Articolo metodologico

Sviluppo di popolazioni indotte di lesioni locali indotte dal targeting NEI genomi (TILLING) in colture di grano piccolo mediante mutagenesi metannata etilareale

DOI:

10.3791/59743

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16 luglio 2019

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1Department of Plant Science and Landscape Architecture, University of Maryland, College Park

In questo articolo

Sommario

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Descritto è un protocollo per lo sviluppo di una popolazione di lesioni locali indotte di targeting IN genomi (TILLING) in piccole colture di grano con l'uso di metanosofato etilico (EMS) come mutageno. È inoltre previsto un protocollo per il rilevamento delle mutazioni utilizzando il saggio Cel-1.

Abstract

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Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) è un potente strumento di genetica inversa che include la mutagenesi chimica e il rilevamento della variazione della sequenza nei geni bersaglio. TILLING è uno strumento di genomica funzionale di grande valore per la convalida genica, specialmente in piccoli grani in cui gli approcci basati sulla trasformazione hanno gravi limitazioni. Lo sviluppo di una solida popolazione mutagenizzata è fondamentale per determinare l'efficienza di uno studio sulla convalida genica basata su TILLING. Una popolazione TILLING con una bassa frequenza di mutazione complessiva indica che una popolazione impraticabile di grandi dimensioni deve essere sottoposta a screening per trovare le mutazioni desiderate, mentre un'elevata concentrazione di mutageni porta ad un'elevata mortalità nella popolazione, che porta a un'insufficiente numero di individui mutagenizzati. Una volta sviluppata una popolazione efficace, ci sono diversi modi per rilevare le mutazioni in un gene di interesse, e la scelta della piattaforma dipende dalla scala sperimentale e dalla disponibilità delle risorse. L'approccio basato sul gel Cel-1 e agarose per l'identificazione dei mutanti è conveniente, riproducibile e una piattaforma meno ad alta intensità di risorse. È vantaggioso in quanto è semplice, non richiede alcuna conoscenza computazionale, ed è particolarmente adatto per la convalida di un piccolo numero di geni con attrezzature di laboratorio di base. Nel presente articolo, descritti sono i metodi per lo sviluppo di una buona popolazione TILLING, compresa la preparazione della curva di dosaggio, la mutagenesi e il mantenimento della popolazione mutante, e lo screening della popolazione mutante utilizzando il saggio Cel-1 basato su PCR .

Introduzione

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Le mutazioni puntiformi nei genomi possono servire a molti scopi utili per i ricercatori. A seconda della loro natura e della loro posizione, queste mutazioni possono essere utilizzate per assegnare funzioni ai geni o anche a domini distinti di proteine di interesse. D'altra parte, come fonte di una nuova variazione genetica, possono essere selezionate mutazioni utili per i tratti desiderati utilizzando schermi fenotipizzazione e ulteriormente utilizzati nel miglioramento delle colture. TILLING è un potente strumento di genetica inversa che include la mutagenesi chimica e il rilevamento della variazione di sequenza nel gene bersaglio. Sviluppati per la prima volta in ....

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Protocollo

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1. Preparazione della curva di dosaggio per una mutagenesi efficace

  1. Immergere 100 semi con il genotipo di interesse in sei flaconi di vetro da 250 mL (100 in ogni flacone) contenenti 50 mL di acqua distillata. Agitare a 100 giri/min per 8 ore a temperatura ambiente (RT) per l'imbibizione dai semi.
  2. In un cofano di fumi, preparare una soluzione di 50 mL dello 0,4%, 0,6%, 0,8%, 1,0% e 1,2% (w/v) di metanoesonato (EMS) sciogliendo rispettivamente 0,167, 0,249, 0,331, 0,415 e 0,498 mL di EMS in acqua distillata.
    NOTA: EMS è liquido a RT con una densità di 1,206 g/mL.
    AVVISO: utilizzare adeguate dispositivi di protezione personale (PPE) durante la ....

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Risultati

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Figura 2 mostra la curva di dosaggio di cultivar di grano esaploide Jagger, grano diploide Triticum monococcum6e un donatore di genoma di grano Aegilops tauschii7. Le dosi di EMS per i tassi di sopravvivenza desiderati del 50% erano rispettivamente dello 0,25%, dello 0,6% e dello 0,7% per T. monococcum, Ae. tauschiie T. aestivum. La maggiore tolleranza EMS del grano e.......

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Discussione

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TILLING è uno strumento di genetica inversa molto prezioso per la convalida genica, in particolare per i cereali di piccole dimensioni in cui gli approcci basati sulla trasformazione presentano gravi colli di bottiglia11. Lo sviluppo di una popolazione mutagenizzata con un'alta frequenza di mutazione è uno dei passi critici nello svolgimento di studi genomici funzionali. Il passo più importante nello sviluppo di una popolazione TILLING robusta è quello di determinare la concentrazione ottimale di .......

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dall'USDA National Institute of Food and Agriculture, progetto Hatch 1016879 e Maryland Agricultural Experiment Station tramite MAES Grant N. 2956952.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
96 pozzetti 1,1 ml microprovette in microrackNational ScientificTN0946-08RPer la raccolta di tessuti fogliari
Agarosio I grado biotecnologicoVWR0710-500G
Biosprint 96 DNA Plant KitQiagen941558Kit per l'estrazione del DNA
Cel-1 endonucleasiEstratto come descritto da Till et al 2006Endonucleasi specifica a singolo filamento
Centrifuga 5430 REppendorf
EtilmetansolfonatoSigma AldrichM-0880-25GEMS, Mutageno chimico
Sistema di congelamento a secco/guscioLabconcoPer la liofilizzazione del tessuto fogliare
Sistema di purificazione Kingfisher FlexThermo fisher scientific5400610Robot di estrazione del DNA ad alta produttività
My Taq DNA PolimerasiBiolineBIO-21107
Acqua priva di nucleasiSigma aldrichW4502-1L
Sistema di imaging su gel NuGeniusSyngene
Orbit Environ-shakerLab-line
SPECTROstar NanoBMG LABTECHNano goccia per la quantificazione del DNA
T100 TermociclatoreBIO-RAD1861096

Riferimenti

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  1. McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeted screening for induced mutations. Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).
  2. Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. Targeted Recovery of Mutations in Drosophila. Genetics. 156 (3), 1169-1173 (2000).
  3. Tsai, H.,....

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Popolazione TILLINGmutagenesi EMSsaggio Cel 1curva di doserilevamento delle mutazioniestrazione del DNAamplificazione PCRelettroforesi su gel di agarosiogenomica funzionale

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