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Articolo metodologico

Silenziamento della scintilla: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

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DOI:

10.3791/60253

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27 ottobre 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Integrative Biology, Michigan State University, 2Faculty of Life Sciences, Unit of Biology and Ecology of Fishes, Humboldt University, 3Department of Biology, Cape Breton University

In questo articolo

Sommario

Qui viene presentato un protocollo per produrre e retrocedere il genoma CRISPR/Cas9 knockout pesce elettrico. In dettaglio sono indicati i requisiti di biologia molecolare, allevamento e allevamento necessari sia per una palestra che per un mormyrid, e tecniche di iniezione per produrre larve indeletta F0 indotte da Cas9.

Abstract

L'elettroricezione e l'elettrogenesi sono cambiate nella storia evolutiva dei vertebrati. C'è un notevole grado di convergenza in questi fenotipi derivati in modo indipendente, che condividono un'architettura genetica comune. Questo è forse meglio esemplificato dalle numerose caratteristiche convergenti di gymnotiformi e mormyridi, due cladi teleosti ricchi di specie che producono e rilevano campi elettrici deboli e sono chiamati pesci debolmente elettrici. Nei 50 anni trascorsi dalla scoperta che i pesci debolmente elettrici usano l'elettricità per percepire l'ambiente circostante e comunicare, una comunità crescente di scienziati ha acquisito enormi informazioni sull'evoluzione dello sviluppo, dei sistemi e dei circuiti delle neuroscienze, fisiologia cellulare, ecologia, biologia evolutiva e comportamento. Più recentemente, c'è stata una proliferazione di risorse genomiche per i pesci elettrici. L'uso di queste risorse ha già facilitato importanti intuizioni per quanto riguarda la connessione tra genotipo e fenotipo in queste specie. Uno dei principali ostacoli all'integrazione dei dati genomici con i dati fenotipici dei pesci debolmente elettrici è una mancanza di strumenti genomici funzionali. Riportiamo qui un protocollo completo per l'esecuzione della mutagenesi CRISPR/Cas9 che utilizza meccanismi endogeni di riparazione del DNA nei pesci debolmente elettrici. Dimostriamo che questo protocollo è altrettanto efficace sia nella specie mormyrid Brienomyrus brachyistius che nella gymnotiforme Brachyhypopomus gauderio utilizzando CRISPR/Cas9 per colpire indels e mutazioni puntiformi nel primo esone del gene del canale di sodio scn4aa. Utilizzando questo protocollo, sono stati ottenuti embrioni di entrambe le specie e si sono genotiper per confermare che le mutazioni previste nel primo esone del canale di sodio scn4aa erano presenti. Il fenotipo di successo è stato confermato con registrazioni che mostrano una riduzione delle ampiezza di scarico dell'organo elettrico rispetto ai controlli non iniettati.

Introduzione

L'elettroricezione e l'elettrogenesi sono cambiate nella storia evolutiva dei vertebrati. Due lignaggi di pesce teleost, osteoglossiformes e siluri, hanno evoluto l'elettroricezione in parallelo, e cinque lignaggi di teleosts (gymnotiformes, mormyrids, e il genere Astroscopus, Malapterurus e Synodontis) elettrogenesi evoluta in parallelo. C'è un notevole grado di convergenza in questi fenotipi derivati in modo indipendente, che condividono un'architettura genetica comune1,2,3.

Questo è forse meglio esemplificato dalle numerose caratteristiche convergenti di gymnotiformi e mormyridi, due cladi teleosti ricchi di specie, che producono e rilevano campi elettrici deboli e sono chiamati pesci debolmente elettrici. Nei 50 anni dalla scoperta che i pesci debolmente elettrici usano l'elettricità per percepire l'ambiente circostante e comunicare4, una comunità crescente di scienziati ha acquisito enormi intuizioni sull'evoluzione dello sviluppo1,5 ,6, sistemi e circuiti neuroscienze7,8,9,10, fisiologia cellulare11,12, ecologia ed energiche13 ,14,15,16,17, comportamento18,19e macroevoluzione3,20,21 .

