Adattamento semi-alto/throughput del saggio ATPase accoppiato NADH per lo screening degli inibitori delle piccole molecole

Laszlo Radnai; Rebecca F. Stremel; James R. Sellers; Gavin Rumbaugh; Courtney A. Miller

doi:10.3791/60017

Articolo metodologico

Adattamento semi-alto/throughput del saggio ATPase accoppiato NADH per lo screening degli inibitori delle piccole molecole

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DOI:

10.3791/60017

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17 agosto 2019

Laszlo Radnai¹^,² , Rebecca F. Stremel¹^,² , James R. Sellers³ , Gavin Rumbaugh² , Courtney A. Miller¹^,²

¹Department of Molecular Medicine, The Scripps Research Institute, ²Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute, ³Laboratory of Molecular Physiology, NHLBI, National Institutes of Health

In questo articolo

Sommario

Un saggio ATPase accoppiato a nicotinamide (NADH) è stato adattato allo screening semi-alto flusso di inibitori della miosina. Questo saggio cinetico viene eseguito in un formato a microplacca 384 pozzetti con volumi di reazione totali di soli 20 l per pozzo. La piattaforma dovrebbe essere applicabile praticamente a qualsiasi enzima che produce ADP.

Abstract

Gli enzimi ATPase utilizzano l'energia libera immagazzinata nel triposfato adenosina per catalizzare un'ampia varietà di processi biochimici endergonici in vivo che non si verificherebbero spontaneamente. Queste proteine sono fondamentali per essenzialmente tutti gli aspetti della vita cellulare, tra cui il metabolismo, la divisione cellulare, le risposte ai cambiamenti ambientali e il movimento. Il protocollo qui presentato descrive un saggio ATPase accoppiato a nicotinamide (NADH) che è stato adattato allo screening semi-alto della produttività degli inibitori ATPase a piccole molecole. Il saggio è stato applicato alla miosina cardiaca e scheletrica di miosina II, due ATPases motori molecolari basati su actin, come prova di principio. L'idrolisi dell'ATP è accoppiata all'ossidazione di NADH da reazioni enzimatiche nel saggio. In primo luogo, l'ADP generato dall'ATPase viene rigenerato in ATP dalla chinasi pirativae (PK). PK catalizza la transizione del fosforolpyruvate (PEP) alla pirofavia in parallelo. Successivamente, il pirate viene ridotto al lattato mediante dehydrogenase di lattato (LDH), che catalizza l'ossidazione di NADH in parallelo. Pertanto, la diminuzione della concentrazione di ATP è direttamente correlata alla diminuzione della concentrazione di NADH, seguita da un cambiamento alla fluorescenza intrinseca di NADH. Finché la PEP è disponibile nel sistema di reazione, la concentrazione di ADP rimane molto bassa, evitando l'inibizione dell'enzima ATPase da parte del proprio prodotto. Inoltre, la concentrazione ATP rimane quasi costante, producendo corsi temporali lineari. La fluorescenza viene monitorata continuamente, il che consente una facile stima della qualità dei dati e aiuta a filtrare i potenziali artefatti (ad esempio, derivanti da precipitazioni composte o cambiamenti termici).

Introduzione

I miosini sono trasduttori di energia meccanochimica che idrolizzano il tripfosfato di adenosina (ATP) per generare movimento direzionale lungo i filamenti del citoscheletro actinos in eucarioti¹^,². Si sono adattati sia strutturalmente che kineticamente alle loro varie funzioni intracellulari, come il trasporto di organelli, la contrazione muscolare o la generazione di tensione citoscheletrica¹^,². La superfamiglia della miosina è rappresentata da 40 geni della miosina appartenenti a classi di miosina distinte da 12 dollari nel genoma umano