Qui, viene presentato un protocollo passo-passo per la preparazione e la coltivazione di bottoni corneali divisi su porcini. Poiché questo modello di coltura organo-tipicamente coltivata mostra i tassi di mortalità cellulare entro 15 giorni, paragonabili alle cornee dei donatori umani, rappresenta il primo modello che consente la coltivazione a lungo termine di cornee non umane senza aggiungere dextran tossico.
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Articolo metodologico
Un modello di cultura dell'organo endoteliale porcina utilizzando i pulsanti corneali divisi
In questo articolo
Sommario
Abstract
La ricerca sperimentale sulle cellule endoteliali corneali è associata a diverse difficoltà. Le cornee dei donatori umani sono scarse e raramente disponibili per le indagini sperimentali, in quanto sono normalmente necessarie per il trapianto. Le colture di cellule endoteliali spesso non si traducono bene in situazioni in vivo. A causa delle caratteristiche biostrutturali delle cornee non umane, il gonfiore stromale durante la coltivazione induce una sostanziale perdita di cellule endoteliali corneali, che rende difficile eseguire la coltivazione per un lungo periodo di tempo. Gli agenti di deswelling come dextran vengono utilizzati per contrastare questa risposta. Tuttavia, causano anche una significativa perdita di cellule endoteliali. Pertanto, è stato istituito un modello di coltura di organi ex vivo che non richiede agenti di deswelling. Occhi di maiale da un macello locale sono stati utilizzati per preparare i pulsanti corneali divisi. Dopo una parziale trefinazione corneale, gli strati esterni della cornea (epitelio, strato di arco, parti dello stroma) sono stati rimossi. Questo riduce significativamente la perdita di cellule endoteliali indotte da un massiccio gonfiore stromale e dal ripiegamento della membrana di Descemet durante i periodi di coltivazione più lunghi e migliora la conservazione generale dello strato di cellule endoteliali. La successiva trefinazione corneale completa fu seguita dalla rimozione del pulsante corneale diviso dal bulbo oculare rimanente e dalla coltivazione. La densità delle cellule endoteliali è stata valutata nei periodi di follow-up fino a 15 giorni dopo la preparazione (cioè i giorni 1, 8, 15) utilizzando la microscopia leggera. La tecnica di preparazione utilizzata consente una migliore conservazione dello strato di cellule endoteliali, resa possibile da un rallentamento del tessuto stromale, che si traduce in tassi di declino lenti e lineari nei bottoni corneali divisi paragonabili alle cornee dei donatori umani. Poiché questo modello di ricerca standardizzato coltivato organo-tipicamente consente per la prima volta una coltivazione stabile per almeno due settimane, è una valida alternativa alle cornee dei donatori umani per future indagini su vari fattori esterni effetti sull'endotelio corneale.
Introduzione
Le procedure di trapianto di cornea sono tra le trapianti più comunemente eseguite in tutto il mondo1. Poiché vi è una grave carenza di cornee dei donatori umani, la ricerca sperimentale che si occupa delle cellule endoteliali corneali nelle cornee umane è difficile da eseguire1. Tuttavia, l'introduzione di soluzioni di irrigazione e altre sostanze utilizzate all'interno dell'occhio, dispositivi viscolicici oftalmici, così come strumenti e tecniche chirurgiche (ad esempio, strumenti e tecniche di facoemulsificazione, energia ecografica) richiede valide ed estese indagini riguardanti i loro effetti sull'endotelio corneo p....
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Protocollo
Questo protocollo segue gli orientamenti etici della nostra istituzione. Conformemente agli statuti del comitato di revisione etica del nostro istituto non è stato necessario ottenere alcuna approvazione etica prima degli esperimenti, poiché tutte le cornee di suine sono state ottenute dal macello locale.
1. Cultura dell'organo
- Preparare gli occhi di maiale.
- Dal macello locale, ottenere gli occhi di maiale che sono stati rimossi poco dopo la morte ma prima del trattamento termico. Trasportare gli occhi al laboratorio ed elaborarli in poche ore. Durante il trasporto, tenere gli occhi a temperatura ambiente (circa 21 gradi c....
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Risultati
La tecnica di dissezione presentata implica la rimozione parziale del tessuto stromale, con conseguente un campione di cornea più sottile e quindi un gonfiore meno stromale (Figura 1 e Figura 2). Il gonfiore meno stromale induce meno forze di taglio e pizzico che hanno un impatto negativo sull'endotelio corneale, causando così una minore perdita di cellule endoteliali6. I pulsanti corneali divisi mostrano .......