Più recentemente, c'è stata una proliferazione di risorse genomiche, trascrittomiche e proteomiche perilpesce elettrico 1,22,23,24,25,26, 27,28. L'uso di queste risorse ha già prodotto importanti intuizioni riguardanti la connessione tra genotipo e fenotipo in queste specie1,2,3,28,29 ,30. Un grande ostacolo all'integrazione dei dati genomici con i dati fenotipici dei pesci debolmente elettrici è una mancanza di strumenti genomici funzionali31.

Uno di questi strumenti è la tecnica Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats di recente sviluppo in coppia con la tecnica Cas9 endonuclease (CRISPR/Cas9, CRISPR). CRISPR/Cas9 è uno strumento di editing del genoma che è entrato in uso diffuso sia nel modello32,33,34 e organismi non modello35,36,37 allo stesso modo. La tecnologia CRISPR/Cas9 è progredita fino a un punto in cui un laboratorio in grado di biologia molecolare di base può facilmente generare sonde specifiche del gene chiamate RNA guida corta (sgRNA), a basso costo utilizzando un metodo non di clonazione38. CRISPR ha vantaggi rispetto ad altre strategie di knockout/knockdown, come i morfolino39,40, le nucleasi effettore simili a attivatori di trascrizione (TALENs) e le nucleasi di dito di zinco, che sono costose e che richiede molto tempo per generare per ogni gene bersaglio.

Il sistema CRISPR/Cas9 funziona per creare eliminazioni genetiche prendendo di mira una regione specifica del genoma, diretta dalla sequenza sgRNA, e causando una rottura a doppio filamento. La rottura a doppio filamento viene rilevata dalla cellula e attiva preferibilmente meccanismi endogeni di riparazione del DNA utilizzando il percorso di giunzione finale non omologa (NHEJ). Questo percorso è altamente soggetto a errori: durante il processo di riparazione, la molecola di DNA spesso incorpora inserimenti o delezioni (indel) nel sito di rottura a doppio filamento. Questi indels possono comportare una perdita di funzione a causa di (1) spostamenti nel frame di lettura aperto, (2) inserimento di un codone di arresto prematuro o (3) cambiamenti nella struttura primaria critica del prodotto genetico. In questo protocollo, utilizziamo l'editing CRISPR/Cas9 per individuare mutazioni di punti bersaglio nei geni bersaglio usando il NHEJ in specie di pesci debolmente elettriche. Mentre più semplice e più efficiente di altre tecniche, questo metodo di mutagenesi si prevede di provocare una gamma di gravità fenotipica in F0, che è attribuito al mosaicismo genetico41,42,43 ,44.

Selezione degli organismi
Al fine di facilitare gli studi futuri sulla genomica comparativa dei pesci debolmente elettrici, era necessario selezionare una specie rappresentativa sia per gymnotiformi che per gli omestidi per lo sviluppo del protocollo. A seguito delle discussioni durante l'incontro del pesce elettrico del 2016 a Montevideo, in Uruguay, c'era un consenso della comunità per l'utilizzo di specie che potevano già essere allevate in laboratorio e che avevano risorse genomiche disponibili. La gymnotiforme Brachyhypopomus gauderio e il mormyrid Brienomyrus brachyistius sono stati selezionati come specie che si adattano a questi criteri. In entrambe le specie, i segnali naturali per indurre e mantenere le condizioni di allevamento sono facili da imitare in cattività. B. gauderio, una specie gymnotiforme del Sud America, ha il vantaggio di bassi requisiti di allevamento: i pesci possono essere mantenuti ad una densità relativamente elevata in vasche relativamente piccole (4 L). B. gauderio ha anche un rapido ricambio generazionale in condizioni dicattività. In condizioni di laboratorio, B. gauderio può svilupparsi da uovo a adulto in circa 4 mesi.

B. brachyistius, una specie di pesce mormyrid dell'Africa centro-occidentale, nidifica prontamente in cattività. B. brachyistius è prontamente disponibile attraverso il commercio dell'acquario, è stato ampiamente utilizzato in molti studi, e ora ha una serie di risorse genomiche disponibili. Il loro ciclo di vita dura 1 o 3 anni, a seconda delle condizioni di laboratorio. I requisiti dell'allevamento sono un po' più intensi per questa specie, richiedendo vasche di dimensioni moderate (50-100 L) a causa della loro aggressività durante l'allevamento.

