Generazione di fibrille preformate alfa-sinucleina da monomeri e uso in vivo

Sommario

L'obiettivo di questo articolo è quello di delineare i passi necessari per la generazione di fibrille da alfa-sinucleina monomerica, successivo controllo di qualità, e l'uso dei fibrili preformati in vivo.

Abstract

L'uso del modello in vivo di fibrille alfa-sinucleina preformato (α-SYN PFF) della sinucleinopatia sta guadagnando popolarità tra i ricercatori che mirano a modellare la sinucleinopatia della malattia di Parkinson e la degenerazione nigrostriatale. La standardizzazione della generazione di α-SYN PFF e dell'applicazione in vivo è critica al fine di garantire una patologia α-SYN consistente e robusta. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la generazione di fibrille da monomerica α-SYN, fasi di controllo della qualità post-fibrilization, e parametri suggeriti per l'iniezione neurochirurgica di successo di α-SYN PFFs in ratti o topi. A partire dall'α-SYN monomerica, la fibrilizzazione si verifica in un periodo di incubazione di 7 giorni, scuotendo in condizioni ottimali di buffer, concentrazione e temperatura. Il controllo della qualità post-fibrilizzazione è valutato dalla presenza di fibrille pellettiche attraverso il saggio di sedimentazione, la formazione di conformazione amiloide nelle fibrille con un saggio di tioflavina T, e la visualizzazione microscopica elettronica dei fibrili. Considerando che la convalida corretta utilizzando questi saggi è necessaria per il successo, non sono sufficienti a garantire che i PFFs seminino inclusioni α-SYN nei neuroni, in quanto tale attività di aggregazione di ciascun lotto PFF deve essere testata nella coltura cellulare o in coorti pilota di animali. Prima dell'uso, i PFFs devono essere sonicati in condizioni esattamente standardizzate, seguiti da un esame utilizzando la microscopia elettronica o la dispersione luminosa dinamica per confermare che le lunghezze di fibrille sono all'interno di una gamma di dimensioni ottimali, con una lunghezza media di 50 Nm. I PFFs possono quindi essere aggiunti ai supporti di coltura cellulare o utilizzati negli animali. La patologia rilevabile mediante immunocolorazione per l'α-SYN fosforilato (Psyn; serina 129) è apparente giorni o settimane dopo nei modelli di coltura cellulare e roditore, rispettivamente.

Introduzione

Il morbo di Parkinson (PD) è caratterizzato principalmente da due importanti caratteristiche patologiche: la patologia alfa-sinucleina (α-SYN) diffusa e progressiva e la degenerazione nigrostriatale. Dopo l'iniezione in topi o ratti di tipo wildtype, le fibrille α-SYN preformate (PFFs) inducono un progressivo accumulo di α-SYN patologico, che può comportare una degenerazione prolungata dei neuroni della dopamina di sostanza nigra pars compacta (SNpc) nel corso di molti mesi, così come i deficit sensomotoria^1,2,3,4,5,6. I neuroni sono esposti a α-SYN fibrils, sia tramite iniezione intracerebrale diretta o aggiunti ai media dei neuroni coltivati. Quando i pffs sono presi nei neuroni, i pffs agiscono per "seme" la formazione di inclusioni attraverso il templating, e l'accumulo di α-SYN endogeno in inclusioni fosforilate^1,7,^{8, 9}. il Inclusioni condividono proprietà simili a corpi di Lewy: contenenti α-SYN fosforilato a serina 129 (pSyn), ubiquitina, e P62; possedere strutture quaternarie amiloidi come mostrato con colorazione Tioflavina positiva; e sono resistenti alla proteinasi K digestione^{1,3,5,7,8,9,10,11, 12}. per la L'esposizione PFF conduce alla formazione di inclusione α-SYN in neuroni primari e alcuni immortalati nella cultura, così come topi, ratti e primati non umani in vivo^{1,2,3,4, 5,6,7,8,9,13}. È importante notare che i PFFs non porteranno alla formazione di inclusione α-SYN in tutti i modelli di coltura cellulare e alcuni neuroni coltivati saranno seme meglio di altri.

Un'altra caratteristica importante del modello in vivo α-SYN PFF è la distinta fase patologica sequenziale che emerge nel corso di diversi mesi. Nei roditori, a seguito di iniezione intrastriatale, la formazione di inclusione α-SYN generalmente picchi all'interno del SNpc e molte regioni corticali entro 1-2 mesi. Questo picco di aggregazione è seguito da degenerazione nigrostriatal ≈ 2-4 mesi più tardi^1,3,5. Queste distinte fasi patologiche forniscono ai ricercatori la piattaforma con cui studiare e sviluppare strategie che 1) diminuire l'aggregazione α-SYN, 2) chiare inclusioni α-SYN già formate, e/o 3) prevenire la successiva neurodegenerazione. Il modello PFF offre vantaggi e svantaggi distinti rispetto ai modelli iperespressivi α-SYN, transgenici e a vettori virali mediati da neurotossicant, come precedentemente esaminato⁶. La scelta del modello o dell'approccio da adottare dovrebbe essere determinata dal modello che meglio si adatta alla domanda che gli investigatori chiedono.

Anche se il modello PFF è stato utilizzato con successo da molti laboratori, ci sono ancora gruppi che hanno sperimentato incongruenze con la generazione di fibrille e producendo coerente α-SYN patologia¹⁴. Esempi di incongruenze variano da PFFs che producono poca o nessuna patologia α-SYN, batch per l'efficienza di semina batch, e anche il fallimento di fibrille da formare. Pertanto, la standardizzazione della generazione di α-SYN PFF e dell'applicazione in vivo è critica al fine di consentire interpretazioni accurate sull'impatto di nuovi interventi terapeutici. Il seguente protocollo delinea i passi necessari per la generazione di PFFs da monomeri α-SYN, il controllo di qualità in vitro dei PFFs una volta formati, la sonicazione e la misurazione di PFFs prima dell'uso, e suggerimenti per facilitare l'iniezione in vivo di successo di PFFs in ratti o topi.

