È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Un metodo per studiare la formazione de novo dei domini della cromatina

5.1K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/60039

⸱

23 agosto 2019

 , 
1Howard Hughes Medical Institute, New York University School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, New York University School of Medicine, 3Whitehead Institute for Biomedical Research

In questo articolo

Sommario

Questo metodo è progettato per seguire la formazione di domini di cromatina mediati da PRC2 nelle linee cellulari e il metodo può essere adattato a molti altri sistemi.

Abstract

L'organizzazione e la struttura dei domini della cromatina sono uniche per le singole linee cellulari. La loro cattiva regolamentazione potrebbe portare a una perdita di identità cellulare e/o malattia. Nonostante gli enormi sforzi, la nostra comprensione della formazione e della propagazione dei domini della cromatina è ancora limitata. I domini di cromatina sono stati studiati in condizioni stabili, che non sono favorevoli a seguire gli eventi iniziali durante la loro istituzione. Qui, presentiamo un metodo per ricostruire indebitamente i domini della cromatina e seguire la loro ri-formazione in funzione del tempo. Anche se, prima applicato al caso di formazione del dominio cromatina repressiva mediata da PRC2, potrebbe essere facilmente adattata ad altri domini di cromatina. La modifica di e/o la combinazione di questo metodo con la genomica e le tecnologie di imaging fornirà strumenti preziosi per studiare in dettaglio la creazione di domini di cromatina. Crediamo che questo metodo rivoluzionerà la nostra comprensione di come i domini della cromatina si formano e interagiscono tra loro.

Introduzione

I genomi eucarioti sono altamente organizzati e i cambiamenti nell'accessibilità della cromatina controllano direttamente la trascrizione genica1. Il genoma contiene diversi tipi di domini di cromatina, che sono correlati all'attività trascrizionale e alla temporizzazione della replicazione2,3. Questi domini di cromatina variano in dimensioni da pochi kilobase (kb) a più di 100 kb e sono caratterizzati da un arricchimento in distinte modifiche istoni4. Le domande centrali sono: come si formano questi domini e come vengono propagati?

Uno dei domini di cromatina più caratterizzati è favorito attraverso l'attività del complesso repressivo Polycomb 2 (PRC2). PRC2 è un complesso multi-sottounità composto da un sottoinsieme del Polycomb Group (PcG) delle proteine5,6, e catalizza la mono-, di- e trimetilazione di lisina 27 di istone H3 (H3K27me1/me2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 sono associati a uno stato di cromatina repressiva, ma la funzione di H3K27me1 non è chiara6,11. Uno dei componenti fondamentali della PRC2, sviluppo ectodernico embrionale (EED), si lega al prodotto finale della catalisi PRC2, H3K27me3, attraverso la sua gabbia aromatica e questa caratteristica si traduce nella stimolazione allosteric della PRC212,13. L'attività enzimatica PRC2 è cruciale per preservare l'identità cellulare durante lo sviluppo in quanto l'espressione inappropriata di alcuni geni dello sviluppo che sono controindicati per un lignaggio specifico, sarebbe dannosa5,6 . Pertanto, svelare i meccanismi attraverso i quali la RPC2 favorisce la formazione di domini di cromatina repressiva nei mammiferi è di fondamentale importanza per comprendere l'identità cellulare.

Tutti i sistemi sperimentali passati progettati per studiare la formazione di domini di cromatina, compresi i domini di cromatina mediati dalla RPC, sono stati eseguiti in condizioni stabili, che non sono in grado di monitorare gli eventi di svolgimento della formazione del dominio della cromatina Cellule. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per generare un sistema cellulare inducibile che monitora il reclutamento iniziale e la propagazione dei domini di cromatina. In particolare, ci concentriamo sul monitoraggio della formazione di domini di cromatina repressiva mediati da PRC2 che comprendono H3K27me2/3. Questo sistema in grado di cogliere i dettagli meccanicistici della formazione del dominio della cromatina, potrebbe essere adattato per incorporare altri domini della cromatina, come i domini ampiamente studiati che comprendono H2AK119ub o H3K9me. In combinazione con la genomica e le tecnologie di imaging, questo approccio ha il potenziale per affrontare con successo varie domande chiave nella biologia della cromatina.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Generazione di mESC di salvataggio EED inducibili

