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Articolo metodologico

Discriminazione e mappatura delle trascrizioni primarie ed elaborate nel mitocondrio di mais utilizzando una strategia circolare basata su RT-PCR

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DOI:

10.3791/60019

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29 luglio 2019

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1State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources, South China Agricultural University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding, College of Agriculture, South China Agricultural University

In questo articolo

Sommario

Vi presentiamo una strategia circolare basata su RT-PCR combinando RT-PCR circolare, RT-PCR quantitativo, trattamento polifosculo DI RNA 5 e macchia settentrionale. Questo protocollo include una fase di normalizzazione per ridurre al minimo l'influenza del tripofatore instabile 5', ed è adatto per discriminare e mappare le trascrizioni primarie ed elaborate accumulate stabilmente nel mitocondrio di mais.

Abstract

Nei mitocondri delle piante, alcune trascrizioni in stato costante hanno 5' triposfato derivato dall'initiazione della trascrizione (trascrizioni primaria), mentre le altre contengono 5' monofofafato generato post-transcriptionally (trascrizioni elaborate). Per discriminare tra i due tipi di trascrizioni, sono state sviluppate diverse strategie e la maggior parte di esse dipende dalla presenza/assenza di 7' triposfato. Tuttavia, il triplofato al termine primario 5' è instabile, e ostacola una chiara discriminazione dei due tipi di trascrizioni. Per differenziare e mappare sistematicamente le trascrizioni primarie ed elaborate accumulate stabilmente nel mitocondrio di mais, abbiamo sviluppato una strategia circolare basata su RT-PCR (cRT-PCR) combinando cRT-PCR, trattamento quantitativo dei polifoshpatasi di RNA 5', RT-PCR (RT-qPCR) e Northern blot. Come miglioramento, questa strategia include un passo di normalizzazione dell'RNA per ridurre al minimo l'influenza del tripfosfato unstable 5'.

In questo protocollo, l'RNA mitocondriale arricchito è pre-trattato da RNA 5' polifosforasi, che converte il triphsofato da 5' in monofagofato. Dopo la circolarizzazione e la trascrizione inversa, i due cDNA derivati da 5' RNA trattati con polifofofosi e non trattati sono normalizzati dal mais 26S rRNA maturo, che ha una fine elaborata 5' ed è insensibile a 5' polifosfolasi. Dopo la normalizzazione, le trascrizioni primarie e trasformate vengono discriminate confrontando i prodotti cRT-PCR e RT-qPCR ottenuti dagli RNA trattati e non trattati. La prova di trascrizione è determinata dalla clonazione e dal sequenziamento dei prodotti cRT-PCR e quindi verificata da Northern blot.

Utilizzando questa strategia, sono state determinate la maggior parte delle trascrizioni a stato costante nel mitocondrio di mais. A causa del complicato schema di trascrizione di alcuni geni mitocondriali, alcune trascrizioni a stato costante non sono state differenziate e/o mappate, anche se sono state rilevate in una macchia settentrionale. Non siamo sicuri se questa strategia sia adatta a discriminare e mappare le trascrizioni dello stato costante in altri mitocondri vegetali o in plastidi.

Introduzione

Nei mitocondri vegetali, molti RNA maturi e precursori vengono accumulati come isoformi multipli, e le trascrizioni allo stato costante possono essere divise in due gruppi in base alla differenza alle loro 5 ' estremità1,2,3 4. Le trascrizioni primarie hanno 5' estremità triposphate, che derivano dall'avvio della trascrizione. Al contrario, le trascrizioni elaborate hanno 5' monofafato generato dall'elaborazione post-trascrizione. La discriminazione e la mappatura dei due tipi di trascrizioni sono importanti per svelare i meccanismi molecolari alla base della trascrizione e della maturazione finale della trascrizione.

