.
    7. Trasferire il rack in un contenitore riempito con Distilled H2O per 5 min.
    8. Trasferire il rack in un contenitore pieno di Harris Hematoxylin per 2-5 min.
    9. Estrarre il rack dalla soluzione Hematoxylin e metterlo sotto l'acqua corrente del rubinetto per 10 min.
    10. Trasferire il rack in un contenitore riempito con acqua distillata facendo una breve macchia.
    11. Trasferire il rack in un contenitore riempito con Eosin per 1-2 min.
    12. Trasferire il rack in un contenitore riempito con 95% EtOH facendo una breve dunk.
    13. Trasferire il rack in un contenitore riempito con 95% EtOH per 5 min.
    14. Trasferire il rack in un contenitore riempito con 100% EtOH per 5 min.
    15. Trasferire il rack in un contenitore riempito con 100% EtOH per 5 min.
    16. Trasferire il rack in un contenitore pieno di Histochoice (o Xylene) per 5-10 min fino a quando tutti gli scivoli sono montati.
    17. Montare il vetrino e la vela (24 mm x 60 mm di dimensione). Utilizzando pinze, estrarre lo scivolo dalla soluzione Histochoice o Xylene e fare una sottile striscia di supporto di montaggio sulla parte superiore di esso. Posizionare delicatamente la coverslip sulla parte superiore, cercando di evitare la formazione di bolle.
    18. Lasciare che il supporto di montaggio sui vetrini montati indurisci O/N sotto il cofano del fumi prima dell'analisi.
    19. Conservare i vetrini macchiati in una scatola a temperatura ambiente.
  11. Quantifica la neurodegenerazione osservando tutte le sezioni seriali sulla diapositiva all'ingrandimento 20x al microscopio luminoso. Esaminare l'intero cervello, prendendo nota qualitativa delle dimensioni e il numero di vacuoli che appaiono in tre sezioni consecutive.
  12. Ottenere immagini di sezioni cerebrali rappresentative a circa il cervello medio utilizzando un microscopio luminoso dotato di software di imaging.