1. Cultura cellulare

  1. Utilizzare cellule staminali embrionali C57BL/6 topo senza alimentatore (mESC) in possesso di un transgene CreERT2 opportunamente integrato, che può traslocare nel nucleo dopo la somministrazione di 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)13.
  2. Crescere mESC in medio ESC convenzionale14,15, integrato con 1000 U/mL LIF, 1 inibitore ERK PD0325901 e 3 M GSK3 inibitore CHIR99021. Per il mezzo ESC convenzionale, utilizzare DMEM ad eliminazione diretta contenente 15% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutamina, 1X penicillina/streptomicina e 0,1 mM 2-mercaptoetanolo.
  3. Utilizzare piastre rivestite con soluzione di gelatina dello 0,1% per la coltura di mESC.

2. Generazione di mESC ePEC e EED clonale (KO)

  1. Guida di progettazione RNA (gRNA) per eliminare Exon 10 e Exon 11 di copia endogena di EED in mESC utilizzando lo strumento di progettazione CRISPR in Benchling16. EED-KO-gRNA-1 bersaglio dell'intron e'1 immediatamente a monte dell'esone 10 e dell'EED-KO-gRNA-2 bersaglia l'introne immediatamente a valle dell'Exon 11. L'applicazione simultanea di questi gRNA elimina sia Exon 10 che Exon 11 con un'unione finale non omologa (NHEJ).
  2. Clonare i gRNA in pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) seguendo le istruzioni riportate in Ran et al., 201317.
  3. In un formato a 6 piani, transfect 2 x 105 mESC con 1 mg di ogni EED-KO-gRNA-1 e EED-KO-gRNA-2 (vedi Tabella dei materiali) utilizzando il reagente di trasfezione seguendo le istruzioni del produttore. Cambiare il supporto 24 h dopo la trasfezione.
  4. Due giorni dopo la trasfezione, isolare le cellule positive GFP utilizzando lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS). Aspettatevi che l'efficienza della trasfezione vari intorno al 10-30 %. Ordinare circa 5 x 105 celle per catturare sufficienti cellule positive GFP per la placcatura.
  5. Piastra i mESC positivi GFP isolati in piastre da 15 cm pre-rivestite con 0,1% di gelatina (10-20 x103 cellule per piastra) per la raccolta delle coccie.
  6. Far crescere le cellule in mezzo ESC per circa una settimana fino a quando le singole colonie sono visibili. Cambiare i media ogni 2 giorni.
  7. Scegli un minimo di 48 colonie utilizzando la punta di micropipetta da 20 . Raschiare la colonia mentre si aspira nella punta della micropipetta. Non suddividere la colonia in singole cellule. Trasferire la colonia in un piatto di accutasi contenente (20 mL) 96.
  8. Incubare le colonie per 10 min a 37 gradi centigradi fino a quando tutte le cellule sono dissociate.
  9. Aggiungere 200 mL di supporti ESC in ogni pozzo utilizzando pipetta multicanale.
  10. Mescolare bene e placcare le celle in due lastre di pozzo 96 separate utilizzando pipetta multicanale.
  11. Utilizzare una delle 96 lastre di pozzo per la genotipizzazione e mantenere l'altro in crescita fino a quando la genotipizzazione è conclusa. Utilizzare la soluzione di estrazione del DNA per estrarre il DNA dalla piastra da 96 pozzo seguendo le istruzioni del produttore.
  12. Utilizzare i numeri primi genotipizzati Gnt_EED-KO-up e Gnt_EED-KO_down, che si estendono sul sito eliminato ed eseguono la genotipizzazione della PCR con la polimerasi del DNA Taq seguendo le istruzioni del produttore.
    NOTA: Altri tipi di polimerasi del DNA possono essere utilizzati anche per la genotipizzazione, tuttavia, la polimerasi del DNA Taq offre comodità in quanto la reazione PCR può essere caricata direttamente su un gel quando viene utilizzato il suo buffer di reazione colorato.
    1. Osservare un prodotto di DNA con minore peso molecolare nelle cellule con una delezione omozia rispetto al caso wild-type (WT).
      NOTA: Per generare celle nulle PRC2, è necessaria la cancellazione omoziana degli esoni 10 e 11 per destabilizzare e degradare EED, una sottounità essenziale del core PRC213. L'efficienza mirata AL CRISPR è di circa il 10 %.
  13. Convalidare la cancellazione di EED exon 10 e 11 e la perdita di proteina EED da parte del sequenziamento e del gonfiamento occidentale, rispettivamente.
  14. Confermare l'esaurimento di EED e H3K27me2/me3 dalla cromatina nelle cellule EED KO da ChIP-seq utilizzando anticorpi contro H3K27me2/me3 ed EED. Utilizzare il protocollo indicato in Oksuz et al., 201715 per gli esperimenti ChIP-seq.