Per distinguere tra le trascrizioni primarie ed elaborate nel mitocondrio vegetale, sono state sviluppate quattro strategie principali. La prima strategia consiste nel pretrattare gli RNA mitocondriali con il pirofosofasi acido del tabacco (TAP), che converte il tripfosfato 5' in monofagofato e consente alle trascrizioni primarie di essere circolati dalla ligase dell'RNA. L'abbondanza di trascrizioni di campioni di RNA trattati con TAP e non trattati viene quindi confrontata con una rapida amplificazione delle estremità cDNA (RACE) o RT-PCR circolari (cRT-PCR)2,3,4. Nella seconda strategia, le trascrizioni elaborate vengono prima esaurite dagli RNA mitocondriali utilizzando l'eonuclease dipendente dal terminator5-fosfatio (TEX), e le trascrizioni primarie rimaste vengono quindi mappate dall'analisi dell'estensione del primer5,6 . La terza strategia è quella di pre-cap le trascrizioni primarie utilizzando guanylyl transferase, e quindi la posizione di triposphated 5' è determinata dall'estensione primer insieme con ribonuclease o S1 nuclease protection analysis7,8 ,9. A differenza di quelli che dipendono dalla presenza/assenza di 7' triposfato, la quarta strategia combina la trascrizione in vitro, la mutagenesi diretta dal sito e l'analisi dell'estensione del primer per caratterizzare i promotori putativi e determinare la trascrizione siti di avvio8,10,11. Utilizzando queste strategie, molte trascrizioni primarie ed elaborate sono state determinate nei mitocondri delle piante.

Tuttavia, diversi studi hanno riferito che il trifosfato 5' delle trascrizioni primarie erano instabili, e sono stati facilmente convertiti in monofosfato per motivo sconosciuto2,4,12,13. Questo problema ostacola una chiara discriminazione dei due tipi di trascrizioni utilizzando tecniche a seconda della presenza/assenza di trifosfato 5' e precedenti sforzi per distinguere sistematicamente tra le trascrizioni primarie ed elaborate nell'impianto mitocondri fallito2,12.

In questo protocollo, combiniamo cRT-PCR, trattamento polifosforo RNA 5', RT-qPCR e macchia settentrionale per distinguere sistematicamente le trascrizioni primarie ed elaborate accumulate stabilmente nel mais (zea mays) mitocondrion (Figura 1). cRT-PCR consente la mappatura simultanea delle estremità 5' e 3' di una molecola di RNA, ed è di solito adattata alla trascrizione dei termini nelle piante2,12,14,15. Il polifosforasi di RNA 5' potrebbe rimuovere due fosfati dal termine di 1'trhafated 5', il che rende disponibili le trascrizioni primarie per l'auto-legatura da parte della ligase dell'RNA. Studi precedenti hanno dimostrato che il rRNA 26S maturo nel mais aveva elaborato il capolinea 5', ed era insensibile al polifosculo DI RNA 5 '1,16. Per ridurre al minimo l'influenza del triposfato instabile ai termini primari 5', i 5' RNA trattati con polifofofofosi e non trattati vengono normalizzati da rRNA 26S maturi, e le trascrizioni primarie ed elaborate vengono quindi differenziate confrontando cRT-PCR ottenuti dai due campioni di RNA. I risultati della mappatura cRT-PCR e della discriminazione sono verificati rispettivamente da Northern blot e RT-qPCR. Infine, i primer alternativi vengono utilizzati per amplificare le trascrizioni rilevate nella macchia settentrionale, ma non da cRT-PCR. Utilizzando questa strategia basata su cRT-PCR, la maggior parte delle trascrizioni a stato costante nel mitocondrio di mais sono state differenziate e mappate1.