I laboratori che studiano altre specie di pesci elettrici dovrebbero essere in grado di adattare facilmente questo protocollo fintanto che la specie può essere allevata e gli embrioni a singola cellula possono essere raccolti e allevati fino all'età adulta. L'alloggio, l'allevamento larvale e i tassi di fecondazione in vitro (IVF) probabilmente cambieranno con altre specie; tuttavia, questo protocollo può essere utilizzato come punto di partenza per i tentativi di allevamento in altri pesci debolmente elettrici.

Un obiettivo gene ideale per la prova di concetto: scn4aa
I pesci mormyrid e gymnotiformi poco elettrici generano campi elettrici (elettrogenesi) scaricando un organo specializzato, chiamato organo elettrico. Le scariche di organi elettrici (EOD) derivano dalla produzione simultanea di potenziali d'azione nelle cellule di organi elettrici chiamati elettrociti. Gli EOD vengono rilevati da una serie di elettrorecettori nella pelle per creare immagini elettriche ad alta risoluzione dell'ambiente circostante del pesce45. I pesci poco elettrici sono anche in grado di rilevare le caratteristiche delle forme d'onda EOD dei loro conspecifici18 così come i loro tassi di scarico46, permettendo alle EOD di funzionare in aggiunta come segnale di comunicazione sociale analogo al canto degli uccelli o alla rana vocalizzazioni47.

Una componente principale della generazione potenziale di azione negli elettrociti del pesce mormyrid e gymnotiforme debolmente elettrico è il canale di sodio NaV1.42. I teleost s'esolti non elettrici esprimono due copie geniche paralologie, scn4aa e scn4ab, codificando per il canale di sodio NaV1.430. In entrambe le linee di pesce gymnotiformi e mormyrid debolmente elettriche, scn4aa si è evoluto rapidamente e ha subito numerose sostituzioni di amminoacidi che influenzano le sue proprietà cinetiche48. Ancora più importante, scn4aa è diventato compartimentato in entrambi i lignaggi per l'organo elettrico2,3. L'espressione relativamente limitata di scn4aa all'organo elettrico, così come il suo ruolo chiave nella generazione di EOD, lo rende un bersaglio ideale per gli esperimenti di knockout CRISPR/Cas9, in quanto ha effetti pleiotropici deleteri minimi. Poiché i pesci debolmente elettrici iniziano a scaricare i loro organi elettrici larvali 6-8 giorni dopo la fecondazione (DPF), il targeting dello scn4aa è ideale per la fenotipizzazione rapida dopo la microiniezione dell'embrione.

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Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Michigan State University.

1. Selezione dei bersagli sgRNA

NOT: Nel passaggio 1.1 viene fornito un protocollo per la progettazione manuale degli sgRNA. Questo è stato utilizzato per la selezione del bersaglio scn4aa. Viene fornito un protocollo aggiuntivo per facilitare questo processo (passaggio 1.2) utilizzando il portale web EFISHGENOMICS. Si consiglia agli utenti di selezionare il protocollo 1.2, che dispone di diversi "controlli" automatizzati per garantire il successo nella progettazione di sgRNA per destinazioni personalizzate.

