Monitoraggio in Situ di gruppi di chaperone molecolari formati in farmaci, lieviti e cellule umane

Sommario

Le proteine Cognate J-domain cooperano con l'accompagnatore Hsp70 per assistere in una miriade di processi biologici che vanno dal ripiegamento proteico alla degradazione. Qui, descriviamo un analisi di legatura di prossimità in situ, che consente il monitoraggio di questi macchinari chaperone tradotti transitoriamente in cellule batteriche, lieviti e umane.

Abstract

Le proteine J-domain (JDP) formano la famiglia di co-chaperone più grande e diversificata nelle cellule eucariotiche. Recenti scoperte mostrano che specifici membri della famiglia JDP potrebbero formare eterocomplessi transitori negli eucarioti per perfezionare la selezione del substrato per la proteina da shock termico da 70 kDa (Hsp70) a base di proteine a base di chaperone. I complessi JDP si rivolgono a proteine aggregate indotte da stress acuto/cronico e presumibilmente aiutano ad assemblare i disaggregas reclutando più Hsp70 sulla superficie degli aggregati proteici. L'estensione della rete di controllo della qualità delle proteine (PQC) formata da questi JDP fisicamente interagenti rimane in gran parte non caratterizzata in vivo. Qui, descriviamo un saggio di interazione delle proteine in situ basato sulla microscopia chiamato il saggio di legatura di prossimità (PLA), che è in grado di catturare in modo robusto questi complessi chaperone formati in modo transitorio in compartimenti cellulari distinti di cellule eucariotiche. Il nostro lavoro amplia l'impiego di PLA dalle cellule umane al lievito (Saccharomyces cerevisiae) e ai batteri (Escherichia coli), rendendo così uno strumento importante per monitorare la dinamica degli assiemi proteici formati transitori in entrambi i cellule procariotiche ed eucariotiche.

Introduzione

Una grande quantità di informazioni genomiche rimane incomprensibile a causa della nostra comprensione incompleta degli interactomi cellulari. Le tradizionali metodologie di rilevamento dell'interazione proteina-proteina, come la co-immunoprecipitazioni proteica con/senza il collegamento incrociato chimico e la co-localizzazione delle proteine, sebbene ampiamente utilizzate, rappresentano una serie di svantaggi. Alcuni dei principali svantaggi includono una scarsa quantificazione delle interazioni e la potenziale introduzione di eventi vincolanti non nativi. In confronto, le tecniche emergenti basate sulla prossimità forniscono un approccio alternativo e potente per c....

Protocollo

1. Preparazione della cella HeLa

1. Preparare i seguenti materiali: PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄), pH 7.4; DMEM, integrato con 10% FCS e 1% Pen-Strep; 4% paraformaldeide in PBS; 0,5% Triton-X100 in PBS; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,05% Tween), pH 7,4; 0.0001% sterile soluzione poli-L-Lysina; 10 vetrini diagnostici; una camera umida; carta velina; e Coplin striature di diapositive.
   NOT: Per garantire un'efficienza ottimale della fissazione, le soluzioni di paraformaldeia devono essere preparate fresche prima di ogni esperimento.
2. Preparare una came....

Risultati

I nostri precedenti studi in vitro che utilizzano proteine purificate hanno rivelato che un sottoinsieme della classe umana A e dei JDP di classe B formano complessi JDP di classe mista transitori per indirizzare in modo efficiente un'ampia gamma di proteine aggregate e possibilmente facilitare l'assemblaggio di Hsp70-based proteine disaggregases⁷. Abbiamo impiegato il PLA per determinare se i complessi JDP di classe mista (A-B) si verificano nelle cellule tumorali cervicali umane (HeLa). I JDp um.......

Discussione

Approcci basati sulla co-immunoprecipitazioni e la co-localizzazione sono stati utilizzati come metodi di lunga data per caratterizzare gli assemblamenti proteici. L'individuazione di complessi di chaperone specifici formati in modo transitorio è una grande sfida con tali metodi convenzionali e, di conseguenza, i risultati precedenti sono in gran parte limitati a interpretazioni qualitative. Le tecniche di co-immunoprecipitazionazione basate sulla lisi a base di lisi spesso richiedono il collegamento incrociato per stabi.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
37% Formaldeide	Merck	103999
Acetone	Sigma-Aldrich	32201
anticorpo anti-DNAJA2	Abcam	ab157216
anti-DNAJB1 Anticorpo	Enzo Life Sciences	ADI-SPA-450
anticorpo anti-DnaK	Anticorpo interno
anti-mCherry Abcam		ab125096
anticorpo anti-Sis1	Cosmo Bio Corp	COP-080051
anticorpo anti-Ydj1	StressMarq Biosciences	SMC-150,
anticorpo anti-YFP	Barattolo per
		S5516
Vetrini diagnostici	Marienfeld	1216530
DMEM	Thermo-Fischer	31966021
DuoLink Reagenti per il rilevamento in situ Orange	Sigma-Aldrich	DUO92007
DuoLink In Terreno di montaggio in situ + DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040
DuoLink Sonda PLA in situ Anti-Topo MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004
DuoLink Sonda PLA in situ Anti-Rabbit PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
DuoLink Tamponi di lavaggio in situ, fluorescenza	Sigma-Aldrich	DUO82049
Siero fetale di vitello	Thermo-Fischer	10082147
Lisozima	Sigma-Aldrich	62971
Metanolo	Sigma-Aldrich	32213
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillina/Streptomicina	Thermo-Fischer	15070063
Poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P47-07
Sorbitolo	Sigma-Aldrich	S7547
Triton-X100	Merck	108643
Tripsina	Thermo-Fischer	25300096
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
Zimalosi 100T / / Lyticase	Stati Uniti Biologico	Z1004

colorazione dei vetrini Coplin Sigma-Aldrich