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Protocollo

1. Progettazione di Primer

  1. Progettare primer gene-specific per la trascrizione inversa (RT) utilizzando il software di progettazione del primer PCR (Table of Materials) in base alle regole generali di primer design17.
    NOT: I primer RT sono altamente specifici per le trascrizioni di destinazione, e sono generalmente ancorati sulla parte 5' delle sequenze di codifica (mRNA maturi e RNA precursori), o 500-600 nt a valle della fine prevista 5' (18S e 26S rRNA).
  2. Progettare coppie di primer divergenti per amplificare le trascrizioni circolari da cRT-PCR.
    NOTA: i primer divergenti accoppiati fiancheggiano la giunzione 5'3' delle trascrizioni circolari e le loro posizioni variano tra le trascrizioni di destinazione analizzate (Figura S1). Alcune trascrizioni hanno UDR lunghe; ad esempio, nad2-1 5' UTR e rps4-1 3' UTR sono 1.985 e 1.826/1.834 nt, rispettivamente1. Se entrambi i primer sono ancorati all'area di codifica, sarà difficile amplificare le trascrizioni di destinazione. Al contrario, alcuni UTR sono brevi; ad esempio, i 3' UTR di nad2-1 e nad4-1 sono rispettivamente 34/35 e 29–31 nt, rispettivamente1. Se i primer accoppiati si trovano lontano dalle sequenze di codifica, la PCR avrà esito negativo. Generalmente, due coppie di primer divergenti sono progettati per ogni trascrizione di destinazione, mentre più coppie possono essere necessarie per mappare quelli i cui modelli di trascrizione sono complicati e/o gli UTR sono molto lunghi.
  3. Progettare coppie di primer convergenti per preparare sonde di RNA per la macchia settentrionale.
    NOT: I primer accoppiati si trovano sulla regione di codifica del gene bersaglio e la dimensione del prodotto PCR dovrebbe essere compresa tra 100 e 1.000 bp. Ogni primer in avanti deve contenere un sito enzimatico di restrizione per ridurre al minimo le sequenze vettoriali nelle sonde risultanti.

2. Preparazione del mitocondrio grezzo dai kernel in via di sviluppo del mais

  1. Sterilizza pestelli, mortai, imbuti di vetro, tubi e punte per autoclave e asciugali in forno.
  2. Eseguire tutte le procedure a 4 gradi centigradi o sul ghiaccio e pre-raffreddare tutte le soluzioni.
  3. Preparare 100 mL di buffer di estrazione (EB), composto da 0,3 M di saccarosio, 5 mM di tetrasodium pirofosfato, 10 mM KH2PO4, 2 mM EDTA, 1% [w/v] polyvinylpyrrolidone 40, 1% [w/v] bovine serum albumin, 5 mM L-cysteine e 20 mcorm asbica acida. Regolare a pH 7.3 con KOH e sterilizzare per filtrazione.
  4. Preparare 100 mL di buffer di lavaggio (WB) composto da 0,3 M di saccarosio, 1 mM EGTA e 10 mM MOPS (3-(N-morpholino)acido proposulfonico). Regolare a pH 7.2 con NaOH e sterilizzare per filtrazione.
    NOT: Si consiglia di preparare EB e WB utilizzando DePC-trattato deionizzato H2O.
  5. Raccogliere 20 g sviluppando kernel a 11-20 giorni dopo l'impollinazione (DAP) a un tubo da 50 mL posto sul ghiaccio, quindi trasferire i chicchi a mortai pre-raffreddati.
    NOT: Utilizzare un rapporto di 100 mL di EB a 20 g di kernel di mais.
  6. Aggiungere 10-20 mL di EB ghiacciato ad ogni mortaio e macinare completamente i chicchi.
  7. Aggiungere più EB, e filtrare i tessuti del terreno attraverso due strati di panno di filtro (Tabella dei materiali).
  8. Centrifugare il filtrato a 8.000 x g per 10 min e scartare il pellet.
  9. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo e centrifugarlo a 20.000 x g per 10 min.
  10. Versare il supernatante, e risospendere il pellet in 6 mL WB.
  11. La sospensione è di cinque tubi da 1,5 mL senza RNase e centrifugarli a 14.000 x g per 5 min.
  12. Scartare il supernatante, congelare il pellet mitocondriale in azoto liquido e conservarlo a -80 gradi centigradi.