Protocollo

Tutti i metodi che coinvolgono gli animali sono stati approvati dalla Michigan State University istituzionale di cura degli animali e l'uso Comitato (IACUC).

1. formazione di fibrille preformate α-sinucleina da monomeri (Figura 1)

1. Scongelare i monomeri α-sinucleina sul ghiaccio, Risospendere delicatamente scorrendo il tubo e centrifugare a 15.000 x g per 10 min a 4 ° c.
   Nota: il monomero α-SYN deve essere formulato specificatamente per la fibrilizzazione. I monomeri ricombinanti possono essere acquistati da fonti commerciali o generati da protocolli sul sito^4,9,14,15. Se acquistati da fonti commerciali, il prodotto deve dichiarare che il monomero α-SYN è specificamente per la generazione di fibrille. Indipendentemente dal fatto che i monomeri siano acquistati o generati in loco, le fasi di controllo della qualità delineate di seguito devono essere eseguite con ogni lotto per garantire che le fibrille si siano formate e che le sementi siano in modo efficiente prima dell'uso negli esperimenti.
2. Trasferire il supernatante su una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 mL e registrare la quantità trasferita.
   Nota: fare attenzione ad evitare il pellet, che, se presente, sarà piccolo.
3. Misurare la concentrazione proteica del supernatante trasferito mediante un saggio di acido bicinchoninico standard (BCA) o misurando l'assorbanza a 280 Nm con uno spettrofotometro a per microvolumi.
   Nota: il saggio BCA non è accurato per la misura specifica di α-SYN e può produrre risultati sopravvalutando la concentrazione proteica. Di conseguenza, misurare l'assorbanza a 280 Nm è il metodo consigliato per determinare la concentrazione proteica.
   1. Per misurare con il saggio BCA, seguire i protocolli BCA standard ed eseguire con tre diverse diluizioni di α-SYN monomero. Le diluizioni suggerite sono 1:25, 1:50 e 1:100.
   2. Per misurare con il metodo A280, svuota il lettore con sterile 1 soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco (dPBS) senza calcio e magnesio, con una concentrazione di sale di circa 100 mM di NaCl, e la gamma di pH 7.0-7.3 (tabella dei materiali).
   3. Aggiungere 2 μL di campione al lettore e leggere l'assorbanza a 280 Nm.
   4. Utilizzare la legge di birra-Lambert per determinare la concentrazione dei monomeri.
      
      Nota: il coefficiente di estinzione ε per l'α-SYN umano è 5.960 M^-1cm^-1 e per il topo α-SYN è 7.450 m¹cm^-1. La lunghezza del percorso è misurata in cm. il peso molecolare di α-SYN (14 kDa) è stimato assumendo 1 da = 1 g/mol.
4. Diluire i monomeri con 1x dPBS ad una concentrazione finale di 5 mg/mL. Utilizzare l'equazione riportata di seguito per calcolare la quantità di 1x dPBS aggiunto per diluire i monomeri.
   
   Nota: tutte le concentrazioni sono in mg/mL e i volumi in μL. le diluizioni di monomero devono essere eseguite con 1x dPBS. Il volume totale utilizzato per generare fibrille deve essere compreso tra 100 e 500 μL per ottenere risultati di fibrilizzazione riproducibili.
5. Agitare brevemente il Vortex per mescolare e centrifugare per raccogliere tutto il liquido nella parte inferiore del tubo. Monomeri di aliquot per il confronto di controllo qualità con fibrille come indicato nei passaggi 1.8.1-1.8.4.
6. Utilizzare una serratura a tubo o una pellicola di cera/plastica (tabella dei materiali) per fissare il coperchio del tubo della microcentrifuga chiuso.
7. Posizionare il tubo in un termomiscelatore orbitale con un coperchio per 7 giorni a 37 ° c, scuotendo a 1.000 RPM (tabella dei materiali).
   Nota: alla fine dei 7 giorni, il contenuto del tubo dovrebbe apparire torbido. Il termomiscelatore deve avere un coperchio per evitare la formazione di condensa sui coperchi dei tubi.
8. Far scorrere delicatamente il tubo per risospendere i fibrili α-SYN. Le fibrille aliquot per le seguenti fasi di controllo di qualità come indicato nei passaggi 1.8.1-1.8.4.
   Nota: le fibrille per le fasi di controllo della qualità possono essere memorizzate in RT durante la notte.
   1. Aliquota 6 μL per il saggio di sedimentazione.
   2. Aliquota 5 μL per il saggio legante Tioflavina T.
   3. Aliquota 2 μL per la microscopia elettronica di trasmissione per la visualizzazione del fibrille.
   4. Aliquota di almeno 10 μL per il saggio di endotossina.
      Nota: per il saggio di endotossina, viene utilizzato un Limulus amebocyte lysate (LAL) commerciale, seguendo le istruzioni del produttore (tabella dei materiali). I livelli di endotossina devono essere ≤ 0,5 unità di endotossina/mL per i fibrili. Se questo criterio non è soddisfatto, è possibile utilizzare un kit di rimozione di endotossina.
9. Aliquota le restanti fibrille e conservare. Per la conservazione a lungo termine (12-18 mesi), congelare rapidamente il ghiaccio secco e conservare a-80 ° c.
   Nota: l'ammontare dell'aliquota dipende dall'applicazione a valle desiderata. L'uso in vivo richiede in genere più fibrille a concentrazioni più elevate rispetto all'uso in vitro, e i volumi di aliquota dovrebbero essere pianificati di conseguenza. I fibrili devono essere conservati verso la parte posteriore del congelatore per evitare danni causati da congelamento/scongelamento potenziale. Il protocollo può essere messo in pausa qui.

