Silenziamento della scintilla: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Savvas  J. Constantinou; Linh Nguyen; Frank Kirschbaum; Vielka  L. Salazar; Jason R. Gallant

doi:10.3791/60253

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Articolo metodologico

Silenziamento della scintilla: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

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DOI:

10.3791/60253

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27 ottobre 2019

Savvas J. Constantinou¹ , Linh Nguyen² , Frank Kirschbaum² , Vielka L. Salazar³ , Jason R. Gallant¹

¹Department of Integrative Biology, Michigan State University, ²Faculty of Life Sciences, Unit of Biology and Ecology of Fishes, Humboldt University, ³Department of Biology, Cape Breton University

In questo articolo

Sommario

Qui viene presentato un protocollo per produrre e retrocedere il genoma CRISPR/Cas9 knockout pesce elettrico. In dettaglio sono indicati i requisiti di biologia molecolare, allevamento e allevamento necessari sia per una palestra che per un mormyrid, e tecniche di iniezione per produrre larve indeletta F₀ indotte da Cas9.

Abstract

L'elettroricezione e l'elettrogenesi sono cambiate nella storia evolutiva dei vertebrati. C'è un notevole grado di convergenza in questi fenotipi derivati in modo indipendente, che condividono un'architettura genetica comune. Questo è forse meglio esemplificato dalle numerose caratteristiche convergenti di gymnotiformi e mormyridi, due cladi teleosti ricchi di specie che producono e rilevano campi elettrici deboli e sono chiamati pesci debolmente elettrici. Nei 50 anni trascorsi dalla scoperta che i pesci debolmente elettrici usano l'elettricità per percepire l'ambiente circostante e comunicare, una comunità crescente di scienziati ha acquisito enormi informazioni sull'evoluzione dello sviluppo, dei sistemi e dei circuiti delle neuroscienze, fisiologia cellulare, ecologia, biologia evolutiva e comportamento. Più recentemente, c'è stata una proliferazione di risorse genomiche per i pesci elettrici. L'uso di queste risorse ha già facilitato importanti intuizioni per quanto riguarda la connessione tra genotipo e fenotipo in queste specie. Uno dei principali ostacoli all'integrazione dei dati genomici con i dati fenotipici dei pesci debolmente elettrici è una mancanza di strumenti genomici funzionali. Riportiamo qui un protocollo completo per l'esecuzione della mutagenesi CRISPR/Cas9 che utilizza meccanismi endogeni di riparazione del DNA nei pesci debolmente elettrici. Dimostriamo che questo protocollo è altrettanto efficace sia nella specie mormyrid Brienomyrus brachyistius che nella gymnotiforme Brachyhypopomus gauderio utilizzando CRISPR/Cas9 per colpire indels e mutazioni puntiformi nel primo esone del gene del canale di sodio scn4aa. Utilizzando questo protocollo, sono stati ottenuti embrioni di entrambe le specie e si sono genotiper per confermare che le mutazioni previste nel primo esone del canale di sodio scn4aa erano presenti. Il fenotipo di successo è stato confermato con registrazioni che mostrano una riduzione delle ampiezza di scarico dell'organo elettrico rispetto ai controlli non iniettati.

Introduzione

L'elettroricezione e l'elettrogenesi sono cambiate nella storia evolutiva dei vertebrati. Due lignaggi di pesce teleost, osteoglossiformes e siluri, hanno evoluto l'elettroricezione in parallelo, e cinque lignaggi di teleosts (gymnotiformes, mormyrids, e il genere Astroscopus, Malapterurus e Synodontis) elettrogenesi evoluta in parallelo. C'è un notevole grado di convergenza in questi fenotipi derivati in modo indipendente, che condividono un'architettura genetica comune¹^,²^,³.

Questo è forse meglio esemplificato dalle num....