3. Estrazione di RNA mitocondriale

  1. Estrarre l'RNA mitocondriale con un reagente commerciale (Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
    ATTENZIONE: Questo reagente contiene fenolo e guanidina isothiocyanate. Lavora con esso in un cappuccio a fume e indossa camice da laboratorio e guanti.
  2. Sciogliere l'RNA mitocondriale isolato in DePC-trattato deionizzato H2O, e stimare la concentrazione di RNA e la purezza con uno spettrofotometro (Tabella dei materiali).
    NOT: In genere, l'RNA mitocondriale di 250 g è ottenuto da 20 g di 15-DAP kernel di mais.
  3. Preparare un gel di agarose composto da 1x tampone TAE (40 mM Tris, acido acetico da 20 mM, 1mM EDTA), 1,5% agarose (Tabella deimateriali) e 1x colorante di colorazione nucleare (Tabella dei materiali).
  4. Aggiungere un volume appropriato di buffer di carico 10x (0,5% blu bromofenolo, 0,5% xilene cyanol FF e 50% glicerolo), e caricare la miscela di buffer RNA mitocondriale/buffer di carico sul gel di agarose 1,5%.
  5. Eseguire il gel in 1x tampone TAE a 5–6 V/cm per 20-25 min e valutare l'integrità dell'RNA mitocondriale immaginando il gel con un sistema di documentazione del gel (Tabella dei materiali).
    NOT: La presenza di due bande distinte (rispettivamente 3.510 e 1.970 NT di mais per 26S e 18S rRNA di mais) è uno standard accettabile per l'RNA mitocondriale intatto. Per escludere una possibile degradazione, l'integrità dell'RNA deve essere studiata durante le molteplici fasi della preparazione dell'RNA circolare (Figura2).

4. RNA 5' Trattamento polifosculo

  1. Impostare il trattamento RNA 5' polyphosphatase (Tabella e materiali) ( Tabella1) e incubare a 37 gradi centigradi per 30-60 min.
  2. Recuperare l'RNA trattato con polifosfosi da 5' con un kit di purificazione dell'RNA (Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
  3. Ripetere i passaggi da 3.3 a 3.5.

5. Circolarizzazione dell'RNA

  1. Preparare due reazioni circolarizzazioni utilizzando le stesse quantità di RNA mitocondriali trattati con polifofofofosi e non trattati da 5' e non trattati (Tabella2), e incubare entrambe le reazioni a 16 gradi centigradi per 12–16 h.
  2. Recuperare i due set di RNA auto-ligate utilizzando lo stesso kit del passaggio 4.2.
    NOT: Va notato che solo una frazione di RNA mitocondriale sarà auto-migate, e l'RNA recuperato sarà una miscela di trascrizioni lineari e circolari.
  3. Ripetere i passaggi da 3.3 a 3.5.

6. Trascrizione inversa

  1. Sintetizzare due serie di cDNA dalle stesse quantità di RNA trattati con polifosfasi da 5' e non trattati (200 ng).
  2. Preparare una miscela di primer aggiungendo un rapporto uguale di 26S-CRT e fino a 7 altri primer RT.
    NOT: La concentrazione finale della miscela di primer dovrebbe essere di 1 M.
  3. Preparare due pre-miscele combinando i reagenti elencati nella tabella 3, incubare a 65 gradi centigradi per 5 min, quindi raffreddare sul ghiaccio per 2 min.
  4. Assemblare due sistemidi reazione RT (tabella 4) e incubarli a 42 gradi centigradi per 50 min.
  5. Riscaldare entrambe le reazioni di RT a 70 gradi centigradi per 5 minuti, quindi raffreddarle sul ghiaccio.

7. Normalizzazione

  1. Preparare due reazioni PCR aggiungendo lo stesso volume di modello cDNA derivati da 5' RNA trattati con polifofofozosi o non trattati, primer divergenti che fiancheggiano la giunzione 5'-3' di rRNA circolare 26S (cioè 26S-CF1 e -CR1), ecc. (Tabella5).
  2. Eseguire le due reazioni in un ciclore termico (Tabella dei materiali) a condizioni descritte nella tabella 6.
  3. Preparare un gel di agarose composto da 1x tampone TAE, 1,0% agarose e 1x colorante di colorazione nucleare.
  4. Aggiungere 2 buffer di carico l-l 10x (0,5% di bromofenolo blu, 0,5% xilene cyanol FF e 50% glicerolo) a ciascuno dei due prodotti PCR e caricarli sul gel.
  5. Eseguire il gel in 1x tampone TAE a 5–6 V/cm per 30-40 min, e immagine utilizzando lo stesso sistema di documentazione gel come passo 3.5.
  6. Confrontare l'abbondanza dei due prodotti PCR utilizzando software (Tabella dei materiali, Figura 4A) e ottimizzare la normalizzazione modificando, se necessario, la quantità di cDNA del modello.

