La tecnologia CRISPR-Cas9 fornisce un metodo efficiente per modificare con precisione il genoma dei mammiferi in qualsiasi tipo di cellula e rappresenta un nuovo mezzo per eseguire schermi genetici a livello di genoma. Qui viene fornito un protocollo dettagliato che illustra i passaggi necessari per il successo delle prestazioni degli schermi CRISPR-Cas9 a livello di genoma raggruppato.
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Articolo metodologico
Schermi genetici basati su CRISPR in cellule mammaliane
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'editing del genoma utilizzando il sistema CRISPR-Cas ha notevolmente avanzato la capacità di modificare con precisione i genomi di vari organismi. Nel contesto delle cellule dei mammiferi, questa tecnologia rappresenta un nuovo mezzo per eseguire schermi genetici a livello di genoma per studi di genomica funzionale. Le librerie di RNA guida (sgRNA) rivolti a tutti i frame di lettura aperti consentono la facile generazione di migliaia di perturbazioni genetiche in un singolo pool di cellule che possono essere sottoposte a screening per fenotipi specifici per implicare la funzione genica e i processi cellulari in un modo imparziale e sistematico. Gli schermi CRISPR-Cas forniscono ai ricercatori un metodo semplice, efficiente ed economico per scoprire i progetti genetici per i fenotipi cellulari. Inoltre, l'analisi differenziale degli schermi eseguiti in varie linee cellulari e da diversi tipi di cancro può identificare geni che sono contestualmente essenziali nelle cellule tumorali, rivelando potenziali bersagli per specifiche terapie anticancro. L'esecuzione di schermi a livello di genoma nelle cellule umane può essere scoraggiante, in quanto ciò comporta la gestione di decine di milioni di cellule e richiede l'analisi di grandi insiemi di dati. I dettagli di queste schermate, come la caratterizzazione della cella, le considerazioni sulla libreria CRISPR e la comprensione delle limitazioni e delle funzionalità della tecnologia CRISPR durante l'analisi, sono spesso trascurati. Qui è fornito un protocollo dettagliato per il successo delle prestazioni di successo di schermi basati su genomica in pool CRISPR-Cas9.
Introduzione
CRISPR-Cas, abbreviazione per brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente interspaziate e nuclease associate a CRISPR, è costituito da una singola proteina nucleasi (ad esempio Cas9) in complesso con una guida sintetica RNA (sgRNA). Questo complesso di ribonucleoproteina si rivolge all'enzima Cas9 per indurre rotture di DNA a doppio filamento in uno specifico locus genomico1. Le rotture a doppio filamento possono essere riparate tramite riparazione diretta homologia (HDR) o, più comunemente, attraverso l'unione finale non omologa (NHEJ), un meccanismo di riparazione soggetto a errori che si traduce in inserimento e/o delezioni (IND....
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Protocollo
Gli esperimenti descritti di seguito devono seguire le linee guida dell'Ufficio per la salute e la sicurezza ambientale dell'istituto.
1. Amplificazione plasmid della libreria lentivirale CRISPR in pool
- Diluire la libreria di DNA plasmid di sgRNA CRISPR ready-made a 50 ng/L in TE (ad esempio, TKOv3).
- Elettroporare la libreria utilizzando cellule elettrocompetenti. Impostare un totale di quattro reazioni di elettroporazione come descritto di seguito.
- Aggiungete su ghiaccio 2 -L di 50 ng/-L nella libreria TKO a 25 -L di cellule elettrocompetenti scongelate.
- Elettroporate utilizzando le impostazioni ottim....
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Risultati
Panoramica del flusso di lavoro di screening CRISPR su scala genomica
La figura 1 illustra una panoramica del flusso di lavoro di screening CRISPR in pool, a partire dall'infezione delle cellule bersaglio con lentivirus della libreria CRISPR con un basso MOI per garantire singoli eventi di integrazione e un'adeguata rappresentazione della libreria (in genere da 200 a 1000 -fold). Do.......
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Discussione
Grazie alla sua semplicità d'uso e all'elevata flessibilità, la tecnologia CRISPR è stata ampiamente adottata come strumento di scelta per un montaggio preciso del genoma. Lo screening CRISPR in pool fornisce un metodo per interrogare migliaia di perturbazioni genetiche in un singolo esperimento. Negli schermi in pool, le librerie di sgRNA fungono da codici a barre molecolari, poiché ogni sequenza è unica ed è mappata al gene mirato. Isolando il DNA genomico della popolazione cellulare, i geni che causano il fenotipo di .......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da Genome Canada, Ontario Research Fund e Canadian Institutes for Health Research (MOP-142375, PJT-148802).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| da 0,22 micron | |||
| 30 gradi Incubatrice | |||
| 37° Incubatore | |||
| 37° C, 5% CO2 incubatore | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE tampone | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N Soluzione di acido cloridrico | BioShop | HCL666.500 | |
| 95% Etanolo | |||
| Alamar blu | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| Transilluminatore a luce blu | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| Albumina sierica bovina, isolamento da shock termico, frazione V. Min. 98%, grado biotecnologico | Bioshop | ALB001.250 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium | Life Technologies | 11995-065 | Terreni di coltura Cel |
| Cuvette per elettroporazione | BTX | 45-0134 | |
| Elettroporatore | BTX | 45-0651 | |
| Endura cellule elettrocompetenti | Lucigen | 90293 | |
| Siero fetale bovino | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T celle di imballaggio | ATCC | CRL-3216 | numero di passaggio consigliato < 15 |
| Esadimetrina bromuro (Polybrene) | Sigma | H9268 | Polimero cationico per migliorare l'efficienza di trasduzione |
| Esadimetrina bromuro (Polybrene) | |||
| LB piastre di agar con carbenicillina | |||
| LB terreno con carbenicillina | |||
| Scala DNA a basso peso molecolare | New England Biolabs | N3233S | |
| Spettrofotometro Nanodrop | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Terreni di siero ridotti |
| Maxi kit di purificazione del plasmide | Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (plasmide a busta) | Addgene | Plasmide #12259 | sistema lentivirale |
| psPAX2 (confezione plasmide) | Addgene | Plasmid #12260 | sistema lentivirale |
| Puromicina | Wisent | 400-160-UG | |
| QIAkit di estrazione rapida del gel | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA BR test | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Qubit fluorimetro | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
| RNAsi A | Invitrogen | 12091021 | |
| Medium di recupero SOC | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Colorazione sicura per gel di DNA | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 incluso | Addgene Addgene | ID #90203 | Libreria CRISPR a livello di genoma, include Cas9, 71.090 sgRNA |
| Libreria CRIPSR Toronto KnockOut (TKOv3) - non cas9 | Addgene | Addgene ID #125517 | Libreria CRISPR a livello di genoma, non Cas9, soluzione Tris-EDTA (TE) da 71.090 sgRNA |
| agarosio ultrapuro | |||
| Roche | 06 365 809 001 | Reagente di trasfezione a base lipidica |
Riferimenti
- Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
- Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. <....
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Ristampe e permessi
