Articolo metodologico
* These authors contributed equally
Questo protocollo isola le vesciche extracellulari (EV) lontano dai virioni con elevata efficienza e resa incorporando precipitazioni EV, ultracentrifugazione del gradiente di densità e cattura di particelle per consentire un flusso di lavoro semplificato e una riduzione dell'avvio volume, con conseguente preparazione riproducibile per l'uso in tutte le ricerche EV.
Uno dei principali ostacoli nel campo della ricerca sulla vescicolo extracellulare (EV) oggi è la capacità di ottenere preparati EV purificati in un ambiente di infezione virale. Il metodo presentato ha lo scopo di isolare i VE lontano dai virioni (cioè L'HIV-1), consentendo una maggiore efficienza e resa rispetto ai metodi di ultracentrifugazione convenzionali. Il nostro protocollo contiene tre passaggi: precipitazione EV, separazione del gradiente di densità e cattura delle particelle. I saggi a valle (ad esempio, western blot e PCR) possono essere eseguiti direttamente dopo la cattura delle particelle. Questo metodo è vantaggioso rispetto ad altri metodi di isolamento (ad esempio, ultracentrifugation) in quanto consente l'uso di volumi di partenza minimi. Inoltre, è più facile da usare rispetto ai metodi alternativi di isolamento EV che richiedono più passaggi di ultracentrifugation. Tuttavia, il metodo presentato è limitato nella sua portata di saggi EV funzionali in quanto è difficile elusioni esitari dalle nostre particelle. Inoltre, questo metodo è adattato a un ambiente strettamente basato sulla ricerca e non sarebbe commercialmente fattibile.
La ricerca incentrata sulle vescicle extracellulari (EV), in particolare gli esosomi, un tipo di Veicoli che vanno 30-120 nm e caratterizzato dalla presenza di tre marcatori tetraspanina CD81, CD9 e CD63, è stato in gran parte modellato dallo sviluppo di metodi per isolare e purificare le vesciche di interesse. La capacità di sezionare meccanismi sfaccettati è stata ostacolata a causa di tecniche complesse e dispendiose in termini di tempo che generano campioni composti da una popolazione eterogenea di vescicoli generati attraverso percorsi diversi con una vasta gamma di contenuti, dimensioni e Densità. Anche se questo è un problema per quasi tutte le ricerche EV, è d....
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1. Filtrazione e precipitazione delle vescibole extracellulari (EV)
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Le precipitazioni PEG aumentano la resa EV
Il nostro approccio combinato all'isolamento EV è significativamente più efficiente in termini di recupero EV rispetto all'ultracentrifugazione tradizionale, come evidente dalla riduzione del 90% del volume di materiale di partenza richiesto. Ultracentrifugation, l'attuale gold standard in isolamento EV, richiede circa 100 mL di coltura supernatant per produrre un'adeguata preparazione EV per i test a valle, mentre il nostro n.......
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Il metodo delineato consente una maggiore resa evlari e la separazione del virus dagli eV utilizzando un approccio combinato all'isolamento. Quantità relativamente elevate di materiale di partenza (ad es. supernatante cellulare) possono essere filtrate prima dell'isolamento EV mediante precipitazioni, separazione della DG e arricchimento delle nanoparticelle, con un volume finale di 30 saggi a valle. L'uso dell'arricchimento delle nanoparticelle è essenziale in quanto, rispetto all'ultracentrifugazione tradizionale, ques.......
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B.L. è affiliata con Ceres Nanosciences inc. Tutti gli altri autori non dichiarano potenziali conflitti di interesse.
Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Kashanchi, in particolare Gwen Cox. Questo lavoro è stato supportato da National Institutes of Health (NIH) Grants (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894 e NS099029 a F.K.).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| CEM CD4+ | Cellule Programma di reagenti NIH AIDS | 117 | CEM |
| DPBS senza Ca e Mg (1x) | Biologico di qualità | 114-057-101 | |
| ExoMAX Opti-Enhancer | Systems Biosciences | EXOMAX24A-1 | REAGENTE di precipitazione PEG |
| FBS impoverito di esosomi | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | |
| Siero fetale bovino | Picco sierico | PS-FB3 | Siero |
| HIV-1 infettato Cellule U937 | NIH AIDS Programma di reagenti | 165 | |
| U1 Nalgene Filtro siringa 0,2 &; m SFCA | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| Nanotrap (NT80) | Ceres Nanosciences | CN1030 | Reactive Red 120 core |
| Nanotrap (NT82) | Ceres Nanosciences | CN2010 | Cibacron Blue F3GA core |
| Optima XE-980 Ultracentrifuga | Beckman Coulter | A94471 | |
| OptiPrep Gradiente di densità medio | Sigma-Aldrich | D1556-250mL | Rotore a secchio oscillante Iodixanol |
| SW 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | |
| tubo ultra trasparente, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 |
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