5. Protocollo 4: Mappatura genica del fenotipo mmutante recessivo

  1. Superare la linea candidata verso un tipo selvaggio CantonS (BL_ 9517) o un altro tipo selvaggio o ceppo isogenato (ad esempio, OregonR (BL_ 2376), w1118 (BL_5905) o yw (BL_ 6599) per determinare se il fenotipo è dominante o Recessivo.
    NOTA:     i risultati di questo passaggio guideranno i passaggi successivi della mappatura. Se il fenotipo è recessivo, è possibile eseguire la mappatura della carenza.
    1. Utilizzando un pennello, fare una croce mettendo in una fiala contenente cibo CO2-anestesizzato mosche della linea di interesse mutante (5 maschi) e la linea CantonS (10-15 femmine vergini). Posizionare la fiala a 25 gradi centigradi.
    2. Raccogli la progenie eterozigola di F1 e ripeti l'arrampicata e gli esperimenti di istologia.
    3. Confronta i risultati ottenuti con la sola linea di controllo e con i mutanti omozifuti. Una buona indicazione del fenotipo recessivo sarà se i mutanti eterozie presentano fenotipi simili a quelli delle mosche di tipo selvatico.
  2. Eseguire la mappatura meiotica per stimare approssimativamente la posizione della mutazione sul secondo cromosoma utilizzando il wgSp-1 J1 L 2 Pin1/CyO (BL_3227) o un ceppo equivalente con marcatori dominanti associati a noti posizione citologica. In questo caso, la mutazione era precedentemente nota per essere situata sul secondo cromosoma.
    1. Utilizzando un pennello, fare una croce mettendo in una fiala contenente cibo CO2-anestesizzato mosche della linea di interesse mutante (5 maschi) e il wgSp-1 J1 L 2 Pin1/CyO linea (10 femmine). Posizionare la fiala a 25 gradi centigradi.
      NOT: L'obiettivo di questa croce è quello di generare femmine eterozie che portano il cromosoma con la nuova mutazione e il cromosoma marcatore, che si ricombinano durante la meiosi6,14. La progenie femminile di F1 viene scelta piuttosto che i maschi poiché la ricombinazione non avviene nei maschi.
    2. Raccogliere almeno 15 progenie femminile vergine che trasportano il cromosoma con la nuova mutazione e il cromosoma marcatore e attraversarli a 5 maschi da una linea equilibrata che porta un altro marcatore dominante visibile (ad esempio, CyO/snaSco (BL_2555) o equivalente).
    3. Raccogliere la progenie maschile etetozia portando sia Sco o CyO e il cromosoma potenzialmente ricombinato dalla croce nel passo 5.2.2. e accoppiarli individualmente alle femmine vergini dello stock portando il cromosoma mutato.
    4. Raccogliere la progenie dalla croce finale descritta nel passaggio 5.2.3. e l'età delle mosche a 29 gradi centigradi (in questo studio le mosche sono state invecchiate per 10-14 giorni).
    5. Raccogliere teste, eseguire l'analisi istologica come descritto nel Protocollo 3 e guardare le diapositive con sezioni cerebrali per determinare il grado di neuropatologia come descritto al passaggio 4.11. L'analisi istologia viene eseguita piuttosto che l'analisi della locomozione a causa di fenotipi che possono influenzare l'analisi dell'arrampicata, come Jammed (J), che provoca l'accumulo di liquidi nelle ali15.
  3. Eseguire la mappatura delle carenze sulla regione ristretta del cromosoma per affinare la posizione della mutazione recessiva utilizzando il saggio di arrampicata. Ogni linea di carenza ha una cancellazione di diverse regioni dei cromosomi, permettendo loro di essere utilizzati per i test di completamento.
    1. Iniziare con grandi carenze che attraversano la regione identificata nella mappatura meiotica, che può poi essere ulteriormente ridotta dall'uso di carenze più piccole. Se l'analisi della carenza si traduce in più di un gene candidato, si raccomanda l'uso di stock di interferenza dell'RNA (RNAi) per indirizzarli.
    2. Le linee incrociate del kit di carenza della Drosophila 16 per il secondo cromosoma (DK2L in questo studio) e cercano il non complemento del fenotipo di interesse (in questo studio: tasso di passaggio di arrampicata dell'8,5% che corrisponde al tasso di passaggio mosche omoygous dalla linea 867 usato come controllo positivo).
    3. Confermare il fenotipo della neurodegenerazione utilizzando la verifica istologica come descritto nella Sezione 4 (Protocollo 3).

6. Protocollo 5: Sequenziamento e analisi del DNA

NOT: Tenete a mente che la mutagenesi ENU introduce mutazioni puntiformi11.

