Discriminazione e mappatura delle trascrizioni primarie ed elaborate nel mitocondrio di mais utilizzando una strategia circolare basata su RT-PCR

Summary

Vi presentiamo una strategia circolare basata su RT-PCR combinando RT-PCR circolare, RT-PCR quantitativo, trattamento polifosculo DI RNA 5 e macchia settentrionale. Questo protocollo include una fase di normalizzazione per ridurre al minimo l'influenza del tripofatore instabile 5', ed è adatto per discriminare e mappare le trascrizioni primarie ed elaborate accumulate stabilmente nel mitocondrio di mais.

Abstract

Nei mitocondri delle piante, alcune trascrizioni in stato costante hanno 5' triposfato derivato dall'initiazione della trascrizione (trascrizioni primaria), mentre le altre contengono 5' monofofafato generato post-transcriptionally (trascrizioni elaborate). Per discriminare tra i due tipi di trascrizioni, sono state sviluppate diverse strategie e la maggior parte di esse dipende dalla presenza/assenza di 7' triposfato. Tuttavia, il triplofato al termine primario 5' è instabile, e ostacola una chiara discriminazione dei due tipi di trascrizioni. Per differenziare e mappare sistematicamente le trascrizioni primarie ed elaborate accumulate stabilmente nel mitocondrio di mais, abbiamo sviluppato una strategia circolare basata su RT-PCR (cRT-PCR) combinando cRT-PCR, trattamento quantitativo dei polifoshpatasi di RNA 5', RT-PCR (RT-qPCR) e Northern blot. Come miglioramento, questa strategia include un passo di normalizzazione dell'RNA per ridurre al minimo l'influenza del tripfosfato unstable 5'.

In questo protocollo, l'RNA mitocondriale arricchito è pre-trattato da RNA 5' polifosforasi, che converte il triphsofato da 5' in monofagofato. Dopo la circolarizzazione e la trascrizione inversa, i due cDNA derivati da 5' RNA trattati con polifofofosi e non trattati sono normalizzati dal mais 26S rRNA maturo, che ha una fine elaborata 5' ed è insensibile a 5' polifosfolasi. Dopo la normalizzazione, le trascrizioni primarie e trasformate vengono discriminate confrontando i prodotti cRT-PCR e RT-qPCR ottenuti dagli RNA trattati e non trattati. La prova di trascrizione è determinata dalla clonazione e dal sequenziamento dei prodotti cRT-PCR e quindi verificata da Northern blot.

Utilizzando questa strategia, sono state determinate la maggior parte delle trascrizioni a stato costante nel mitocondrio di mais. A causa del complicato schema di trascrizione di alcuni geni mitocondriali, alcune trascrizioni a stato costante non sono state differenziate e/o mappate, anche se sono state rilevate in una macchia settentrionale. Non siamo sicuri se questa strategia sia adatta a discriminare e mappare le trascrizioni dello stato costante in altri mitocondri vegetali o in plastidi.

Introduction

Nei mitocondri vegetali, molti RNA maturi e precursori vengono accumulati come isoformi multipli, e le trascrizioni allo stato costante possono essere divise in due gruppi in base alla differenza alle loro 5 ' estremità^{1,2,3 4}. Le trascrizioni primarie hanno 5' estremità triposphate, che derivano dall'avvio della trascrizione. Al contrario, le trascrizioni elaborate hanno 5' monofafato generato dall'elaborazione post-trascrizione. La discriminazione e la mappatura dei due tipi di trascrizioni sono importanti per svelare i meccanismi molecol....

Protocol

1. Progettazione di Primer

1. Progettare primer gene-specific per la trascrizione inversa (RT) utilizzando il software di progettazione del primer PCR (Table of Materials) in base alle regole generali di primer design¹⁷.
   NOT: I primer RT sono altamente specifici per le trascrizioni di destinazione, e sono generalmente ancorati sulla parte 5' delle sequenze di codifica (mRNA maturi e RNA precursori), o 500-600 nt a valle della fine prevista 5' (18S e 26S rRNA).
2. Progettare coppie di primer divergenti per amplificare le trascrizioni circolari da cRT-PCR.
   NOTA: i primer divergenti acc....

Results

Stima dell'efficienza di circolarizzazione dell'RNA mitocondriale

In uno studio precedente, sia gli RNA totali che quelli mitocondriali sono stati utilizzati per la mappatura cRT-PCR della trascrizione mitocondriale termini in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) e i due tipi di RNA hanno dato risultati di mappatura simili¹². Inizialmente, abbiamo anche usato RNA totali pe.......

