Qui, presentiamo micro-frammentazione senza enzimi adiposi umani utilizzando un dispositivo di sistema chiuso. Questo nuovo metodo consente l'ottenimento di ammassi sub-millimetrici di tessuto adiposo adatto per il trapianto in vivo, la coltura in vitro e l'ulteriore isolamento e caratterizzazione delle cellule.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Tessuto Adiposo Umano Microframmentazione per la Fenotipizzazione Cellulare e la Caratterizzazione del Secretome
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nell'ultimo decennio, i trapianti di tessuto adiposo sono stati ampiamente utilizzati nella chirurgia plastica e nell'ortopedia per migliorare la riproduzione e/o la rigenerazione dei tessuti. Di conseguenza, le tecniche per la raccolta e la lavorazione del tessuto adiposo umano si sono evolute al fine di ottenere rapidamente ed efficientemente grandi quantità di tessuto. Tra questi, la tecnologia del sistema chiuso rappresenta un sistema innovativo e facile da usare per raccogliere, elaborare e reiniettare tessuto adiposo raffinato in breve tempo e nello stesso intervento (intraoperatorio). Il tessuto adiposo viene raccolto mediante liposuzione, lavato, emulsionato, sciacquato e sciacquato meccanicamente in grappoli cellulari da 0,3 a 0,8 mm. Il trapianto autologo di tessuto adiposo frammentato meccanicamente ha dimostrato una notevole efficacia in diverse terapie terapeutiche come la medicina estetica e la chirurgia, la chirurgia ortopedica e generale. La caratterizzazione del tessuto adiposo micro-frammentato ha rivelato la presenza di piccoli vasi intatti all'interno degli ammassi adipociti; quindi, la nicchia perivascolare rimane imperturbata. Questi ammassi sono arricchiti in cellule perivascolari (ad esempio, antenati delle cellule staminali mesenchymal (MSC)) e l'analisi in vitro ha mostrato un maggiore rilascio di fattori di crescita e citochine coinvolte nella riparazione e rigenerazione dei tessuti, rispetto alle MSC di degenerazione enzimaticamente. Ciò suggerisce che il potenziale terapeutico superiore del tessuto adiposo microframmentato è spiegato da una maggiore frequenza di MSC presuntivi e una maggiore attività secretoria. Non è noto se questi periciti aggiunti contribuiscano direttamente a un fattore di crescita più elevato e alla produzione di citochine. Questa procedura clinicamente approvata consente il trapianto di sOTT SONdativi senza la necessità di espansione e/o trattamento enzimatico, aggirando così i requisiti delle linee guida GMP e riducendo i costi per le terapie basate sulle cellule.
Introduzione
Tessuto adiposo, a lungo utilizzato come riempitivo in chirurgia ricostruttiva e estetica, è recentemente diventato più popolare nella medicina rigenerativa una volta riconosciuto come fonte per le cellule staminali mesenchymiche (MSC)1. I lipoaspirati dissociati enzimati in sospensioni unicellulari producono una frazione vascolare stromale senza adipociti (SVF) che viene utilizzata inalterata nel paziente o, più comunemente, viene coltivata per diverse settimane in MSC2.
Tuttavia, la dissociazione enzimatica rompe i microambienti tissutali, appartando le cellule regolatorie vicine da cellule ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
L'approvazione etica per l'uso dei tessuti umani in questa ricerca è stata ottenuta dal Comitato etico di ricerca del Sud-Est della Scozia (riferimento: 16/SS/0103).
1. Collezione di tessuti adiposi addominali sottocutanei
NOT: Tutti gli strumenti utilizzati nella procedura manuale lipo-aspirazione sono forniti dal produttore del dispositivo di microframmentazione.
- Mantenere la sterilità per tutti i fluidi, contenitori, strumenti e l'area operativa durante l'esperimento.