8. Amplificazione PCR

  1. Preparare coppie di reazioni PCR aggiungendo il volume appropriato dei cDNA normalizzati e una coppia di primer divergenti che fiancheggiano la giunzione 5'-3' delle trascrizioni bersaglio (Tabella 7).
    NOT: La quantità di cDNA modello utilizzata per l'amplificazione PCR delle trascrizioni bersaglio è determinata dai risultati della normalizzazione di rRNA 26S.
  2. Eseguire le reazioni PCR secondo il programma descritto nella tabella 8.
  3. Ripetere i passaggi da 7.3 a 7.5.
  4. Passare a primer divergenti nidificati e verificare i risultati PCR del primo round ripetendo i passaggi 8.1 e 8.2.
  5. Ripetere i passaggi da 7.3 a 7.5.
  6. Recuperare le bande prominenti che potrebbero essere ripetute in due cicli di amplificazione PCR utilizzando un kit di recupero del DNA gel (Tabella dei materiali).

9. Determinazione del Trascrizione Termini

  1. Clonare i prodotti PCR gordati in gel in un vettore smussato (Table of Materials) utilizzando tecniche standard.
  2. Eseguite la colonia PCR per selezionare cloni positivi contenenti gli inserti bersaglio e sequenziarli commercialmente.
    NOT: I cloni positivi contenenti inserti di dimensioni variabili sono solitamente rilevati da una singola banda recuperata perché molte trascrizioni a stato costante in ambiente mitocondriale vegetale hanno dimensioni eterogenee 5' e/o 3' estremità1,12.
  3. Allineare i dati di sequenziamento con il genoma mitocondriale del mais utilizzando lo strumento di ricerca di allineamento locale di base (BLAST) del centro nazionale per l'informazione biotecnologica (NCBI). Scegliere organismo "mais (taxid:4577)" e database di ricerca "Raccolta Nucleotide (nr/nt)".
  4. Trova la giunzione 5'3' della trascrizione circolare e determina le posizioni dei termini di trascrizione 5' e 3'.
  5. Calcolare la dimensione delle trascrizioni di destinazione.

10. Verifica dei risultati della mappatura cRT-PCR mediante l'ibridazione di RNA Gel Blot

NOT: L'ibridazione della macchia di gel di RNA viene eseguita utilizzando un kit commerciale (Tabella dei materiali), che contiene i reagenti per la trascrizione dell'etichettatura dell'RNA con digossigenina (DIG) e Polimerasi rna T7, ibridazione e rilevamento immunologico. Si prega di fare riferimento ai protocolli forniti in questo kit per maggiori dettagli. Assicurarsi che solo RNase attrezzature gratuite viene utilizzato per l'intera procedura.