3. Ingegneria degli eED knockout mESC per ospitare l'espressione EED inducibile basata su Cre-ERT2

  1. Progettare gRNA (EED-gRNA-inducible) per introdurre un taglio all'interno dell'intron seguendo l'esone 9 di EED utilizzando lo strumento di progettazione CRISPR in Benchling16 (vedere Tabella dei materiali).
  2. Clonare i gRNA in pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) seguendo le istruzioni riportate in Ran et al., 201317.
  3. Progettare un DNA modello donatore che comprenda la sequenza EED cDNA dopo l'esone 9 e un tag Flag-HA del terminale C a monte di una sequenza T2A-GFP, il tutto in orientamento inverso rispetto alla sequenza genica endogena.
    1. Affiancare la cassetta con un accettatore di giunzione e una sequenza poliadenilazione annidata tra siti loxP invertiti etelologi (lox66 e lox71)18.
    2. Includere almeno 500 bp di bracci di omologia da ogni estremità. Dividere il modello donatore in 2 segmenti di frammenti genici gBlocks (vedere gBlock-1, gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" e gBlock-2-cage-mutant "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") e assemblarli in vettore PCR Blunt utilizzando la clonazione Gibson seguendo le istruzioni del produttore.
      NOTA: gblock-2 contiene un residuo aromatico (Y365) all'interno della gabbia di EED che è importante per l'interazione con H3K27me312. gBlock-2-Wt contiene residui di tipo selvaggio, mentre gblock-2-gabbia-mutante contiene la gabbia-mutante di EED (Y365A), incapace di legarsi a H3K27me3. Il salvataggio inducibile di WT EED è indicato come i-WT-r e il salvataggio EED indotbile in gabbia-mutante è indicato come i-MT-r per comodità.
  4. In un formato a 6 piani, trasfect 2 x 105 mESC con 1 mg di gRNA (EED-gRNA-inducibile) e 1 mg dei modelli donatore (i-WT-r o i-MT-r) utilizzando la reagente di trasfezione e isolare le cellule positive GFP utilizzando FACS.
  5. Segui i passaggi 2.3-2.11 per isolare le singole colonie pronte per la genotipizzazione per il targeting di successo.
  6. Utilizzare i primer di genotipizzazione Inducible_Genotype-FW-1 e Inducible_Genotype-REV-1, che si estendono sulla cassetta inserita ed eseguono la genotipizzazione PCR utilizzando la polimerasi del DNA Taq.
    NOTA: l'efficienza di targeting per CRISPR è di circa il 10 %.
    1. Confermare la corretta integrazione della cassetta da PCR utilizzando i primer Inducible_Genotype-FW-2 e Inducible_Genotype-REV-2, che si trovano al di fuori dei bracci omeologia.
      NOTA: L'integrazione omozigotale della cassetta è necessaria per realizzare un salvataggio efficiente di EED. Si noti che le cellule con integrazione omozio produrranno un singolo prodotto di DNA di grandi dimensioni rispetto a WT EED, che produrrà un prodotto corto.
  7. Confermare l'integrazione della cassetta da parte del sequenziamento Sanger.
  8. Confermare il lancio della cassetta e l'espressione di EED e di altri componenti di base PRC2 (ad es., E-H-2 e SU-12) sull'amministrazione 4-OHT mediante gonfiore occidentale.
  9. Confermare l'espressione di T2A-GFP e la percentuale di capovolgimento per citometria di flusso. Si noti che l'espressione di GFP è indicativa di capovolgimento della cassetta e l'espressione di EED.