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Discussione
Questo protocollo fornisce un metodo per la preparazione di pulsanti corneali divisi su vitello, che rappresenta un modello standardizzato e a basso costo di coltura endoteliale endoteliale per scopi di ricerca6. I bottoni corneali porcini divisi hanno mostrato una diminuzione della densità delle cellule endoteliali paragonabile alle perdite di cellule endoteliali osservate nelle cornee dei donatori umani coltivate nelle banche oculari per un periodo di due settimane6,.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
L'istituzione del modello di ricerca presentato è stata sostenuta da KMU-innovativ (13GW0037F) del Ministero federale dell'istruzione e della ricerca Germania.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soggetto | |||
| Occhi di maiale | locale abbatoir | ||
| Sostanze | |||
| Rosso di alizarina S | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Culture Medium 1, #F9016 | Biochrom GmbH, Germania | ||
| Dulbecco's PBS (1x) | Gibco, USA | ||
| Siero fetale di vitello | Biochrom GmbH, Germania | ||
| Soluzione di acido cloridrico (HCl) | di produzione | ||
| Soluzione salina bilanciata ipotonica | produzione | per 1 L di H2O: NaCl 4,9 g; KCl 0,75 g; CaCl x H2O 0,49 g; MgCl2 x H2O 0,3 g; Acetato di sodio x 3 H2O 3,9 g; Citrato di sodio x 2 H2O 1,7 g | |
| Iodio Povidon 7,5%, Braunol | B. Braun Melsungen AG, Germania | ||
| Cloruro di sodio (NaCl) 0,9% | B. Braun Melsungen AG, Germania | ||
| Soluzione di idrossido di sodio (NaOH) | di produzione | ||
| Blu di tripano 0,4% | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Materiali & Strumenti | |||
| Accu-jet pro | Brand GmbH, Germania | ||
| Beaker Glass 50 mL | Schott AG, Germania | ||
| Cannula smussata incl. filtro (5 &; m) 18G | Becton Dickinson, USA | ||
| Piastra per colture cellulari (12 pozzetti) | Corning Inc., USA | ||
| Colibri forcipe | Geuder AG, Germania | ||
| Forbici corneali | Geuder AG, Germania | ||
| Eppendorf pipetta | Eppendorf AG, Germania | ||
| Portabulbo oculare | L. Klein, Germania | ||
| Forbici per gli occhi | Geuder AG, Germania | ||
| Filtro piegato ø 185 mm | Whatman, USA | ||
| Coltello da hockey | Geuder AG, Germania | ||
| Laboratorio Bottiglia di vetro con tappo 100 mL | Schott AG, Germania | ||
| Agitatore magnetico | Carl Roth GmbH & Co. KG, Germania | ||
| MillexGV Filtro (5 & micro; m) | Merck Millopore Ltd., USA | ||
| Porta ago | Geuder AG, Germania | ||
| Piastre di Petri | VWR International, USA | ||
| Puntali per pipette | Sarstedt AG & Co., Germania | ||
| Bisturi (monouso), lama triangolare | Aesculap AG & Co. KG, Germania | ||
| Pipetta sierologica 10 mL | Sarstedt AG & Co., Germania | ||
| Pipetta sierologica 5 mL | Sarstedt AG & Co., Germania | ||
| Coppette sterili | Greiner Bio-One, Ö sterreich | ||
| Guanti sterili | Paul Hartmann AG, Germania | ||
| Telo chirurgico sterile | Paul Hartmann AG, Germania | ||
| Forbici per punti | Geuder AG, Germania | ||
| Sutura Ethilon 10-0 Polyamid 6 | Ethicon Inc., USA | ||
| Siringa (5 mL) | Becton Dickinson, USA | ||
| trephine ø 7,5 mm | produzione | ||
| Pinze di legatura | Geuder AG, Germania | ||
| Carta per pesare | neoLab Migge GmbH, Germania | ||
| Attrezzature & Software | |||
| Microscopio operatorio binoculare | Carl Zeiss AG, Germania | ||
| Fotocamera montata sul microscopio | Olympus, Giappone | ||
| CellSens Entry (software) | Olympus, Giappone | ||
| Sorgente di luce fredda | Schott AG, Germania | ||
| Incubatore | Heraeus GmbH, Germania | ||
| Microscopio a contrasto di fase invertito | Olympus GmbH, Germania | ||
| Agitatore magnetico con funzione di riscaldamento | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germania | ||
| pHmetro pHenomenal | VWR International, USA | ||
| Photoshop CS2 | Adobe Systems, USA | ||
| Bilancia di precisione | Ohaus Europe GmbH, Svizzera |
Riferimenti
- Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Roy, O., et al. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. I....
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Ristampe e permessi