  1. Amplificare il frammento di DNA utilizzato per preparare la sonda dell'RNA e clonarlo sullo stesso vettore del punto 9.1, che contiene un promotore T7 di 17 bp a monte del sito di inserimento.
  2. Linearizzare il costrutto utilizzando un enzima di restrizione adeguato, recuperare il plasmide linearizzato con un kit di purificazione del DNA (Tabella dei materiali) e dissolverlo in DePC-trattato deionizzato H2O.
  3. Etichettare le sonde RNA con DIG-11-UTP da un kit commerciale (Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
  4. Preparare 500 mL di buffer MOPS 10x (0,2 M MOPS, acetato di sodio 50 mM e 10 mM EDTA) utilizzando H2O. Regolare il pH 7.0 da NaOH e sterilizzare per filtrazione.
  5. Aggiungere 2-3 volumi di buffer di carico (50% formamide, 6,2% formaldeide, 1x MOPS, 10% glicerolo e 0,1% di blu bromofenolo) all'RNA mitocondriale preparato nei passaggi 3.1–3.3.
  6. Denaturare il campione di RNA/miscela di tampone di carico a 65 gradi centigradi per 10 min, quindi raffreddare sul ghiaccio per 1 min.
  7. Preparare un gel di agarose denaturato (2% formaldeide, 1,2% agarose e 1x MOPS) e caricare il campione di RNA/caricamento della miscela di buffer nel gel (1-2 g di RNA mitocondriale per pozzo).
  8. Eseguire il gel in 1x MOPS a 3-4 V/cm per 4 h.
  9. Preparare 2 L di 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 M di citrato di sodio, pH 7.0). Trattarlo con 0,1% DEPC durante la notte e sterilizzare con autoclave.
  10. Sciacquare il gel due volte in 20x SSC (15 min ogni volta), e trasferire l'RNA gel a una membrana di nylon (Tabella dei materiali) con bonifico capillare con 20x SSC per 10–16 h.
  11. Fissare l'RNA a membrana cuocendo a 120 gradi centigradi per 30 min.
  12. Eseguire l'ibridazione dell'RNA e il rilevamento immunologico con un kit commerciale (Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.

11. Discriminazione delle estremità primarie ed elaborate 5'

  1. Discriminare le estremità primarie ed elaborate 5' confrontando i prodotti cRT-PCR ottenuti dagli RNA normalizzati 5' trattati con polifofofosi e non trattati.
    NOT: Per le trascrizioni primarie, l'abbondanza di prodotti PCR provenienti da 5' RNA trattato con polifosforasi è molto superiore a quella della controparte non trattata (Figura1, "Gene A" e Figura 4A). Tuttavia, per le trascrizioni trattate, un livello comparabile di prodotti PCR sarebbe amplificatodalle due serie di RNA mitocondriali (Figura 1, "Gene B").
  2. Progettare i primer RT-qPCR in base ai risultati del mapping cRT-PCR.
  3. Verificare i risultati della discriminazione cRT-PCR da parte di RT-qPCR.
    NOT: I due campioni di cDNA derivati da 5' RNA trattati con polifosfozola e non trattati sono normalizzati dai prodotti RT-qPCR di rRNA maturo 26S.

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Risultati

Stima dell'efficienza di circolarizzazione dell'RNA mitocondriale

In uno studio precedente, sia gli RNA totali che quelli mitocondriali sono stati utilizzati per la mappatura cRT-PCR della trascrizione mitocondriale termini in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) e i due tipi di RNA hanno dato risultati di mappatura simili12. Inizialmente, abbiamo anche usato RNA totali pe...

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Discussione

In uno studio precedente, gli RNA totali e mitocondriali della coltura delle sospensioni cellulari dell'Arabidopsis sono stati utilizzati per mappare i termini trascrizione mitocondriale da cRT-PCR, e risultati simili sono stati ottenuti12. Tuttavia, solo l'RNA mitocondriale arricchito è stato utilizzato per mappare la trascrizione mitocondriale termini in molti altri studi1,2,3,