4. A seguito della nucleazione e della diffusione dell'attività della RPC2 sulla cromatina

  1. Verificare che i-WT-r e i-MT-r mESC non abbiano un'espressione perdente di GFP per citometria di flusso. In caso di espressione perdente di GFP, isolare le cellule GFP-negative da FACS prima di iniziare l'esperimento.
  2. Espandere i mESC i-WT-r e i-MT-r in cinque piastre da 15 cm (5x 106 celle per piastra).
  3. Indurre l'espressione di WT o gabbia-mutante EED per somministrazione di 0,5 mM 4-OHT per 0 h, 12 h, 24 h, 36 h e 8 giorni (una piastra di 15 cm per condizione). Cambiare il supporto dopo 12 h per trattamenti più lunghi di 12 h. Isolare le cellule ricombinate con successo utilizzando GFP. Regolare il tempo dei trattamenti in modo che tutte le condizioni siano raccolte contemporaneamente.
  4. Eseguire ChIP-seq per H3K27me2, H3K27me3 per indagare la loro deposizione temporale alla cromatina in risposta alla riequisetta di WT o EED a gabbia-mutante. Utilizzare il protocollo ChIP-seq, inclusa la preparazione della libreria descritta in Oksuz et al., 201715.
  5. Utilizzare il controllo spike-in in ogni campione per consentire il confronto quantitativo tra diversi punti temporali19.
    1. Per il controllo del picco, utilizzare la cromatina dalla Drosophila melanogaster (in un rapporto 1:50 rispetto alla cromatina derivata da mESC) e l'anticorpo H2Av specifico di Drosophila (1 Luna di anticorpo H2Av per 4 g di istruzioni del produttore) in ogni campione.
    2. Preparare la cromatina dalla Drosophila in un modo simile a quello da mESC utilizzando il protocollo dettagliato in Oksuz et al., 201715.
  6. Mappare la sequenza di ChIP-seq al genoma di mm10 con Bowtie 2 utilizzando i parametri di default20.
  7. Normalizzare le letture di ChIP-seq del mouse in Drosophila read conta21. Calcolare il fattore di normalizzazione spike-in utilizzando la seguente formula: 1 x 106/univoco Drosophila read conta. Aspettatevi di ottenere circa 1 x 106Drosophila conteggio delle letture e 20 x 106 conteggi di lettura del mouse per esperimento.
    1. Non includere la cromatina di Drosophila durante il sequenziamento dei campioni di input.
  8. Utilizzare lo strumento genomecov dei bedtools per convertire il file bam nel bedgraph22. Successivamente, convertire il bedgrafa in file bigwig utilizzando lo strumento bedGraphToBigWig da USCS23,24. Vedere lo script seguente:
    "percorso al genoma di mm10"
    "percorso verso le dimensioni dei cromosomi mm10"
    inp_bam"percorso del file bam di input "
    multiply: "calcola il fattore di normalizzazione del picco"
    bedtools genomecov -bg -scale $multiply -ibam $inp_bam -g $gen > output.bedGraph
    sort -k1,1 -k2,2n output.bedGraph > output_sorted.bedGraph
    bedGraphToBigWig output_sorted.bedGraph $chr output.bw
  9. Visualizza le densità di lettura ChIP-seq caricando i file bigwig sul browser genoma USCS24.

