Analisi biochimiche in Vitro che utilizzano etichette di biotina per studiare le interazioni proteina-nucleica dell'acido

Sommario

Qui sono presentati protocolli per saggi biochimici in vitro utilizzando etichette di biotina che possono essere ampiamente applicabili per studiare le interazioni proteina-nucleiche dell'acido.

Abstract

Le interazioni tra acido proteina-nucleico svolgono un ruolo importante nei processi biologici come la trascrizione, la ricombinazione e il metabolismo dell'RNA. I metodi sperimentali per studiare le interazioni tra proteine-nucleici con acido richiedono l'uso di tag fluorescenti, isotopi radioattivi o altre etichette per rilevare e analizzare molecole bersaglio specifiche. La biotina, un'etichetta di acido nucleico non radioattivo, è comunemente usata nei saggi di mobilità elettroforici (EMSA), ma non è stata regolarmente impiegata per monitorare l'attività delle proteine durante i processi dell'acido nucleico. Questo protocollo illustra l'utilità dell'etichettatura della biotina durante le reazioni enzimatiche in vitro, dimostrando che questa etichetta funziona bene con una serie di diversi saggi biochimici. In particolare, in linea con i precedenti risultati ottenuti utilizzando substrati con etichetta a radioisotopi ³²P, è confermato tramite EMSA con etichetta biotina che IL MEIOB (una proteina specificamente coinvolta nella ricombinazione meiotica) è una proteina legante al DNA, che MOV10 (un RNA helicase) risolve le strutture in base al polpa di RNA etichettate con biotina, e quel MEIOB fende il DNA a filamento singolo etichettato con biotina. Questo studio dimostra che la biotina è in grado di sostituendo ³²P in vari saggi biochimici correlati all'acido nucleico in vitro.

Introduzione

Le interazioni tra acido proteina-nucleico sono coinvolte in molti processi cellulari essenziali come la riparazione del DNA, la replicazione, la trascrizione, l'elaborazione dell'RNA e la traduzione. Le interazioni proteiche con sequenze specifiche di DNA all'interno della cromatina sono necessarie per uno stretto controllo dell'espressione genica a livello tracscrivionale¹. Una precisa regolazione posttrapescrittiva di numerosi RNA codificanti e non codificanti richiede interazioni estese e complicate tra qualsiasi proteina e RNA². Questi strati del meccanismo regolatore dell'espressione genica comprendono una cascata ....

Protocollo

1. Preparazione delle proteine

1. Costrutti di espressione MEIOB e MOV10
   1. Generare costrutti di espressione cDNA codificando mouse MEIOB-A, C ed E (Figura 1A) e MOV10.
      1. Impostare le reazioni a catena di polimerasi (PCR) per ogni frammento. Mescolare 1 l di cDNA di topo (da C57BL/6 testi topo), 1 "L of dNTP", 2 -L di 10 - L di 10 M in avanti, 2 L di 10 M inverso, 1 l of DNA polymerase, 25 litri di 2x buffer PCR e 18 l di doppio distillato H₂O (ddH₂O) in un finale volume di 50 l.
         NOTA: I primer per l'amplificazione dei frammenti di geni Meiob e Mov10 sono elenca....

Risultati

La struttura proteica di MEIOB e i costrutti di espressione utilizzati in questo studio sono illustrati nella Figura 1A. Le pieghe OB in MEIOB sono strutture compatte simili a botte in grado di riconoscere e interagire con gli acidi nucleici a filamento singolo. Uno dei domini OB (aa 136-307, costrutto A) lega il DNA a singolo filamento (ssDNA), la proteina troncata (troncamento aa 136-178, costrutto C) e la forma mutante a punti (R235A, costrutto E) di MEIOB non hanno attiv.......

Discussione

Lo studio delle interazioni tra proteine e acidi nucleici è fondamentale per la nostra comprensione dei meccanismi molecolari alla base di diversi processi biologici. Ad esempio, MEIOB è una proteina specifica per i testicoli essenziale per la meiosi e la fertilità nei mammiferi^25,26,27. MEIOB contiene un dominio OB che si lega al DNA a filamento singolo e presenta da 3' a 5' attività esonuclease²⁶, che s.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Equipment
Centrifuge	Eppendorf, Germania	5242R
Sistema di imaging chemiluminescente	Tanon, Cina	5200
Digital sonifer	Branson, USA	BBV12081048A	450 Watt; 50/60 HZ
Assorbente elettroforetico semi-secco	Hoefer, USA	TE77XP
Revolver a tubo	Crystal, USA	3406051
reticolante a luce UVP	UVP, USA	CL-1000
Materiali
Filtro centrifugo Amicon Ultra-4	Milipore, USA	UFC801096	da 4 ml/10 K
	Thermo Scientific, USA	TG263940A
Piastra di coltura trattata	con TC Corning, USA	430167	100 mm
Piatto di coltura trattato TC	Corning, USA	430597	150 mm
Microprovette	AXYGEN, USA	MCT-150-C	1,5 mL
Provette	Corning, USA	430791	15 mL
Reagenti
Ampicillin	SunShine Bio, Cina	8h288h28
Perle magnetiche M2 anti-FLAG	Sigma, USA	M8823
ATP	Thermo Scientific, USA	591136
/ NBT	Beyotime, Cina	C3206
CelLyticTM< / sup> M Lisi cellulare Reagente	Sigma, USA	107M4071V
Kit di clonazione in un solo passaggio ClonExpress II	Vazyme, Cina	C112
	Thermo Scientific, USA	T1269950
dNTP	Sigma-Aldrich, USA	DNTP100-1KT
DMEM	Gibco, USA	10569044
tampone DPBS	Gibco, USA	14190-136
EDTA	Invitrogen, USA	AM9260G	0,5 M
Cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA	Roche, USA	04693132001
Kit di plasmidi maxi EndoFree	Vazyme, Cina	DC202
FastPure Gel DNA Estrazione Mini Kit	Vazyme, Cina	DC301-01
FBS	Gibco, USA	10437028
FLAG peptide	Sigma, USA	F4799
Glicerolo	Sigma, USA	SHBK3676
GST Bulk Kit	GE Healthcare, USA	27-4570-01
Tampone HEPES	Sigma, Stati Uniti	SLBZ2837	1 M
IPTG	Thermo Scientific, USA	34060
KoAc	Sangon Biotech, Cina	127-08-02
Lipofectamin 3000 Reagente di trasfezione	Thermo Scientific, USA	L3000001
MgCl2	Invitrogen, USA	AM9530G	1 M
NaCl	Invitrogen, USA	AM9759	5 M
NP-40	Amresco, USA	M158-500ML
Opti-MEM medium	Gibco, USA	31985062
PBS	Gibco, USA	10010023	PH 7.4
RNase Inhibitor	Promega, USA	N251B
Streptavidina fosfatasi alcalina	Promega, USA	V5591
TBE	Invitrogen, USA	15581044
Tampone Tris-HCI	Invitrogen, USA	15567027	1 M, tampone PH 7.4
Tris-HCI	Invitrogen, Stati Uniti	15568025	1 M, PH 8.0
Tween-20	Sangon Biotech, Cina	A600560

Membrana in nylon Kit di sviluppo del colore della fosfatasi alcalina BCIP Kit di rilevamento dell'acido nucleico chemiluminescente