2. saggio di sedimentazione

1. In una provetta per microcentrifuga pulita, aggiungere 6 μL di PFF a 54 μL di dPBS per diluire le fibrille 1:10 e il Pipet da miscelare.
   1. In un tubo separato, aggiungere 6 μL di monomero a 54 μL di dPBS come ulteriore controllo.
2. Centrifugare campioni a 10.000 x g per 30 minuti a RT e trasferire il supernatante ad una provetta per microcentrifuga pulita.
3. Aggiungere 60 μL di dPBS al pellet rimanente e al vortice per risospendere.
4. Aggiungere 30 μL di tampone di campionamento 3x (140 μL di 50% di glicerolo/0,1% di blu di bromopfenolo, 40 μL di SDS 10% e 20 μL di β-mercaptoetanolo) a ciascun tubo e Vortex da miscelare.
5. Incubare i campioni a 100 ° c per 10 minuti e lasciar raffreddare per 5 minuti sul ghiaccio.
6. Utilizzare un protocollo standard di sodio dodecil solfato-poliacrilammide gel elettroforesi (SDS-PAGE) per separare le proteine in massa. Utilizzare una scala proteica con una gamma che include 14 kDa (la fascia di dimensioni previsto per monomerica α-SYN).
7. Trasferire il gel in un piatto di colorazione e coprire il gel con macchia blu Coomassie (0,1% Coomassie blu brillante, 20% metanolo in volume, e 10% acido acetico in volume in ddH₂O). Incubare per 3 ore a RT mentre trema.
8. Versare la macchia blu di Coomassie e aggiungere abbastanza decolorazione (50% metanolo in volume, e 10% acido acetico in volume in ddH₂O) per coprire il gel. Incubare per 30 minuti a RT mentre trema.
9. Versare la decolorazione e ripetere la fase di decolorazione fino a quando il gel è limpido e le bande sono visibili.
10. Lavare il gel 3 volte per 5 min ciascuno scuotendo in ddH₂o e l'immagine del gel.

3. microscopia elettronica di trasmissione per la visualizzazione del fibrille

1. Pesare 20 mg di acetato di uranile in una provetta da microcentrifuga e aggiungere 1 ml di DDH₂O per effettuare una soluzione acquosa al 2%. Vortex fino a quando l'acetato di uranile è in soluzione, e lasciare riposare durante la notte.
   Nota: Uranyl acetato deve essere fatto il giorno prima di preparare i campioni per la microscopia elettronica di trasmissione. L'esposizione alla luce o all'agitazione può causare il precipitato dell'acetato di uranile, in quanto tale, il tubo contenente la soluzione di acetato di uranile deve essere ricoperto in foglio di alluminio, conservato in un luogo buio e non scosso dopo che l'acetato di uranile è in soluzione.
2. Aggiungere 2 μL di PFF a 98 μL di dPBS per diluire le fibrille 1:50 e poi la miscela.
3. Preparare una pellicola di cera/plastica pulita (tabella dei materiali) superficie coperta (circa 50 mm x 50 mm) sulla parte superiore del banco. Sulla pellicola di cera/plastica pulita (tabella dei materiali), aggiungere quanto segue (Figura 2).
   1. Aggiungere 4 x 10 μL di gocce di ddH₂O.
   2. Aggiungere 1 x 10 μL di goccia di fibrille diluite o campione di monomero.
   3. Aggiungere 2 x 10 μl di gocce di 2% acetato di uranile.
4. Utilizzare pinze a punta fine per raccogliere un Formvar/carbonio rivestito, rete di microscopia elettronica di trasmissione in rame mesh (tabella dei materiali).
   Nota: assicurarsi di prendere la griglia solo per il bordo, evitando la porzione di mesh al centro (Figura 2a). Se le pinze toccano la mesh, la pellicola Formvar/rivestita in carbonio sarà danneggiata, rendendo impossibile l'imaging in quella zona della griglia.
5. Galleggiare la griglia Formvar/lato rivestito di carbonio (lato lucido) verso il basso sulla prima goccia di ddH₂o. utilizzare delicatamente le pinze per tenere la griglia e spingere verso il basso per garantire che l'intera superficie rivestita sia in contatto con il DDH₂o. Lasciate che la griglia galleggiare per 1 min.
6. Raccogliere la griglia, e senza toccare la parte mesh della griglia, stoppino via il ddH₂O con carta da filtro.
7. Galleggiare la griglia come sopra sulla seconda goccia di ddH₂o per 1 min e stoppino via il DDH₂o.
8. Galleggiare la griglia sulla goccia di fibrille diluite per 1 min e stoppino via l'eccesso come sopra.
9. Galleggiare la griglia sulla prima goccia di acetato di uranile per 1 min e stoppino via l'eccesso.
10. Galleggiare la griglia sulla seconda goccia di acetato di uranile per 1 min, stoppino via l'eccesso.
11. Galleggiare la griglia come sopra sulla terza goccia di ddH₂o brevemente e stoppino via il DDH₂o.
12. Galleggiare la griglia come sopra sulla quarta goccia di ddH₂o brevemente e stoppino via il DDH₂o, essere sicuri di rimuovere il più DDH₂o come possibile.
13. Trasferire in una casella di griglia per lo stoccaggio fino a Imaging.
    Nota: le griglie devono asciugare per almeno 5 minuti prima dell'imaging. Le griglie possono essere iminvecchiate per almeno un anno dopo la preparazione e devono essere conservate in un ambiente asciutto.

4. saggio di tioflavina T

1. In una provetta per microcentrifuga pulita, aggiungere 5 μL di PFF a 245 μL di dPBS per diluire le fibrille 1:50 e il Pipet da miscelare.
2. Aggiungere 250 μL di dPBS a un tubo di microcentrifuga separato per fungere da controllo negativo.
3. Aggiungere 5 μL di monomero a 245 μL di dPBS per fungere da controllo monomero.
4. Aggiungere 250 μL di tioflavina T nel tampone glicina (25 μM di tioflavina T, 100 mM di glicina, 1% Triton X-100, pH 8,5) ad ogni campione e mescolare delicatamente.
5. Pipet 2 replica, 200 μL ciascuno, in una piastra di pozzo 96 nero. Tenere la piastra al buio per evitare il Fotobleaching.
6. Incubare per 1 h a RT e leggere la piastra utilizzando un'eccitazione di 450 nm e un'emissione di 510 nm.
   Nota: le letture di tioflavina T fluttuano nel tempo. I campioni devono essere letti allo stesso tempo di incubazione. Se lo si desidera, è possibile prendere più letture durante l'incubazione delle ore e tracciate nel tempo.