5. Monitoraggio dell'emergere e della crescita dei foci H3K27me3 nei nuclei mESC

  1. Piatto 1x 104 mESC in scivoli a camera 8-well pre-rivestiti con gelatina dello 0,1%.
  2. Il giorno successivo, iniziare a eseguire induzioni consecutive 4-OHT (0,5 mM) per raccogliere le cellule che esprimono EED per i punti temporali indicati (0 h, 12 h, 24 h e 36 h). Cambiare il supporto dopo 12 h per trattamenti più lunghi di 12 h.
  3. Fissare i mESC con 4% paraformaldeide in salina tamponati di fosfato (PBS) a temperatura ambiente (RT) per 10 min.
  4. Permeabilizzare le celle con PBS/0.25% Triton X-100 a RT per 30 min.
  5. Bloccare le celle con siero d'asino PBS/5%/0,1% Triton X-100 (buffer di blocco) a RT per 30 min.
  6. Diluire l'anticorpo primario H3K27me3 1:500 nel buffer di blocco e aggiungere alle cellule.
  7. Incubare le cellule con anticorpo primario durante la notte a 4 gradi centigradi.
  8. Il giorno successivo, eseguire 3 lavatori con PBS/0.1% Triton X-100.
  9. Diluire l'anticorpo secondario (Alexa fluor 595) 1:1000 nel buffer di blocco e aggiungere alle cellule.
    1. Eseguire tutte le incubazioni al buio nei passaggi successivi come anticorpi secondari coniugati con Alexa Fluor sono sensibili alla luce.
  10. Incubare l'anticorpo secondario per 2 h a RT.
  11. Esegui 3 lavamenti con PBS/0,1% Triton X-100.
  12. Diluire DAPI (1 mg/mL) 1:4000 con PBS/0.1% Triton X-100 e aggiungere alle celle.
  13. Incubare le cellule con DAPI per 10 min a RT.
  14. Montare le celle con Aqua mount.
  15. Immagina le cellule con microscopia confocale con ingrandimento 63X.
  16. Elaborare e pseudo-colorare le immagini utilizzando una distribuzione di ImageJ, Fiji25.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Un sistema generale del sistema di salvataggio condizionato
La figura 1 mostra lo schema di targeting per salvare in modo condizionale le cellule EED KO con WT o EED (Y365A) echeggiato dal locus EED endogeno. Dopo aver eliminato EED, viene introdotta una sottounità centrale di PRC2 essenziale per la sua stabilità e attività ezimatica, viene introdotta una cassetta all'interno dell'intron dopo l'esone 9 di EED (Figura 1). La cassetta è costitu...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Un approccio potente per comprendere i dettagli meccanicistici durante la formazione di un dato dominio cromatico, è quello di interrompere prima il dominio e poi monitorare la sua ricostruzione in corso all'interno delle cellule. Il processo può essere sospeso in qualsiasi momento durante la ricostruzione per analizzare in dettaglio gli eventi in corso. Studi precedenti sui domini di cromatina non sono stati in grado di risolvere tali eventi in quanto sono stati eseguiti in condizioni di stato costante (ad esempio, conf...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

