Questo protocollo descrive un modello murino di fibrosi intestinale guidata da Salmonella che assomiglia ai segni chiave della malattia patologica della malattia di Crohn, tra cui l'infiammazione transmurale e la fibrosi. Questo metodo può essere utilizzato per valutare i fattori ospiti che alterano gli esiti fibrotici utilizzando topi mutanti mantenuti su un background genetico C57Bl/6.
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Articolo metodologico
Infezione da Salmonella cronica Fibrosi intestinale indotta
In questo articolo
Sommario
Abstract
La fibrosi tissutale caratterizzata dall'accumulo patologico di matrice extracellulare come il collagene è il risultato di un'infiammazione persistente e di una riparazione slogata. Nella malattia infiammatoria intestinale (IBD), la fibrosi porta a formazioni di stenosi ricorrenti per le quali non esiste una terapia efficace diversa dalla resezione chirurgica. A causa della sua esordio tardivo, i processi che guidano la fibrosi sono meno studiati e in gran parte sconosciuti. Pertanto, le complicazioni fibrotiche rappresentano una sfida importante nell'IBD. In questo protocollo, viene descritto un robusto modello in vivo di fibrosi intestinale in cui la streptonomina pre-trattamento dei topi C57Bl/6, seguiti da gavage orale con Salmonella Typhimurium, mutante di grado fibrosi del cecum. Metodologie per la preparazione di S. Typhimurium - AroA per l'inoculazione, quantificando i carichi patogeni nel cecum e nella milza e valutando la deposizione di collagene nei tessuti intestinali sono spiegati. Questo modello di malattia sperimentale è utile per esaminare i fattori ospiti che migliorano o esacerbano la fibrosi intestinale simile a un CD.
Introduzione
La colite ulcerosa (UC) e la malattia di Crohn (CD) sono le due principali forme di IBD e sono caratterizzate da disturbi infiammatori cronici e recidivi del tratto gastrointestinale 1,2. Questi disturbi hanno un impatto importante sulla qualità della vita dei pazienti. I sintomi di IBD includono dolore addominale, diarrea, nausea, perdita di peso, febbre, e affaticamento3. Studi recenti hanno identificato fattori genetici e ambientali che contribuiscono alla patogenesi della malattia; si ritiene che tali fattori di rischio contribuiscano all'interruzione della barriera epiteliale con conseguente traslocazione o sovracampionamento degli antigeni luminali4. Di conseguenza, Questo avvia una risposta infiammatoria aberranti alla flora commensale mediata dalle cellule immunitarie intestinali4. Caratteristiche di complicanze Associate iBD possono estendersi a siti al di là del tratto GI che interessano vari organi tra cui articolazioni, pelle, e fegato1,2. I segni distintivi di UC includono un'infiammazione grave e diffusa tipicamente localizzata nel colon1. La patologia della malattia colpisce la mucosa e la submucosa dell'intestino con conseguente ulcerazioni mucosali superficiali1. Al contrario, CD può colpire qualsiasi parte del tratto GI, anche se la prova della malattia si trova comunemente nel colon e disl ileum2. Inoltre, l'infiammazione in CD è transmurale, che colpisce tutti gli strati della parete intestinale2.