Discussion

In uno studio precedente, gli RNA totali e mitocondriali della coltura delle sospensioni cellulari dell'Arabidopsis sono stati utilizzati per mappare i termini trascrizione mitocondriale da cRT-PCR, e risultati simili sono stati ottenuti¹². Tuttavia, solo l'RNA mitocondriale arricchito è stato utilizzato per mappare la trascrizione mitocondriale termini in molti altri studi^1,2,3,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acido acetico	Aladino, Cina	A112880	Per preparare 1x tampone TAE
Applied Biosystems 2720 Termociclatore	Thermo Fisher Scientific, USA	4359659	Termociclatore per l'amplificazione della PCR
Acido ascorbico	Sigma-aldrich, USA	V900134	Per la preparazione del tampone di estrazione
Biowest Agarose	Biowest, Spagna	9012-36-6	Per risolvere la PCR prodotti e RNA
Albumina sierica bovina	Sigma-aldrich, USA	A1933	Per la preparazione di tampone di estrazione
Blu di bromofenolo	Sigma-aldrich, USA	B8026	Per la preparazione di tampone di carico per elettroforesi su gel di agarosio e Northern
blot DEPC	Sigma-aldrich, USA	V900882	Disattivazione della RNasi
DIG Northern starter kit	Roche, USA	12039672910	Per la marcatura di DIG-RNA e Northern blot. Questo kit contiene i reagenti per la trascrizione-marcatura dell'RNA con DIG e RNA polimerasi T7, l'ibridazione e la rilevazione chemiluminescente.
EDTA	Sigma-aldrich, USA	V900106	Per la preparazione del tampone di estrazione e 1x tampone TAE
EGTA	Sigma-aldrich, USA	E3889	Per la preparazione del tampone di lavaggio
Sistema di documentazione su gel	Bio-Rad, USA	Gel Doc XR+	Per l'imaging del gel di agarosio
Glycerol	Sigma-aldrich, USA	G5516	Per la preparazione del tampone di carico per l'elettroforesi su gel di agarosio
GoldView II (5.000x)	Solarbio,. Cina	G8142	Colorazione del DNA
Hybond-N+, membrana in nylon	Amersham Biosciences, USA	RPN119	Per Northern blot
Image Lab	Bio-Rad, USA	Image Lab 3.0	Image Gel e confrontare l'abbondanza di prodotti PCR.
KH2PO4	Sigma-aldrich, USA	V900041	Per la preparazione del tampone di estrazione
KOH	Aladdin, Cina	P112284	Per la preparazione del tampone di estrazione
L-cisteina	Sigma-aldrich, USA	V900399	Per la preparazione del tampone di estrazione
Millex	Millipore, USA	SLHP033RB	Per l'estrazione sterile e tamponi di lavaggio mediante filtrazione
Miracloth	Calbiochem, USA	475855-1R	Per filtrare i tessuti del nocciolo macinato
MOPS	Sigma-aldrich, USA	V900306	Per la preparazione del tampone di corsa per Northern blot
	NanoDrop Thermo Fisher Scientific, USA	2000C	Per il test di concentrazione e purezza dell'RNA
NaOH	Sigma-aldrich, USA	V900797	Per preparazione del tampone di lavaggio
pEASY-Blunt vettore di clonaggio semplice	TransGen Biotech, Cina	CB111	Clonazione della banda recuperata in gel. Contiene un promotore T7 diversi bps a monte del sito di inserimento.
Phanta max super-fedeltà DNA polimerasi	Vazyme, Cina	P505	DNA polimerasi per amplificazione PCR
Polivinilpirrolidone 40	Sigma-aldrich, USA	V900008	Per la preparazione del tampone di estrazione
Primer Premier 6.24	PREMIER Biosoft, USA	Primer Premier 6.24	Per progettare primer per la trascrizione inversa e l'amplificazione PCR
Trascrittasi inversa PrimeScript II	Takara, Giappone	2690	Per sintetizzare il primo kit di cDNA a filamento
PureLink RNA Mini Thermo	Fisher Scientific, USA	12183025	Per la purificazione dell'RNA
RNA 5' polifosfatasi	Epicentro, USA	RP8092H	Per convertire il trifosfato 5' in monofosfato
RNasi inibitore	New England Biolabs, UK	M0314	Un componente dell'autolegatura dell'RNA e delle reazioni di trattamento con polifosfatasi 5' e viene utilizzato per inibire l'attività della RNasi.
Acetato di sodio	Sigma-aldrich, USA	V900212	Per la preparazione del tampone di corsa per Northern blot
Cloruro di sodio	Sigma-aldrich, USA	V900058	Per preparare 20x SSC
SsoFas evaGreen supermiscele	Bio-Rad, USA	1725202	Per RT-qPCR
T4 RNA Ligasi 1	New England Biolabs, UK	M0437	Per la circolarizzazione dell'RNA
Tetrasodio pirofosfato	Sigma-aldrich, USA	221368	Per la preparazione del tampone di estrazione
TIANgel kit di purificazione midi	Tiangen Biotech, Cina	DP209	Per purificare frammenti di DNA dal gel di agarosio
Tris	Aladdin, Cina	T110601	Per preparare 1x reagente TRIzol tampone TAE
	Invitrogen, USA	Per estrarre l'RNA mitocondiale.
Kit universale di purificazione del DNA	Tiangen Biotech, Cina	DP214	Per recuperare i plastmidi linearizzati dalla reazione di digestione dell'enzima di restrizione
Xilene cianolo FF	Sigma-aldrich, USA	X4126	Per la preparazione del tampone di carico per l'elettroforesi su gel di agarosio