  1. Progettare sequenze di primer in avanti e inverse che fiancheggiano la regione di codifica esone del gene brat per l'amplificazione da parte della reazione a catena Polimerasi (PCR) della regione di interesse (nel caso della linea 867 un frammento di DNA delle dimensioni di 3.247 bp è amplificato per sequenziamento17).
  2. Estrarre il DNA da una singola mosca18 :
    1. Schiaccia delicatamente la mosca in un tubo di centrifuga di 0,5 mL contenente 50.L di tampone di squishing (10 mM Tris-Cl pH 8.2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl e 200 g/mL Proteinase K; l'enzima deve essere diluito fresco da uno stock congelato prima di ogni utilizzo) utilizzando una punta di traino o P200.
    2. Incubare per 30 min a 37 gradi centigradi
    3. Disattivare la Proteinasi K posizionando il tubo a 95 gradi centigradi per 2 min.
      NOT: Il DNA estratto può essere conservato a 4 gradi centigradi per diversi mesi.
  3. Eseguire la reazione PCR utilizzando un DNA ad alta fedeltà Taq Polymerase (reagenti e condizioni di ciclo termico utilizzate in questo studio sono riportati rispettivamente nella tabella 2 e nella tabella3) rispettando le istruzioni del produttore ed eseguire il prodotto PCR su un % gel di agarose contenente Invitrogen SYBR Safe DNA Gel Stain, che è un'alternativa non tossica del bromuro di Ethidium.
  4. Accisa la banda della dimensione corretta dal gel con un bisturi e purifica il prodotto PCR utilizzando il Wizard SV Gel e PCR Clean-Up System (Promega) o kit equivalente, rispettando le istruzioni del produttore.
  5. Progettare primer in avanti e inretro che verranno utilizzati per il sequenziamento del DNA al fine di coprire l'intera regione di interesse, se possibile. Sequenziare il DNA purificato dal gel dal passaggio precedente per identificare le mutazioni puntiformi. Alta precisione nel sequenziamento fluorescente automatizzato Sanger potrebbe essere raggiunto fino a 700 bp.
    NOT: Il polimerasi Ex Taq (TaKaRa) può essere utilizzato per amplificare i prodotti PCR da modelli di DNA genomico fino a 20 kb di dimensioni.
  6. Analizzare le sequenze di DNA ottenute utilizzando l'A plasmid Editor (ApE, di M. Wayne Davis) o software simili allineandoli e confrontandoli con le sequenze ottenute a seguito del sequenziamento della stessa regione genomica di un ceppo di riferimento (ad esempio, originariamente mutagenizzato linea).
    1. Aprire i file di sequenziamento con ApE. Come riferimento, utilizzare un file ApE contenente la sequenza genomica di consenso del gene moccioso scaricato in un formato FASTA da Flybase, o un file contenente i risultati per la sequenza di controllo genetico del background (ad esempio, Drosophila originariamente mutagenizzata linea).
    2. Passare a Strumenti, quindi Allinea sequenze. Utilizzando il mouse del computer, selezionare tutte le sequenze da confrontare. Ricordarsi di indicare la sequenza di riferimento utilizzata per questo allineamento nel menu a discesa.
    3. Esaminare l'area in sequenza per le modifiche nucleotidiche rispetto alla sequenza di riferimento. Se lo si desidera, salvare l'allineamento sul computer in formato RTF facendo clic su Testo, quindi su Salva.
      NOT: Se non venissero identificate mutazioni, il protocollo di sequenziamento e analisi del DNA verrebbe ripetuto con i primer progettati per includere regioni non codificanti del gene.