Diversi geni di suscettibilità agli IBD che sono stati identificati indicherebbero che la disregolazione della barriera epiteliale o dell'immunità sono fattori critici per la progressione della malattia5. Si è scoperto che le mutazioni nel dominio di oligomerizzazione dei nucleotidi 2 (NOD2) espresse dai monociti siano associate ad una maggiore suscettibilità al CD; questo evidenzia un legame tra il rilevamento immunitario innato alterato di componenti batterici e la malattia6. Studi più recenti sull'associazione a livello di genoma (GWAS) hanno rivelato ulteriori percorsi potenzialmente coinvolti nella patogenesi dell'IBD, comprese le variazioni genetiche in: STAT1, NKX2-3, IL2RA, il23R dependent pathways collegato all'immunità adattiva, MUC1, MUC19e PTGER4 nella manutenzione della barriera intestinale e all'autofagia mediata ATG16L7,8,9. Mentre questi studi di genetica basata sulla popolazione hanno migliorato la nostra comprensione dell'IBD, gli alleli di suscettibilità da soli sono probabilmente insufficienti nell'inentrare e sostenere la malattia cronica3. Altri fattori non genetici, tra cui alterazioni nella composizione del microbioma intestinale e una riduzione della diversità, sono stati associati all'infiammazione intestinale. Tuttavia, non è chiaro se la disbiosi intestinale precede o è la conseguenza di risposte immunitarie disregolate3. Anche se l'eziologia dell'IBD rimane poco chiara, la nostra comprensione della patogenesi della malattia è stata migliorata da modelli di topo sperimentali di infiammazione intestinale10,11. Questi modelli singolarmente non rappresentano pienamente la complessità della malattia umana, ma sono preziosi per chiarire i percorsi patofisiologici che potrebbero essere rilevanti per l'IBD e per la convalida di strategie terapeutiche provvisorie10, 11. Tali modelli murini in genere si basano sull'avvio di infiammazione da induzione chimica o infezione, trasferimento di cellule immunitarie, o manipolazione genetica. Inoltre, queste strategie spesso comportano perturbazioni nell'integrità epiteliale o modulazione dell'immunità innata o adattativa.
I sierovari enterici di Salmonella sono patogeni intestinali che possono infettare gli esseri umani e i topi. Dopo l'ingestione, la Salmonella può colonizzare l'intestino per invasione diretta di epitelia, cellule M o antigene che presenta le cellule12. Topi infettati per via orale con S. Typhimurium si traduce nella colonizzazione principalmente di siti sistemici come la milza e i linfonodi mesenterici con relativamente bassa abbondanza nel tratto GI12. Tuttavia, il pretrattamento dei topi con streptomicina migliora l'efficienza della colonizzazione della Salmonella dell'intestino diminuendo gli effetti protettivi ospiti del microbiota normale13. Le caratteristiche patologiche di questo modello includono l'interruzione o l'ulcera della barriera epiteliale, il reclutamento di granulociti e l'edema grave13. In alternativa, l'infezione con il vaccino di grado S. Typhimurium - Un mutante porta alla colonizzazione cronica del cecum e del colon che persiste fino al giorno 40 dopo l'infezione14. La S. Il ceppo Typhimurium -AroA ha un difetto nella biosintesi degli amminoacidi aromatici; questo rende il ceppo mutante avirulent e può essere utilizzato come un vaccino altamente efficace15. L'infezione orale nei topi porta a una risposta infiammatoria associata a Th1 e Th17, a un ampio rimodellamento dei tessuti e alla deposizione di collagene. Patologia dei tessuti è associata a livelli elevati di fattore pro-fibrotico come TGF-z1, CTGF, e IGF14. Le cicatrici fibrotiche transmurali riportate in questo modello ricordano le formazioni di stenosi spesso osservate nell'IBD. L'induzione della fibrosi da parte della Salmonella richiede virulenza codificata dalle isole di patogenicità della Salmonella (SPI)-1 e 2 12. È importante sottolineare che questa S. Il modello di infezione da Tymphimurium - AroA è un sistema utile per lo studio delle risposte fibrotiche nei topi mutanti mantenuti su uno sfondo C57/Bl6. Il ceppo C57/Bl6 è estremamente sensibile a S. Infezione da Typhiumurim SL1344 a causa di una mutazione di perdita di funzione nel gene che codifica la proteina macrofacio associata alla resistenza naturale (NRAMP)-116,17. Abbiamo scoperto che le cellule linfoidi innate dipendenti da IL-17A e ROR sono importanti contributori alla patogenesi in questo modello18.