D.R. è co-fondatore di Constellation Pharmaceuticals e Fulcrum Therapeutics. Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Ringraziamo i dottori L. Vales, D. Ozata e H. Mou per la revisione del manoscritto. Il D.R. Lab è supportato dall'Howard Hughes Medical Institute e dal National Institutes of Health (R01CA199652 e R01NS100897).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
(Z)-4-idrossitamoxifene (5 mg)SigmaH7904-5MGPer l'induzione dell'espressione EED
Soluzione acquosa di paraformaldeide al 16% (10x10 ml)Microscopia elettronica Scienze15710Per immunofluorescenza
2-mercaptoetanoloLifeTechnologies21985-023Per colture mESC
Soluzione di gelatina al 2%SigmaG1393-100mlPer mESC coltura
Accutase 500 MLInnovative Cell Tech/FISHERAT 104-500Per colture mESC
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson immunoresaerch711-585-152Per immunofluorescenza
Aqua-Mount Mounting MediumFISHER/VWR41799-008Per immunofluorescenza
CAMERA SLD TC PRMA 8-CHM 16 PKFisher Sci177445PKPer l'immunofluorescenza
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilidolo, Dicloridrato) - 10 mgLife TechD1306Per l'immunofluorescenza
ERK inibitore, PD0325901Stemgent04-0006Per la coltura di mESC
ESGRO Proteina LIF ricombinanteMillipore/FisherESG1107Per la coltura di mESC
FBS Cellule staminali qualificateAtlantaS10250Per la coltura di mESC
Gibson Assembly Master MixNEBE2611LPer la clonazione del modello del donatore
Inibitore GSK3, CHIR99021Stemgent04-0004Per la coltura di mESC
H3K27me2 (D18C8) coniglio mABSegnalazione cellulare9728SAnticorpo per ChIP-seq
H3K27me3Segnalazione cellulare9733SAnticorpo per ChIP-seq
Istone H2Av anticorpo (pAb)Motivo attivo39715Controllo spike-in per ChIP-seq
Knockout DMEMInvitrogen10829-018Per colture mESC
L-glutamminaSigmaG7513Per colture mESC
Lipofectamine 2000LifeTech11668019Per trasfezione
MangoTaq DNA polimerasiBiolineBIO-21079Per genotipizzazione PCR
Siero d'asino normale (10 mL)Jackson ImmunoResearch017-000-121Per immunofluorescenza
Penicillina-StreptomicinaSigma/RocheP0781Per colture mESC
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)Addgene48138Per clonazione di gRNA
Soluzione di estrazione del DNA QuickExtractLucigenQE0905TPer la genotipizzazione PCR
Triton X-100SigmaT8787-250ML
Kit di clonazione PCR Zero BluntThermo FisherK270020Per clonazione modello di donatore
Primers/gBlocks
EED-KO-gRNA-1Sequenza: ctctggctactgtcaactag. gRNA si accoppia per knockout EED in ESC C57BL/6 per sistemi i-WT-r e i-MT-r.
Sequenza EED-KO-gRNA-2: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. I gRNA si accoppiano per knockout EED nelle ESC C57BL/6 per i sistemi i-WT-r e i-MT-r.
da EED-gRNA: atggcaccccgaaattagaa. gRNA e donatore per generare il sistema i-WT-r nel background EED-KO.
i-WT-rhttps://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA e donatore per generare il sistema i-WT-r nel background EED-KO.
da EED-gRNA: atggcaccccgaaattagaa. gRNA e donatore per generare il sistema i-WT-r nel background EED-KO.
i-MT-rhttps://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA e donatore per generare il sistema i-MT-r nel background EED-KO.
Primer di genotipizzazione
Gnt-EED-KO-FW-1Sequenza: ctgtaggctgccatctgtga. L'allele wild type produrrà un prodotto di 1,9 kb. L'allele knockout produrrà un prodotto di 200 bp.
Gnt-EED-KO-REV-1Sequenza: agccagggctacacagagaa. L'allele wild type produrrà un prodotto di 1,9 kb. L'allele knockout produrrà un prodotto di 200 bp.
Inducible_Genotype-FW-1Sequenza: tgcagtgaaaaaatttggaa. Quando la cassetta viene inserita, gli inneschi produrranno 1863 bp. L'allele wild type produrrà un prodotto di ~200 bp.
Inducible_Genotype-REV-1Sequenza: gagaggggtggcactgtaaa. Quando la cassetta viene inserita, gli inneschi produrranno 1863 bp. L'allele wild type produrrà un prodotto di ~200 bp.
Inducible_Genotype-FW-2Sequenza: ccccctctttctccttttctct. Quando la cassetta viene inserita, gli inneschi produrranno 3200 bp. L'allele wild type produrrà un prodotto di 1560 bp.
Inducible_Genotype-REV-2Sequenza: atgcctgggtgaatgaaaaa. Quando la cassetta viene inserita, gli inneschi produrranno 3200 bp. L'allele wild type produrrà un prodotto di 1560 bp.
Sequenza inducibile Donatore Sequenza inducibile Donatore