5. sonicazione di fibrille preformate α-sinucleina

Attenzione: il sonicatore e tutte le fasi sonicazione sono eseguite in un cappuccio di cultura per evitare l'esposizione a fibrille che possono nebulizzato durante sonicazione. Il personale che esegue le fasi di sonicazione dovrebbe indossare dispositivi di protezione individuale, compresi i guanti, protezione abbigliamento sotto forma di un cappotto di laboratorio, e uno scudo facciale mentre sonicating. Il rischio di esposizione a fibrille può essere ridotto da sonicazione con un sonicatore di tromba della tazza, permettendo al tubo contenente fibrille di rimanere chiusi durante sonicazione.

Nota: i parametri di sonicazione ottimali di fibrille dipendono dal modello di sonicatore utilizzato. Per questo motivo, è necessario eseguire alcune ottimizzazioni per garantire che le fibrille siano le dimensioni corrette. Il sonicatore utilizzato può essere trovato nella tabella dei materiali e i parametri delineati si basano sui risultati precedenti con questo modello di sonicatore. I parametri riportati di seguito funzioneranno per 2-4 μg/μL di PFFs in 200-400 μL di soluzione. Sonicazione di prova con lo strumento deve essere eseguita e fibrille analizzati per garantire i risultati desiderati sono raggiunti prima dell'uso di pffs negli esperimenti.

1. Collegare una sonda di diametro 3,2 mm (tabella dei materiali) al convertitore e impostare i parametri sonicatore come indicato di seguito nel passaggio 5.1.1-5.1.3.
   1. Impostare l'ampiezza al 30%.
   2. Impostare l'impulso a 01 01 (1 s su; 1 s spento).
   3. Impostare l'ora su 0:01:00.
      Nota: 1 min di pulsare equivale a 60 impulsi, e questo modello di sonicatore (tabella dei materiali) si arresta automaticamente. Con altri modelli sonicatore, il numero di impulsi dovrà essere conteggiato.
2. Scongelare le fibrille a RT e diluire con dPBS sterili in una cappa di coltura.
   Nota: un tubo di microcentrifuga 0,6 mL chiaro funziona meglio per sonicazione e la concentrazione finale di fibrille dipende dall'uso previsto. I risultati rappresentativi mostrati sono da una concentrazione finale di fibrille di 4 μg/μL.
3. Pulire la sonda del sonicatore con un tessuto di laboratorio inumidito con 70% di etanolo per pulire la sonda. Immergere la punta della sonda in ddH₂o e pulsare 10 volte per pulire ulteriormente la sonda, quindi asciugare con un tessuto di laboratorio.
4. Posizionare la punta della sonda nel tubo di fibrille diluite e posizionare la punta nella parte inferiore del tubo.
5. Sonicare per 60 impulsi (1 s su; 1 s spento). Spostare la sonda su e giù durante ogni impulso per assicurare che tutte le fibrille nel liquido siano sonicate. e pulito.
6. Dopo 60 impulsi, rimuovere la sonda dai PFFs e aggiungere 2 μL di PFF a 98 μL di dPBS in un tubo di microcentrifuga pulito per diluire le fibrille 1:50 per la misurazione sonicata di fibrille mediante microscopia elettronica.
   Nota: idealmente, un piccolo sottoinsieme di fibrille deve essere misurato prima dell'iniezione in vivo e una misurazione più completa delle fibrille eseguite quando il tempo lo permette.
7. Dopo sonicazione, centrifugare brevemente PFFs per 1 s a 2.000 x g per raccogliere tutto il liquido fuori i lati del tubo.
   Attenzione: se il tubo diventa caldo al tatto, smettere di Sonicare dopo 30 impulsi, attendere 1 min e Sonicare per gli ultimi 30 impulsi.
   Nota: mentre sonicating, mantenere la punta della sonda verso la parte inferiore del liquido all'inizio di ogni impulso, troppo vicino alla parte superiore del liquido causerà la perdita del campione.
8. Immergere la punta della sonda in 1% SDS e pulsare 10 volte per pulire la sonda. Rimuovere la punta dalla SDS, immergere in ddH₂o e impulso 10 volte.
9. Pulire la sonda con un tessuto di laboratorio inumidito con 70% di etanolo, quindi pulire la sonda con un tessuto di laboratorio asciutto. Staccare la sonda dal convertitore e conservare.
10. Pulire tutte le superfici nella cappa con 1% SDS, seguita da 70% etanolo.
    Nota: la soluzione SDS 1% viene utilizzata per dissociare fibrille e superfici pulite e attrezzature¹⁶.

6. microscopia elettronica di trasmissione per la misurazione di fibrille sonicate

Nota: se la microscopia elettronica non è fattibile, un saggio di tioflavina T cinetica e la dispersione luminosa dinamica possono essere utilizzati come misure indirette di efficienza di semina e dimensione del fibrille^4,14.

1. Preparare i campioni utilizzando il protocollo della sezione "microscopia elettronica per visualizzazione fibrille" riportata sopra.
2. Utilizzare un microscopio elettronico a trasmissione per scattare un'immagine di fibrille da 6 a 10 diverse aperture della griglia.
   Nota: le immagini devono avere un ingrandimento sufficientemente alto per misurare le fibrille, ma abbastanza basse da visualizzare simultaneamente più fibrille. Un ingrandimento finale di circa 75, 000x dovrebbe essere sufficiente.
3. Misurare la lunghezza di un piccolo sottoinsieme di almeno 25 fibrille prima di utilizzare fibrille in un esperimento.
   Nota: queste misurazioni possono in genere essere eseguite utilizzando il software di imaging associato al microscopio. Per la validazione rapida, la persona che misura deve selezionare fibrille rappresentative e calcolare la dimensione media. Lunghezza fibril dovrebbe media intorno 50 Nm o meno, con una misura più accurata da seguire.
4. Misurare le lunghezze di 500 + fibrille per risultati più completi.
   Nota: il software di imaging associato al microscopio può essere utilizzato per le misurazioni di fibrille. In alternativa, le immagini possono essere aperte e fibrille misurate con software di elaborazione delle immagini, utilizzando la barra di scala associata ad ogni immagine come riferimento di dimensione con cui confrontare le lunghezze di fibrille.