7. Protocollo 6: Ulteriore analisi della funzione genica candidata

  1. Eseguire esperimenti di salvataggio nei neuroblasti per determinare se il brat genico è responsabile del fenotipo della neurodegenerazione.
    1. Doppio equilibrio di uno stock UAS-brat19 e di uno stesso worniu-Gal4 (wor-G4 ) specifico del neuroblast (wor-G4) che trasportano i costrutti sul terzo cromosoma, così come la linea 867, che è mutante per il brat gene situato sul secondo cromosoma m.
      1. Fare tre croci separate mettendo in tre diverse fiale contenenti cibo 5 maschi da UAS-Brat, wor-G4 e 867 linee e aggiungere ad ogni set di maschi 10-15 femmine vergine da una linea che trasporta marcatori e bilanciatori per il secondo e terzo cromosoma (Sp/CyO; Dr/Tm3,sb; BL_59967).
      2. Raccogliere 10-15 femmine vergini dalla F1 di ogni croce con i seguenti genotipi: UAS-brat/Tm3,sb, /CyO; wor-G4/Tm3,sb e 867/CyO;/Tm3,sb di ciascuno dei seguenti genotipi: UAS-brat/Tm3,sb, s/Sp; wor-G4/Tm3,sb e 867/CyO;
      3. Cross collelcted : /CyO; UAS-brat/Tm3,sb femmine vergini a s/Sp; UAS-brat/Tm3,maschi sb; in una fiala separata fare una seconda croce con s/CyO; wor-G4 /Tm3,sb femmine vergini a "/Sp; wor-G4/Tm3,sb maschi e poi in una terza fiala cross 867/CyO;/Tm3,sb femmine vergine e 867/CyO;
      4. Dalla F1 di ciascuna di queste croci, raccogliere sia maschi che femmine dei seguenti genotipi: Sp/CyO; UAS-brat/Tm3,sb dalla prima croce, Sp/CyO; wor-G4/Tm3,sb dalla seconda croce e 867/CyO; Dottor/Tm3, sb dalla seconda croce.
      5. Esegui un incrocio finale tra fratelli e sorelle raccolti da ogni progenie di F1 per stabilire azioni permanenti a doppio equilibrio per tutte e tre le linee.
    2. Combina UAS-brat e wor-G4 con la mutazione 867.
      1. Raccogliere un numero sufficiente (20-30 mosche) di femmine vergini dell'867/CyO; Dr/Tm3,sb doppia azione bilanciata per eseguire due croci.
      2. Mettere 10-15 femmine vergini con 5 maschi dell'Sp/CyO; UAS-brat/Tm3,sb (#1 incrociata) e in una seconda fiala 10-15 femmine vergine con 5 Dollari Sp/CyO; wor-G4/Tm3,sb maschi.
      3. Raccogliere fratelli e sorelle dalla F1 di ogni croce con i seguenti genotipi: 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb da cross #1 e 867/CyO;wor-G4/Tm3,sb da cross #2. Usa la progenie di F1 raccolta da ogni croce per stabilire scorte permanenti incrociando fratelli e sorelle tra di loro.
        NOT: A seguito di questa fase finale, le scorte per 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb e 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb deve essere generato.
    3. Eseguire l'esperimento di salvataggio.
      1. Raccogliere 15-20 femmine vergini dal 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb stock e attraversarli a 5-10 maschi dal magazzino 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb. Come controllo, attraversare le femmine vergini da 867-20 femmine dalla 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb e 15-20 femmine vergini dal 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb linea alla linea 867/CyO da solo.
        NOT: 867 mosche trasportano un allele sensibile alla temperatura di moccioso e la croce di salvataggio deve essere eseguita a 29 gradi centigradi.
      2. Raccogliere la seguente progenie F1 da ogni croce selezionando con attenzione i bilanciatori contrassegnati: 867/867; wor-G4/UAS-brat (salvataggio), 867/867; wor-G4 / (controllo) e 867/867; UAS-brat / (controllo).
      3. Età le mosche come desiderato a 29 gradi centigradi ed eseguire l'analisi istologica sul cervello per cercare la neurodegenerazione utilizzando il protocollo descritto nella Sezione 4 (Protocollo 3).
  2. Esegui analisi dipendenti dall'età della neurodegenerazione in 867 mutanti.
    1. Raccogliere 867;pcna-GFP e yw tramite moscerini di controllo, che trasportano un gene reporter (pcna-GFP) e sono vitali a 25 oC e mostrano sia una maggiore penetrazione che una maggiore espressività del fenotipo della neurodegenerazione rispetto a 867 da solo in questo temperatura17.
    2. Età delle mosche fino a 5, 15 e 25 come descritto nella Sezione 1.4 ed eseguire successive analisi istologiche seguendo il protocollo nella Sezione 4 (Protocollo 3).

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Risultati

In questo aertico, presentiamo i passi utilizzati per identificare il tumore del cervello genico (brat) come svolgere un ruolo nel mantenimento dell'integrità neuronale (ad esempio, neuroprotezione) nelle mosche adulte17; una metodologia che può essere utilizzata per identificare i geni coinvolti nella neuroprotezione. Abbiamo usato un approccio genetico in avanti (la strategia è delineata nella Figura 1A) per esamina...

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Discussione

Gli schermi genetici in avanti nella Drosophila sono stati un approccio efficace per identificare i geni coinvolti in diversi processi biologici, tra cui la neuroprotezione dipendente dall'età5,23,24, 25. Utilizzando questa strategia, siamo riusciti a identificare il moccioso come un nuovo gene neuroprotettivo17.