Riferimenti

  1. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).
  2. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  3. Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
  4. Carelli, F. N., Sharma, G., Broad Ahringer, J. Chromatin Domains: An Important Facet of Genome Regulation. Bioessays. 39 (12), (2017).
  5. Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
  6. Holoch, D., Margueron, R. Mechanisms Regulating PRC2 Recruitment and Enzymatic Activity. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 531-542 (2017).
  7. Cao, R., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in polycomb-group silencing. Science. 298 (5595), 1039-1043 (2002).
  8. Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the enhancer of zeste protein. Genes and Development. 16 (22), 2893-2905 (2002).
  9. Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A., Pirrotta, V. Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell. 111 (2), 185-196 (2002).
  10. Müller, J., et al. Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell. 111 (2), 197-208 (2002).
  11. Ferrari, K. J., et al. Polycomb-Dependent H3K27me1 and H3K27me2 Regulate Active Transcription and Enhancer Fidelity. Molecular Cell. 53 (1), 49-62 (2014).
  12. Margueron, R., et al. Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marks. Nature. 461 (7265), 762-767 (2009).
  13. Oksuz, O., et al. Capturing the Onset of PRC2-Mediated Repressive Domain Formation. Molecular cell. 70 (6), 1149-1162 (2018).
  14. Tee, W. W., Shen, S. S., Oksuz, O., Narendra, V., Reinberg, D. Erk1/2 activity promotes chromatin features and RNAPII phosphorylation at developmental promoters in mouse ESCs. Cell. 156 (4), 678-690 (2014).
  15. Oksuz, O., Tee, W. W. Probing chromatin modifications in response to ERK signaling. Methods in Molecular Biology. 1487, 289-301 (2017).
  16. Benchling Inc. Benchling for Academics. Benchling. , Available from: https://benchling.com (2018).
  17. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  18. Zhang, Z., Lutz, B. Cre recombinase-mediated inversion using lox66 and lox71: method to introduce conditional point mutations into the CREB-binding protein. Nucleic acids research. 30 (17), 90(2002).
  19. Orlando, D. A., et al. Quantitative ChIP-Seq normalization reveals global modulation of the epigenome. Cell reports. 9 (3), 1163-1170 (2014).
  20. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  21. Descostes, N. ChIPSeqSpike: ChIP-Seq data scaling according to spike-in control. R package version 1.2.1. , (2019).
  22. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  23. Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
  24. UCSC Genome Browser Home. , Available from: https://genome.ucsc.edu (2019).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nature Methods. 6 (12), 917-922 (2009).
  27. Banaszynski, L. A., Chen, L., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. L., Wandless, T. J. A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
  28. Højfeldt, J. W., et al. Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Formazione di domini della cromatinacromatina mediata da PRC2knockout tramite CRISPR-Cas9analisi tramite citometria a flussoanalisi ChIP-seqmicroscopia a fluorescenzacellule staminali embrionali di topodelezione del gene EEDinduzione con 4-idrossitamoxifenedeposizione di H3K27me3
Un metodo per studiare la formazione de novo dei domini della cromatina
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.