7. preparazione di siringhe di aghi di vetro personalizzate per iniezioni stereotassiche (Figura 3)

1. Aggiungere circa 10 mL di reagente siliconizzante (tabella dei materiali) a un becher pulito da 50 ml.
2. Posizionare i tubi capillari di vetro (lunghezza 54 mm; diametro esterno: 0,86 mm; diametro interno 0,59 mm) verticalmente nel bicchiere di reagente siliconizzante e consentire l'azione capillare per aspirare il reagente siliconizzante fino al tubo attraverso l'apertura del tubo inferiore sommersa nel reagente siliconizzante.
3. Pipet ulteriore reagente siliconizzante nell'apertura del tubo superiore che non è immerso in reagente siliconizzante per riempire completamente il tubo capillare di vetro.
4. Rimuovere i tubi capillari dal reagente siliconizzante e asciugare le estremità aperte dei tubi su un tovagliolo di carta per rimuovere il reagente siliconizzante nei tubi. Lasciare asciugare i tubi capillari per almeno 8 ore.
5. Posizionare un tubo capillare in vetro siliconato in un estrattore di aghi di vetro (tabella dei materiali).
6. Accendere l'elemento riscaldante e consentire ai pesi collegati di allungare il tubo capillare di vetro riscaldato.
7. Tagliare il tubo capillare di vetro tirato con le forbici nel punto più sottile al centro e rimuovere l'ago di vetro dal Puller dell'ago di vetro.
   Nota: il diametro interno ed esterno dell'ago tirato deve essere approssimativamente di 80 e 100 μm, rispettivamente. Più aghi di vetro possono essere fatti in una sola volta e conservati fino a quando sono pronti per attaccare a una siringa di vetro con ago metallico attaccato (tabella dei materiali).
8. Tagliare una lunghezza del tubo termoretraibile (diametro interno medio 0,021 "e spessore medio della parete 0,001") a circa 40 mm con le forbici. Far scorrere l'involucro termoretraibile sull'ago metallico di una siringa smussata da 10 μL (tabella dei materiali).
9. Utilizzare una fiamma aperta per riscaldare e aderire l'involucro termoretraibile all'ago mentre si ruota l'ago per applicare il calore uniformemente.
10. Far scorrere accuratamente l'estremità più grande dell'ago di vetro tirato sopra l'ago metallico della siringa.
11. Tagliare una lunghezza del tubo termoretraibile (diametro interno medio 0,036 "e spessore medio della parete 0,005") a circa 40 mm con le forbici e scivolare con cautela sopra l'ago di vetro per sovrapporre la base dell'ago di vetro e l'ago metallico della siringa (tabella di Materiali). Utilizzare una fiamma aperta per riscaldare l'involucro termoretraibile per fissare l'ago di vetro all'ago metallico.
12. Aggiungere un ulteriore strato di involucro termoretraibile per fissare l'ago di vetro. Tagliare una lunghezza del tubo termoretraibile (diametro interno medio 0,044 "e spessore medio della parete 0,005") a circa 40 mm con le forbici e scivolare con cautela sopra l'ago di vetro per sovrapporre la base dell'ago di vetro e l'ago metallico della siringa (tabella di Materiali). Utilizzare una fiamma aperta per riscaldare l'involucro termoretraibile per fissare l'ago di vetro all'ago metallico.
13. Tagliare l'ago di vetro con le forbici in modo che la punta sia lunga circa 8 mm.
    Nota: l'ago deve essere abbastanza lungo da colpire le regioni cerebrali desiderate (la lunghezza richiesta dipende dalle coordinate dorsali/ventrale).
14. Utilizzare i passaggi 7.14.1-7.14.3 per testare l'ago per assicurare che non vi siano perdite e che vi sia un flusso adeguato sia nel prelievo che nell'erogazione del liquido dall'ago di vetro.
    1. Riempire una siringa da 1 mL con un ago da 26 gauge attaccato con dH₂O.
    2. Rimuovere lo stantuffo metallico dalla siringa con ago di vetro personalizzato e inserire l'ago della siringa preriempita dH₂O nella base della siringa. Applicare la pressione per erogare dH₂O dall'ago di vetro. Ispezionare l'interfaccia dell'ago di vetro e l'ago metallico per le perdite e confermare un flusso dH₂O costante.
       Nota: se necessario, l'ago di vetro può essere tagliato per aumentare la facilità di flusso e ulteriori strati di shrink-wrap aggiunto per patch eventuali perdite dalla base dell'ago di vetro.
    3. Riempire una provetta per microcentrifuga con dH₂o. usare la siringa per aghi di vetro personalizzata per aspirare₂o. Ispezionare l'ago per confermare che il liquido viene preso nella siringa e che non ci sono bolle.
       Nota: se ci sono bolle o dH₂o non viene aspirata nell'ago, il taglio dell'ago può aiutare ad alleviare la pressione.
15. Conservare accuratamente la siringa con gli aghi di vetro attaccati nelle scatole della siringa fino a quando necessario per interventi chirurgici.
16. Utilizzare metodi di chirurgia stereotassica standard per la consegna intrastriatale di PFFs a coordinate ottimizzate nei topi (un sito: AP + 0,2 mm e ML + 2,0 mm da bregma, DV-2,6 mm da dura) o in ratti (due siti: AP + 1,6 mm e ML + 2,0 mm da bregma, DV-4,0 da dura; AP + 0,1 mm e ml + 4,2 mm da bregma, DV-5,0 da dura)^1,14,17.
    Nota: queste coordinate sono state utilizzate nei topi C57BL6/C3H e nei ratti Fischer 344. Quando si utilizzano altri ceppi, le coordinate devono essere ottimizzate.