Un passaggio...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Siamo particolarmente grati al Dr. Barry Ganetzky, in chi è stato eseguito il laboratorio dello schermo genetico, permettendo l'identificazione e la caratterizzazione del marmocchio come gene neuroprotettivo. Ringraziamo il Dr. Steven Robinow per aver gentilmente fornito la raccolta di mosche ENU-mutagenized utilizzati nella schermata genetica presentata in questo articolo. Ringraziamo i membri del laboratorio Ganetzky, i dottori Grace Boekhoff-Falk e David Wassarman per le discussioni utili per tutta la durata di questo progetto, Ling Ling Ho e Bob Kreber per l'assistenza tecnica, il Dr. Aki Ikeda per l'uso della sua struttura microtoma presso il Dell'Università del Wisconsin e il Dr. Kim Lackey e lo Optical Analysis Facility presso l'Università dell'Alabama.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Attrezzatura principale
Cappa aspirante per istologia
Microscopio otticoNikonEclipe E100L'obiettivo preferito per l'imaging è il software di imaging 20x
Nikon
Microscopio FotocameraNikon
TermociclatoreEppendorf
Fly saggio di spinta e arrampicata
VWR® Fiala di Drosophila, strettaVWR75813-160
VWR® Nastro per etichettatura da laboratorio per uso genericoVWR89097-912
per mouse standard
StereoscopioMoticModello SMZ-168
Stazione per anestesia CO2 (pistola di soffiaggio, valvola di fondo, Ultimate Flypad)Genesee Scientific54-104, 59-121, 59-172 t iinclude Serbatoio CO2
Pennelli a punta fineSOLO HORTON BRUSHES, INC.
Drosophila IncubatriceVWR89510-750
Mappatura genetica
CantonSBloomington Drosophila Stock Center9517
w1118Bloomington Drosophila Stock Center5905
yw Bloomington Drosophila Stock Center6599
Drosophila linea utilizzata per la mappatura di ricombinazioneBloomington Drosophila Stock Center3227Genotipo: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3
CyO/sno[Sco] Bloomington Drosophila Stock Center2555Linea di bilanciamento Drosophila utilizzata per la mappatura della ricombinazione
Kit di carenza per cromosoma 2LBloomington Drosophila Stock CenterDK2LCook et al., 2012
Analisi istologica
Etanolo, (100%)Thermo Fischer ScientificA4094
CloroformioThermo Fischer ScientificC298-500
Acido Acetico GlacialeThermo Fischer ScientificA38-500
Fisherbrand™   Provette per microcentrifuga premium: 1,5 mLThermo Fischer Scientific05-408-129
Agente chiarificante Histochoice 1xVWR Life Sciences97060-934
Harris HematoxylinVWR95057-858
EosinVWR95057-848
Thermo Scientific™   Richard-Allan Scientifico&commercio; Mezzo di montaggioThermo Scientific™ 411222-110-610CyO/sna[Sco]
Unifrost Poly-L-Lysine vetrini per microscopio, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select PlusAzer Scientific
Fisherbrand™   Copertura Occhiali: Rettangoli Fisherbrand12-545MDimensioni: 24 mm x 60 mm
Timer tracciabileVWR
Slide WarmerBarnstead Internationalmodello n. 26025
Vassoio per vetrini e rackDWK Life SciencesRack per contenere 20 vetrini Fisherbrand
™   Pinze extra-lunghe per uso genericoFisherbrand10-316A
Kimwipes™Kimberly-Clark e commercio; Professionale 
Applicatori puritani da 6 pollici HardwoodProducts Company, Guilford, Maine807-12
VWR® Lamette da barbaVWR55411-050
Tupperware o contenitori in vetro per liquidi16 + 1 per acqua corrente
Lame per microtomo rivestite ad alto profiloVWR95057-834
Corning™   Secchiello per il ghiaccio rotondo con coperchio, 4 LCorning™
BecherO altro contenitore per acqua ghiacciata e cassette
Bagno tissutalePrecision Scientific Company66630
MicrotomoLeica Biosystems
Analisi molecolare
Wizard® SV Gel e PCR Clean-Up SystemPromegaA9282
Ex Taq DNA polimerasiTaKaRa5 U/μ l
Invitrogen&commercio;   SYBR&commercio; Sicuro&commercio; Colorazione in gel di DNA   Invitrogen&commercio;
UltraPure&commercio; Agarosio Invitrogen&commercio;
1 Kb Plus DNA Ladder  Invitrogen&commercio;
per l'editor di plasmidi ApE-ADisponibile per il download gratuito
Analisi statistica
Ulteriori analisi
y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1]Bloomington Drosophila Stock Center59967
Tappetino istologici Software strong>R

Riferimenti

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