Una complicazione importante del CD è la deposizione sregolata ed eccessiva della matrice extracellulare (ECM) compreso il collagene2,19. Anche se il tratto GI ha una capacità relativamente elevata di rigenerazione, cicatrici fibrotiche possono sorgere a causa di risposte di guarigione del ferita irrisolte che sono associate con infiammazione cronica e grave20,21. Nel CD, questo si traduce in effetti deleteri sull'architettura dei tessuti che portano a compromissione significativa dell'organo21,22. La natura transmurale dell'infiammazione osservata nel CD precede infine l'ispessimento della parete intestinale associato alla stenosi sintomatica o alla formazione di stenosi21. Circa un terzo dei pazienti cd necessitano di resezione intestinale per questa complicazione22. Non esistono terapie anti-fibrotiche efficaci nell'IBD, dato che l'uso di immunosoppressori come l'azathioprine o l'anti-TNF non ha alcun impatto o ha ridotto solo modestamente il requisito di interventi chirurgici19,23 . Mentre la fibrosi è pensata come la conseguenza dell'infiammazione cronica, le cellule di origine mesenchica come fibroblasti e periciti sono considerate le fonti cellulari primarie di ECM nelle cicatrici fibrotiche21,24. Cronico S. L'infezione da Typhimurium - AroA è un robusto modello murino di fibrosi intestinale che può offrire informazioni sulla patogenesi delle caratteristiche CD-like.
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Protocollo
Tutti i protocolli sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la cura degli animali dell'Università della Columbia Britannica.
1. Preparazione delle colture Salmonella Typhimurium - AroA per il gavage orale dei topi
- Da uno stock di glicerolo congelato di S. Typhimurium - AroA, preparare una piastra di striatura utilizzando agar LB contenente 100 streptomicina streptomicina con un anello sterile di inoculazione. Incubare per tutta la notte a 37 gradi centigradi. Le piastre di streak possono essere conservate fino a una settimana a 4 gradi centigradi.
- Un giorno prima dell'infezione, preparare l'antibiotico sciogliendo 0,5 g di streptomicina in 2,5 mL di acqua. Dopo aver sterilizzato la soluzione di streptomicina sterilizzante, graccolare per via orale i topi utilizzando un ago di gavage 22G a punta di lampadina e una siringa da 1 mL con 100 l di soluzione di streptomicina (20 mg di streptomicina/dose). Utilizzando un anello inoculante, inoculare 3 mL di brodo LB (50 g/mL streptomicina) in un tubo di coltura con una singola colonia. Incubare la coltura di Salmonella aerobicamente a 37 gradi durante la notte con agitazione a 200 giri/min.
- Il giorno dell'infezione, preparare la dose finale di infezione eseguendo 2 diluizioni consecutive 1/10 di colture notturne di Salmonella in PBS sterile. Ciò comporterebbe un inoculo di 100 L contenente circa 3 x 106 CFU.
- Utilizzando un ago gavage da 22G a punta di lampadina e una siringa da 1 mL, gavage ogni topo con 100 litri della Salmonella preparata.
NOTA: Preparare le colture di Salmonella utilizzando tecniche asettiche. La concentrazione di inoculazione finale di Salmonella può essere verificata placcando diluizioni seriali sull'agar LB con streptomicina. Il ceppo S. Typhimurium -AroA può essere ottenuto contattando il professor McNagny (kelly@brc.ubc.ca).
2. Valutazione dei carichi di Salmonella nei tessuti
- Preparare microtubi rotondi e di sicurezza da 2 mL con 1 mL di PBS sterile e un tallone in acciaio inossidabile autoclaved. Pre-pesare i tubi prima della raccolta dei tessuti.
- Resect cecal e tessuti splenici da topi eutanasia da esposizione all'anidride carbonica. Raccogliere il tessuto da singoli animali in tubi separati. Pesare i tubi per determinare i pesi dei tessuti.
- Omogeneizzare utilizzando un apparecchio miscelatore per 15 min a 30 Hz. Trasferire 900 L di PBS per bene in un megablocco da 2 mL di 96 pozzetti. Pipette 100 L di omogeneizzato tissutale si snoda nel primo pozzo, mescola bene ed esegue diluizioni seriali aggiungendo 100 L ai pozzi successivi fino a ottenere una diluizione di 10-6. Piastra 10-L di ogni diluizione in triplicati su LB agar contenente 100 streptomcyin.
