Vitrificazione delle gocce di gocciolamento per la conservazione degli epatiti primari

Reinier  J. de Vries; Peony  D. Banik; Sonal Nagpal; Lindong Weng; Sinan Ozer; Thomas  M. van Gulik; Mehmet Toner; Shannon  N. Tessier; Korkut Uygun

doi:10.3791/60250

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Articolo metodologico

Vitrificazione delle gocce di gocciolamento per la conservazione degli epatiti primari

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DOI:

10.3791/60250

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25 ottobre 2019

Reinier J. de Vries¹^,²^,³ , Peony D. Banik¹^,² , Sonal Nagpal¹^,² , Lindong Weng¹^,² , Sinan Ozer¹^,² , Thomas M. van Gulik³ , Mehmet Toner¹^,² , Shannon N. Tessier¹^,² , Korkut Uygun¹^,²

¹Center for Engineering in Medicine, Harvard Medical School, Massachusetts General Hospital, ²Shriners Hospitals for Children, Boston, ³Department of Surgery, University of Amsterdam

In questo articolo

Sommario

Questo manoscritto descrive un metodo di crioconservazione senza ghiaccio per grandi quantità di epatociti di ratto per cui le cellule primarie sono pre-incubate con agenti crioprotettivi a bassa concentrazione e vetrificate in grandi goccioline.

Abstract

La vetrificazione è una promettente alternativa senza ghiaccio per la crioconservazione classica a freddo (a circa 1 omin/min) di campioni biologici. La vetrificazione richiede velocità di raffreddamento estremamente veloci per ottenere la transizione dell'acqua nella fase del vetro, evitando la formazione dannosa di ghiaccio. Sebbene la pre-incubazione con agenti crioprotettivi (CPA) possa ridurre il tasso di raffreddamento critico dei campioni biologici, sono generalmente necessarie elevate concentrazioni per consentire la crioconservazione senza ghiaccio mediante vitrificazione. Di conseguenza, la vetrificazione è ostacolata dalla tossicità della CPA e limitata a piccoli campioni che possono essere raffreddati rapidamente. Recentemente è stato dimostrato che questi limiti intrinseci possono essere superati dalla vetrificazione delle gocce di gocciolamento. Utilizzando questo nuovo metodo, le cellule vengono prima pre-incubate con una bassa concentrazione di CPA intracellulare. Sfruttando una rapida disidratazione osmotica, il CPA intracellulare è concentrato direttamente prima della vitrificazione, senza la necessità di equilibrare pienamente le concentrazioni di CPA tossiche. La disidratazione cellulare viene eseguita in un dispositivo fluido e integrata con la generazione continua ad alta velocità effettiva di goccioline di grandi dimensioni che sono vetrificate in azoto liquido. Questo metodo di crioconservazione senza ghiaccio con tossicità CPA minima è adatto per grandi quantità di cellule e si traduce in una maggiore vitalità epatocite e funzione metabolica rispetto alla crioconservazione classica a congelamento lento. Questo manoscritto descrive in dettaglio i metodi per il successo della vetrificazione delle gocce di gocciolamento.

Introduzione

La perdita di vitalità cellulare e funzione metabolica dopo la crioconservazione degli epatociti è ancora un problema importante che limita le applicazioni cliniche¹^,²^,³. Il metodo di riferimento della crioconservazione dell'epatocito è il congelamento lento, che viene eseguito pre-incubando gli epatociti con CPA (solfuro dimetilo [DMSO], glucosio e albumina) e il successivo congelamento del tasso controllato (a circa 1 temperature criogeniche⁴^,⁵. Nonostante molte ottimizzazioni segnalate, tossicità CPA insieme a squi....