Risultati

La generazione di fibrille da monomeri α-SYN inizia con la determinazione della concentrazione dei monomeri. Sia il saggio BCA che la misura dell'assorbanza a 280 Nm (A280) possono essere utilizzati per misurare il contenuto proteico; i risultati del saggio BCA, tuttavia, suggerivano una concentrazione più elevata rispetto al metodo A280. I PFFs derivati dal topo α-SYN monomero avevano un valore BCA di 14,05 ± 0,22 e un A280 di 8,05 ± 0,03 μg/μL (Figura 1). Analogamente, anche i PFFs derivati dall'α-SYN monomero umano sembravano essere ad una concentrazione più elevata, con un valore BCA di 12,95 ± 0,38 e un A280 di 7,83 ± 0,05 μg/μL (Figura 1). Le misurazioni A280 sono specifiche per α-SYN in base all'inclusione dei coefficienti di estinzione e questi risultati sono stati utilizzati per diluire i monomeri prima dell'incubazione di 7 giorni.

Prima dell'incubazione, il liquido contenente i monomeri α-SYN era chiaro, ma dovrebbe apparire torbido dopo la formazione di fibrille. L'esame con la microscopia elettronica di trasmissione ha confermato la presenza di fibrille lunghe, misurando 10-20 Nm di larghezza (Figura 4). In confronto, i monomeri α-SYN erano appena visibili senza apparente forma visibile (Figura 4). Con la conferma visiva delle strutture fibrillari, la conviazione amiloide delle fibrille è la successiva caratteristica di PFFs che dovrebbe essere confermata utilizzando un saggio Tioflavina T. Thioflavin T presenta una maggiore fluorescenza quando si legano all'amiloide; Pertanto, un aumento del segnale fluorescente dai campioni indica la presenza di amiloide. Ad esempio, la Tioflavina nei dPBS ha prodotto un segnale di 3.287 ± 580 unità fluorescenti relative (RFU), il topo α-SYN monomero ha prodotto un segnale di 4.174 ± 158 RFU e i PFFs del mouse hanno prodotto un segnale di 59.754 ± 6.224 RFU (Figura 5). In confronto, l'α-SYN monomero umano ha prodotto un segnale simile di 4.158 ± 105 RFU al monomero del topo, e gli PFFs umani hanno prodotto un segnale più alto di 1.235.967 ± 113.747 RFU rispetto ai PFFs del mouse (Figura 5). Per valutare la presenza di fibrille pelletable, è stato eseguito un saggio di sedimentazione. I fibrili si pellet con centrifugazione. Sia nel topo che nel campione umano PFF, la frazione supernatante deve avere più proteine nel pellet rispetto al surnatante (Figura 6). Al contrario, la maggior parte della proteina del topo e dei monomeri umani era presente nel surnatante, con poco presente nel pellet (Figura 6). Con i PFFs visibilmente presenti mediante microscopia elettronica, strutture amiloidi presenti e pelletable in fibrille, i PFFs hanno superato tutte le fasi di controllo della qualità in vitro.

Sia il topo sia i pffs umani sono stati sonicati per produrre pffs di lunghezze appropriate per la semina di inclusioni α-SYN^4,18. I PFFs sono stati diluiti alla concentrazione desiderata di 4 μg/μL e sonicato. Immediatamente prima dell'intervento chirurgico, 25 fibrille rappresentative sono stati iminvecchiati da microscopia elettronica e misurato per individuare controllare la dimensione del fibrille. Il mouse sonicato PFFs misurato 48,8 ± 3,1 Nm, mentre i PFFs umani misurato 52,1 ± 4,4 Nm di lunghezza; I PFFs di entrambe le specie erano quindi la lunghezza appropriata (50 Nm o inferiore) per indurre l'attività di semina. L'esame più completo di circa 500 fibrille ha rivelato la lunghezza media e la distribuzione della lunghezza dei fibrili del topo sonicato. La lunghezza media è stata 44,4 ± 0,6 Nm, con il 86,6% dei PFFs che misurano 60 Nm o meno (Figura 4). In confronto, i PFFs umani hanno una media di 55,9 ± 1,1 Nm con il 69,6% dei PFFs di dimensioni pari o inferiori a 60 Nm (Figura 4).

Dopo l'iniezione intrastriatale di pffs di topo sonicato in ratti come descritto in precedenza^3,5, una serie di sezioni tissutali sono stati elaborati a 2 mesi dopo l'intervento chirurgico, quando il numero di inclusione contenente i neuroni è noto al picco in SNpc, per la conferma delle inclusioni α-SYN fosforilate⁵. L'inclusione dei neuroni cuscinetto, come indicato dalla colorazione immunoistochimica per Psyn (anticorpo nella tabella dei materiali) sono presenti all'interno del SNPC (Figura 7), così come altre regioni in tutto il cervello che innervano lo striato (anteriore nucleo olfattiva, motore, cingolare, piriforme, prelimbic, somatosensoriale, entorhinal, e cortices insulari, Amygdala, striatum)^1,3,4,5,19. Queste inclusioni condividono proprietà simili con corpi di Lewy, come l'associazione di tioflavina S, e la resistenza del totale α-SYN a proteinasi K (Figura 7), come mostrato dalla colorazione immunoistochimica (anticorpo e proteinasi k nella tabella dei materiali) . La conferma della semina all'interno del cervello indica che il controllo di qualità in vivo è stato superato, e le aliquote di PFFs precedentemente congelate e salvate dallo stesso lotto possono essere sonicate sotto parametri identici, con lunghezze convalidate, in esperimenti più grandi.