- Contare e moltiplicare la CFU media per un fattore di 100, poiché è stato placcato 10 L del campione di 1000 l, e il fattore di diluizione appropriato. Dividere il peso totale del tessuto CFU per pesi tissutali per determinare CFU per grammo di tessuto.
NOTA: Conservare tutti i campioni sul ghiaccio o a 4 gradi centigradi durante la lavorazione dei tessuti. Utilizzare punte di pipetta ad ampio orifizio quando si eseguono diluizioni seriali con omogeneizzazioni tissutali. Preparare in anticipo il megablocco di 96 pozzi contenente PBS.
3. Picrosirius Colorazione rossa e quantificazione del collagene.
- Fissare i tessuti cecal durante la notte in formalina tampobuffered al 10% e prepararsi per l'incorporamento della paraffina. Tagliare le sezioni di 5-m per la colorazione Rosso Picrosirius come descritto in precedenza25.
- Acquisire immagini composite di intere sezioni trasversali di cecal su un microscopio a campo luminoso.
- Aprire Figi (ImageJ) e trascinare il file di immagine .tif sulla barra degli strumenti.
- Nella barra dei menu, selezionate Immagine > Testo > Stack RGB per dividere l'immagine in canali rosso, verde e blu. Far scorrere la barra orizzontale nella parte inferiore del pannello per impostare il canale su Verde.
- Apri immagine > Regola > Strumento Soglia. Regolare i limiti minimi e massimi per eliminare eventuali segnali di sfondo. Una volta impostata la soglia desiderata, chiudere lo strumento soglia e andare su Analizza > Imposta misure. Deselezionare Area, Frazione area, Limita a sogliae Visualizza etichetta.
- Cancellare la sezione del tessuto con lo strumento Selezioni a mano libera o Selezioni poligono e misurare l'area % positiva per il collagene facendo clic su Analizza > Misura.
- Normalizzare l'area assoluta positiva per la colorazione del collagene all'area del tessuto.
NOTA: Fiji (ImageJ) è un programma open source che può essere scaricato presso https://fiji.sc. Le immagini con le stesse condizioni di acquisizione (ad esempio, luminosità e messa a fuoco) devono avere limiti di soglia identici per una quantificazione accurata. Se c'è una colorazione di fondo all'interno del tessuto selezionato, misurare l'area assoluta e sottrarla dall'area positiva per il collagene dall'intero tessuto.
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Risultati
Trattamento con Streptomicina seguito da infezione orale con S. Il cplotto - AroA porta a una robusta infiammazione intestinale e fibrosi soprattutto nel cecum (Figura 1). I relativi oneri patogeni di 108-10 9 CFU per 1 g di cecum e 104 CFU per 1 g di milza possono essere recuperati da animali infetti ( Figura2). La valutazione della fibrosi nelle sezioni del ceca rosso picrosiro indicano la fibrosi di picco 21 giorni do...
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Discussione
La nostra comprensione della patogenesi dell'IBD è stata notevolmente migliorata da modelli murini di infiammazione intestinale. Anche se tali singoli modelli non ricapitolano tutte le caratteristiche della malattia umana complessa e multifattoriale, sono stati utili per identificare le caratteristiche chiave della progressione della malattia. Le stenosi fibrotiche associate all'IBD rimangono un'importante necessità clinica non soddisfatta, in quanto gli attuali trattamenti sono inefficaci nell'inversione dello sviluppo ...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti finanziari di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Ingrid Barta per i servizi di istologia.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette con blocco di sicurezza a fondo tondo da 2 ml | Eppendorf | 22363344 | |
| Perline in acciaio inossidabile | Qiagen | 69989 | |
| PBS | Gibco | 10010031 | |
| Punte per pipette a grande orifizio | Fisher | 2707134 | |
| 2 ml piastre megablock | Sarstedt | 82.1972.002 | |
| Aghi per gavage | FST | 18061-22 | |
| Streptomicina solfato | Sigma | S9137 | |
| Vibromulino | Retsch | MM |
Riferimenti
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