- Posizionare il campione di abdominoplastica (procurato dall'equipe chirurgica in un sacchetto steri....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La dissociazione meccanica dei lipoaspiri manuali ha portato alla produzione di tessuto adiposo microframmentato (MAT), costituito da un aggregato di adipociti che avvolgevano una rete microvascolare (Figura 3). L'analisi dell'immunofluorescenza del MAT incorporato nella gelatina e criofissa evidenzia questa struttura, mostrando la rete vascolare contrassegnata dal marcatore di cellule endoteliali Ulex europaeus agglutinininina 1 (UEA-1) costituita principalm.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questo documento descrive la frazione fisica, utilizzando un dispositivo di sistema chiuso, del tessuto adiposo umano in piccoli ammassi che mostrano la normale microanatomia del tessuto adiposo.
Il tessuto adipose umano aspirato manualmente e la soluzione salina vengono caricati in un cilindro di plastica trasparente contenente grandi sfere metalliche in stile flipper che, a forte agitazione manuale del dispositivo, rompono il grasso in sub-millimetri Frammenti. I filtri attaccati e le slet c.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
CT è un fondatore di Lipogems.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Claire Cryer e Fiona Rossi dell'Università di Edimburgo per la loro assistenza esperta con citometria di flusso. Desideriamo anche ringraziare il personale dell'ospedale Murrayfield che ha contribuito fornendo campioni di tessuto.
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni della British Heart Foundation e Lipogems, che hanno fornito kit di lavorazione dei tessuti adiposi. Campioni di tessuto umano adulto sono stati acquistati con il pieno permesso etico del Comitato etico di ricerca del Sud Est Scozia (riferimento: 16/SS/0103).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 4% Paraformaldeide tamponata (PFA) | Sostanze chimiche VWR | 9317.901 | |
| 0,9% Soluzione di NaCl | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 capra anti-topo IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 capra anti-coniglio IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Cloruro di ammonio | Fisher Chemicals | 1158868 | |
| Diluente Antigent | Life Technologies | 3218 | |
| Compensazione Ig anti-topo, κ/Controllo negativo (BSA) Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Kit di blocco avidina/biotina | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa Citometro a flusso a 5 laser nbsp; | BD Biosciences | Laser 405 nm (viola)/375 nm (UV) - filtro V450/50 per anticorpi DAPI e V450; Laser 561nm (giallo-verde) – filtro YG582/15 per anticorpi PE; Laser 405 nm (viola)/375 nm (UV) filtro V710/50 per anticorpi BV711 | |
| Biotinilato Ulex europaeus lectina | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Topo IgG1, k Controllo dell'isotipo | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Concentrazione di base: 5mg/mL |
| Cannula per liposuzione monouso (LGI 13 G x185 mm AR 13/18) | Lipogemi | fornito nel kit chirurgico Lipogems | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, alto glucosio, GlutaMAX senza piruvato di sodio | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Siero fetale di vitello (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatina | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Kit chirurgico | Lipogems | LG SK 60 | |
| Topo anti umano- NG2 | BD Biosciences | 554275 | Concentrazione di base: 0,5 mg/mL |
| PE IgG1 di topo, κ Controllo isotipico | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillina-Streptomicina | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Provetta da 5 mL in polistirene a fondo tondo con tappo a scatto per filtro cellulare. | BD Biosciences | 352235, 25/confezione | |
| Polistirene fondo tondo provette da 5 mL | BD Biosciences | 352003 | |
| Coniglio anti umano - PDGFRb | Abcam | 32570 | concentrazione di riserva: 0,15 mg/mL |
| Streptavidina coniugata-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Saccarosio | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Cannula per infiltrazione tissutale (17 G x 185 mm-VG 17/18) | Lipogemi | fornito nel kit chirurgico Lipogems | |
| Tris base | fisher prodotti chimici | BP152-500 | |
| Collagenasi di tipo II | Gibco | 17101-015 | |
| V450 IgG1 di topo, κ Controllo isotipico | BD Biosciences | 560373 | |
| Osservatore Zeiss a campo largo | Zeiss | Obiettivo utilizzato: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 Sorgente luminosa a LED ( LED: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, eccitazione 385 nm; 488: Blu, eccitazione 475 nm; 555: Verde, eccitazione 555 nm; 647:Rosso, eccitazione 630 nm |
Riferimenti
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).
- Schäffler, A., et al. Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