Figura 1 . Metodi per la generazione di fibrille α-SYN. Schema dei passaggi necessari per produrre fibrille da monomeri α-SYN. I monomeri vengono centrifugati per 10 minuti (15.000 x g, a 4 ° c). Il supernatante viene trasferito in un tubo pulito e la concentrazione proteica è determinata dall'assorbanza a 280 nm o da un saggio BCA. Il grafico mostra le concentrazioni dei monomeri α-SYN umani e del topo. Le colonne indicano il significato del gruppo, le barre di errore rappresentano ± 1 errore standard della media. Dopo aver determinato la concentrazione proteica, i monomeri α-SYN vengono diluiti, brevemente vortexati e incubati per 37 ° c per 7 giorni, mentre scuotono su un mixer orbitale impostato a 1.000 RPM. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figura 2 . Metodi di colorazione per la microscopia elettronica di trasmissione. Diagramma di colorazione negativa per microscopia elettronica. A) immagini raffiguranti griglie di campioni di microscopia elettronica. La griglia ha un lato opaco o leggero e un lato lucido o scuro. Il lato lucido/scuro è rivestito con un film di supporto Formvar/carbonio. B) illustrazione della procedura di colorazione. La griglia è galleggiata lucido/lato scuro verso il basso sulla prima goccia di ddH₂O per 1 min e l'eccesso è malvagio via con carta da filtro. Il processo viene ripetuto con la seconda goccia di DDH₂o, pffs diluiti o monomeri, due gocce di acetato di uranile e due gocce aggiuntive di DDH₂o. griglie possono essere memorizzate in una scatola di griglia fino a quando non è stato immaturato. Barra di scala = 3 mm. fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 . Assemblaggio di siringhe di aghi di vetro personalizzate. Diagramma dei passi necessari per assemblare le siringhe allegate di vetro. I tubi capillari in vetro siliconato vengono tirati e tagliati al centro per produrre aghi di vetro. Il tubo termoretraibile viene utilizzato per preparare l'ago metallico e formare una guarnizione interna quando l'ago di vetro viene scivato sull'ago metallico. Due strati aggiuntivi di tubo termoretraibile che si sovrappongono alla base dell'ago di vetro e l'ago metallico vengono aggiunti consecutivamente e il calore applicato per fissare l'ago di vetro e formare una guarnizione a tenuta d'acqua. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figura 4 . Visualizzazione di monomeri α-SYN e fibrille α-SYN tramite microscopia elettronica di trasmissione. Micrografi rappresentativi di monomeri α-SYN e fibrille. Top pannelli: topo e umano α-SYN monomero. Pannelli centrali: mouse a lunghezza intera e PFFs α-SYN umano. pannelli inferiori: mouse e umani α-SYN PFFs dopo sonicazione. Grafico in basso: distribuzione di mouse sonicato e lunghezze di PFF umano α-SYN. Barra di scala = 500 Nm. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figura 5 . Conferma delle strutture amiloidi con il saggio Tioflavina T. Misurazione del segnale fluorescente da topi e campioni umani α-SYN monomeri e PFF. A sinistra: i risultati dei monomeri α-SYN del mouse e dei PFFs α-SYN. A destra: i risultati dei monomeri α-SYN umani e dei PFFs α-SYN. In ogni grafico viene visualizzato un controllo negativo dPBS. Tutte le misurazioni sono espresse come unità fluorescenti relative (RFU). Le colonne indicano il significato del gruppo, le barre di errore rappresentano ± 1 errore standard della media. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figura 6 . Saggio di sedimentazione per le immagini pelletable α-SYN. di Coomassie colorati. Le bande mostrate sono a circa 14 kDa in base alla scala proteica. A sinistra: topo monomero e PFFs. A destra: monomeri umani e PFFs. Per tutti i campioni di monomero e PFF, vengono mostrati il pellet (P) e il surnatante (S) risospesi. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figura 7 . Caratteristiche delle inclusioni nel modello del ratto che confermano la patologia α-SYN. Micrografi rappresentativi della sostanza nigra pars compacta a 2 mesi dopo l'iniezione. A sinistra: neuroni contenenti Psyn e controcolorati con violetto cresolo Violet. Medio: i neuroni positivi di thioflavin S. A destra: inclusioni α-SYN-contenenti resistenti alla proteinasi K. barra di scala = 50 μm. fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Discussione

La produzione di PFFs α-SYN in grado di seminare i neuroni e portare a inclusioni simili al corpo di Lewy dipende da molteplici fattori e passaggi. Un fattore critico è che i monomeri utilizzati per la generazione di fibrille devono essere specificamente formulati per la fibrilizzazione^4,9,14,15. Se i monomeri non sono formulati per la fibrilizzazione, le fibrille non possono formarsi o le fibrille che si formano non possono produrre una patologia α-SYN. Analogamente, il tampone che i monomeri influenzano anche la fibrilizzazione. Come tale, per i migliori risultati, la concentrazione di sale dovrebbe essere di circa 100 mM di NaCl e pH tra 7,0 e 7,3. Un primo passo che introduce la variabilità è il metodo con cui viene determinato il contenuto proteico iniziale, con la misurazione a A280 che può produrre risultati più accurati e quindi è il metodo preferito. La discrepanza nella concentrazione proteica può diminuire l'efficacia del processo di fibrilizzazione, così come alterare la concentrazione presunta del PFF utilizzata negli esperimenti. Entrambi potrebbero comportare una diminuzione dell'efficienza di semina e delle variazioni di lotto tra gli esperimenti.