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 31600250, Y. , Science and Technology Projects of Guangzhou City (grant n. 201804020015, H.N.) e dal China Agricultural Research System (grant no. CARS-04-PS09, H.N.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acido aceticoAladino, CinaA112880Per preparare 1x tampone TAE
Applied Biosystems 2720 TermociclatoreThermo Fisher Scientific, USA4359659Termociclatore per l'amplificazione della PCR
Acido ascorbicoSigma-aldrich, USAV900134Per la preparazione del tampone di estrazione
Biowest AgaroseBiowest, Spagna9012-36-6Per risolvere la PCR prodotti e RNA
Albumina sierica bovinaSigma-aldrich, USAA1933Per la preparazione di tampone di estrazione
Blu di bromofenoloSigma-aldrich, USAB8026Per la preparazione di tampone di carico per elettroforesi su gel di agarosio e Northern
blot DEPCSigma-aldrich, USAV900882Disattivazione della RNasi
DIG Northern starter kitRoche, USA12039672910Per la marcatura di DIG-RNA e Northern blot. Questo kit contiene i reagenti per la trascrizione-marcatura dell'RNA con DIG e RNA polimerasi T7, l'ibridazione e la rilevazione chemiluminescente.
EDTASigma-aldrich, USAV900106Per la preparazione del tampone di estrazione e 1x tampone TAE
EGTASigma-aldrich, USAE3889Per la preparazione del tampone di lavaggio
Sistema di documentazione su gelBio-Rad, USAGel Doc XR+Per l'imaging del gel di agarosio
GlycerolSigma-aldrich, USAG5516Per la preparazione del tampone di carico per l'elettroforesi su gel di agarosio
GoldView II (5.000x)Solarbio,. CinaG8142Colorazione del DNA
Hybond-N+, membrana in nylonAmersham Biosciences, USARPN119Per Northern blot
Image LabBio-Rad, USAImage Lab 3.0Image Gel e confrontare l'abbondanza di prodotti PCR.
KH2PO4Sigma-aldrich, USAV900041Per la preparazione del tampone di estrazione
KOHAladdin, CinaP112284Per la preparazione del tampone di estrazione
L-cisteinaSigma-aldrich, USAV900399Per la preparazione del tampone di estrazione
MillexMillipore, USASLHP033RBPer l'estrazione sterile e tamponi di lavaggio mediante filtrazione
MiraclothCalbiochem, USA475855-1RPer filtrare i tessuti del nocciolo macinato
MOPSSigma-aldrich, USAV900306Per la preparazione del tampone di corsa per Northern blot
NanoDrop Thermo Fisher Scientific, USA2000CPer il test di concentrazione e purezza dell'RNA
NaOHSigma-aldrich, USAV900797Per preparazione del tampone di lavaggio
pEASY-Blunt vettore di clonaggio sempliceTransGen Biotech, CinaCB111Clonazione della banda recuperata in gel. Contiene un promotore T7 diversi bps a monte del sito di inserimento.
Phanta max super-fedeltà DNA polimerasiVazyme, CinaP505DNA polimerasi per amplificazione PCR
Polivinilpirrolidone 40Sigma-aldrich, USAV900008Per la preparazione del tampone di estrazione
Primer Premier 6.24PREMIER Biosoft, USAPrimer Premier 6.24Per progettare primer per la trascrizione inversa e l'amplificazione PCR
Trascrittasi inversa PrimeScript IITakara, Giappone2690Per sintetizzare il primo kit di cDNA a filamento
PureLink RNA Mini ThermoFisher Scientific, USA12183025Per la purificazione dell'RNA
RNA 5' polifosfatasiEpicentro, USARP8092HPer convertire il trifosfato 5' in monofosfato
RNasi inibitoreNew England Biolabs, UKM0314Un componente dell'autolegatura dell'RNA e delle reazioni di trattamento con polifosfatasi 5' e viene utilizzato per inibire l'attività della RNasi.
Acetato di sodioSigma-aldrich, USAV900212Per la preparazione del tampone di corsa per Northern blot
Cloruro di sodioSigma-aldrich, USAV900058Per preparare 20x SSC
SsoFas evaGreen supermisceleBio-Rad, USA1725202Per RT-qPCR
T4 RNA Ligasi 1New England Biolabs, UKM0437Per la circolarizzazione dell'RNA
Tetrasodio pirofosfatoSigma-aldrich, USA221368Per la preparazione del tampone di estrazione
TIANgel kit di purificazione midiTiangen Biotech, CinaDP209Per purificare frammenti di DNA dal gel di agarosio
TrisAladdin, CinaT110601Per preparare 1x reagente TRIzol tampone TAE
Invitrogen, USAPer estrarre l'RNA mitocondiale.
Kit universale di purificazione del DNATiangen Biotech, CinaDP214Per recuperare i plastmidi linearizzati dalla reazione di digestione dell'enzima di restrizione
Xilene cianolo FFSigma-aldrich, USAX4126Per la preparazione del tampone di carico per l'elettroforesi su gel di agarosio
15596026

Riferimenti

  1. Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
  2. Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants. Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).
  3. Calixte, S., Bonen, L. Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).
  4. Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).
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