Le fasi iniziali di controllo della qualità confermeranno le caratteristiche critiche dei PFFs, in particolare che hanno una conformazione fibrillaria (microscopia elettronica), contengono strutture amiloidi (saggio Tioflavina T) e sono pelletable (saggio di sedimentazione). È importante notare che i risultati del saggio tioflavin T oscilleranno con il tempo e non sono una misura diretta della quantità di strutture amiloidi presenti, piuttosto, il saggio di tioflavina T deve essere usato solo come indicatore della presenza di strutture amiloidi all'interno il campione. Thioflavin T è tipicamente usato in saggi in vitro, come il suddetto saggio per mostrare che le fibrille contengono strutture amiloidi. In alternativa, Tioflavina S è usato nei tessuti per rilevare strutture amiloidi, come mostrato in Figura 7. Per quanto riguarda il saggio di sedimentazione, i risultati mostrano solo che i PFFs si trovano prevalentemente nella frazione pelletable. Mentre i campioni vengono eseguiti in condizioni di denaturazione, una singola banda prominente di circa 14 kDa, la dimensione dei monomeri α-SYN, è presente sui gel. Questo è diverso dalle bande multiple presenti a pesi molecolari più elevati che ci si aspetta con i PFFs se è stato utilizzato un gel nativo o non denaturante. Infine, il superamento di tutte queste fasi iniziali di controllo della qualità non garantisce l'attività di semina dell'inclusione α-SYN. Per questo motivo, esperimenti di coltura cellulare o una piccola coorte di animali iniettati chirurgicamente devono essere utilizzati per testare l'efficacia dei PFFs prima dell'uso in esperimenti più grandi.

Sonicazione è un passo cruciale nel processo e parametri saranno diversi a seconda del modello di sonicatore utilizzato. I parametri di sonicazione devono essere applicati e verificati per mostrare che sono stati prodotti frammenti di PFF corti. Dimensione fibril ha cuscinetto sulla semina, con fibrille più brevi semina più efficiente. Anche se i semi di fibrille più brevi più efficiente, questo altipiani effetto e la lunghezza ottimale pff è di circa 50 Nm^4,18. È anche importante non sovra-Sonicare i campioni ed esporre i PFFs a calore eccessivo, in quanto questo può diminuire l'efficienza di semina. Questi PFFs sonicati devono essere testati per l'efficacia nella coltura di piccole cellule o negli esperimenti in vivo prima dell'uso in esperimenti su più grandi dimensioni. Poiché diverse sessioni di sonicazione hanno il potenziale per introdurre la variabilità, i gruppi di trattamento sperimentale dovrebbero essere pianificati di conseguenza.

Quando si consegnano i pffs in vivo, la localizzazione del sito (i) di iniezione e la quantità totale di pffs utilizzati possono influenzare il numero di neuroni che svilupperanno inclusioni, nonché l'entità della neurodegenerazione^7,14. Le coordinate del protocollo forniscono un punto di partenza, ma devono essere testate all'interno del laboratorio per garantire che la regione target desiderata sviluppi la patologia α-SYN prima dell'uso in esperimenti su larga scala. Se lo si desidera, il tracciamento delle tinte o delle perle fluorescenti può essere utilizzato come metodo per testare il targeting regionale prima di utilizzare i PFFs. La quantità di pffs utilizzata in vivo varia tra i gruppi, con la maggior parte dei gruppi che utilizzano un totale compreso tra 5 e 20 μg di pffs in uno o diviso tra due siti di iniezione^{1,2,3,4,5 , 6} il ^{, 7} il ^{, 14}. Poiché il numero di siti di iniezione, l'ubicazione dei siti di iniezione e la quantità di pffs iniettate possono influire sui risultati e sulla progressione della sinucleinopatia, i risultati a valle dei parametri utilizzati devono essere caratterizzati prima di utilizzare il modello per testare potenziali interventi o esaminare le caratteristiche temporali del modello.

Quando si seleziona un modello da utilizzare per testare le terapie o studiare la progressione della malattia, il modello utilizzato deve essere selezionato per rispondere meglio alla domanda posta. Non tutti i modelli saranno in possesso di alcune caratteristiche di malattia di PD, o offrire il lasso di tempo necessario per testare i potenziali interventi. Il modello PFF ricapitolizza le caratteristiche principali della PD, come la patologia α-SYN e la neurodegenerazione, e può portare a modeste riduzioni motorie. Il modello offre un corso temporale prevedibile e prolungato, dove le inclusioni si formano mesi prima della neurodegenerazione. Ciò consente ai ricercatori di esaminare e sfruttare le diverse fasi durante la progressione prolungata della sinucleinopatia. L'uso attuale e futuro del modello in generale dovrebbe essere vantaggioso nello studio della progressione della malattia e dello sviluppo di nuove terapie.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1x Dulbecco' soluzione salina tamponata con fosfato	Thermo Fisher (Gibco)	14190144
anticorpo anti-alfa-sinucleina (fosforilata alla serina 129)	Abcam	AB184674
anticorpo anti-alfa-sinucleina	Abcam	AB15530
acido bicinchonic Thermo	Fisher (Pierce)	PI23228
guaina termoretraibile medica trasparente (diametro interno 0,036")	Nordson Medical	103-0143
Tubo termoretraibile medico trasparente (diametro interno 0,044")	Nordson Medical	103-0296
Solfato di rame	Thermo Fisher (Pierce)	PI23224
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf	2231000574
Coperchio riscaldato Eppendorf ThermoTop	Eppendorf	5308000003
rivestito in Formvar/carbonio Griglie per microscopia elettronica	Eletron Microscopy Sciences	FCF300-Cu
Tubo capillare in vetro (diametro esterno 0,53 mm; diametro interno 0,09 mm; lunghezza 54 mm)	Drummond	22-326223
Estrattore di aghi in vetro	Narishige	PC-10
Siringa Hamilton	Hamilton	80000
Monomero umano di alfa-sinucleina per generare fibrille preformate	Proteos	RP-003
Monomero di alfa-sinucleina di topo per generare fibrille preformate	Proteos	RP-009
Tubo termoretraibile medico arancione (diametro interno 0,021)	Nordson Medical	103-0152
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7543
Proteinasi K	Invitrogen	25530015
Punta	Qsonica da 3,2 mmQsonica	4422
Qsonica Q125 sonicatore	Qsonica	Q125
Tioflavina S	Sigma-Aldrich	T1892
Tioflavina T	EMD Millipore	596200
ToxinSensor Kit per il dosaggio dell'endotossina cromogenica LAL	Genscript Genscript	L00350C
Acetato di uranile	Eletron Microscopy Sciences	22400