  1. Progettare i bersagli dello sgRNA.
    1. Per generare oligo guida sgRNA, è meglio indirizzare exon 1, o altri esoni 5'. Il 5' UTR può essere mirato; tuttavia, è meglio indirizzare la sequenza di codifica 5'. L'utilizzo di informazioni genomiche è preferibile, ma è possibile sviluppare sgRNA di successo utilizzando dati trascrittomi. È preferibile l'annotazione dei limiti intron/exon (dati genomici) o dei confini esoni/exon.
    2. Le sequenze genomiche candidate da 1.1 vengono cercate per sequenze di destinazione putative che corrispondono al modello 5'-N(18)-NGG-3'. Questa operazione può essere eseguita automaticamente utilizzando il software di analisi delle sequenze desktop, gli script personalizzati o l'ispezione manuale delle sequenze.
    3. Le sequenze possono essere classificate in ordine di priorità utilizzando il metodo di Doench et al.49 per l'attività sul target. Inoltre, le sequenze di destinazione possono essere valutate da una ricerca BLAST rispetto adatabase genomici/trascrittomici per l'associazione fuori target.
    4. Assicurarsi che i primer PCR standard possano essere generati che fiancheggiano la sequenza di destinazione. I Primer devono essere di almeno 20 bp da entrambi i lati del sito di taglio (tre basi a monte della sequenza NGG). Idealmente, il prodotto PCR dovrebbe essere di 150-200 coppie di base (bp).
    5. Oligomeri di design che soddisfano i suddetti criteri utilizzando il modello seguente, che comprende un promotore T7 (5' di N18) e una regione complementare (3' di N18) per l'annealing all'oligomero costante (1.1.6): 5'-TAATACGACTCACTAACTATAGG-N18 -GTTTTAGAGCTAGAATAGCAAG-3'
      NOT: La sequenza N18 non include la sequenza NGG protospacer adiacente (PAM). Non includere questo nell'oligomero.
    6. Ordinare l'oligomero costante (Tabella 1) che verrà utilizzato per sintetizzare tutti gli sgRNA, gli oligomeri per gli obiettivi sgRNA (passaggio 1.1.5) e i primer PCR (passaggio 1.1.4) come oligomeri disalati standard da un servizio di produzione di oligonucleotidi. Oligomeri e primer PCR possono essere ordinati come oligomeri dissalati standard, non è necessaria alcuna purificazione aggiuntiva.
  2. Eseguire la progettazione automatizzata di obiettivi sgRNA.
    1. Utilizzando i dati genomici, selezionare un gene bersaglio. I dati del trascrittoma potrebbero essere utilizzati invece quando sono noti i limiti di eson/intron. Le destinazioni possono essere identificate tramite il portale EFISHGENOMICS (http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu). L'obiettivo ideale sarà all'interno dell'esone 1; tuttavia, altri esoni da 5' e l'UTR da 5' possono essere considerati.
    2. Una volta identificata la sequenza di destinazione, caricare lo strumento web EFISHGENOMICS CRISPR (http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu/crispr_tool/) liberamente disponibile. Questo strumento web utilizza una versione personalizzata dell'algoritmo CRISPOR per la generazione di destinazione50,51.
    3. Nella casella del passaggio 1,immettere il nome della sequenza e la sequenza della destinazione nella casella appropriata.
  3. Selezionare il genoma appropriato da cui deriva la sequenza. Attualmente, i dati genomici sono disponibili per B. brachyistius e B. gauderio. Le sequenze genomiche non sono necessarie per l'uso di questo strumento, ma sono utili per valutare potenziali effetti fuori bersaglio indesiderati.
  4. Selezionare il PAM appropriato. Il 20 bp-NGG PAM è raccomandato, anche se ci sono diversi motivi PAM aggiuntivi tra cui scegliere, a seconda della proteina Cas9 utilizzata.
  5. Verrà generato un rapporto con la posizione della sequenza di destinazione nel genoma con le sequenze guida suggerite. Seleziona tre bersagli con bassi effetti fuori target previsti, punteggi di specificità elevati e punteggi di efficienza elevati. Le sequenze di guida con il punteggio più alto sono evidenziate in verde sul lato sinistro. Le sequenze guida evidenziate in giallo e rosso devono essere evitate, se possibile.
  6. Facendo clic sulle sequenze target selezionate viene generato un report CRISPOR completo. Le informazioni chiave di questi rapporti sono per "T7 in vitro espressione da oligonucleotidi sovrapposti". Da questo rapporto, estrarre le seguenti informazioni: oligos sgRNA consigliati, primer PCR per il sito di destinazione e un oligomero costante che verrà utilizzato per sintetizzare tutti gli sgRNA.
  7. Ordinare gli oligomeri selezionati (passaggio 1.6) da un servizio di produzione oligonucleotide. Oligomeri e primer PCR possono essere ordinati come oligomeri dissalati standard, non è necessaria alcuna purificazione aggiuntiva.

2. Generare sgRNA

  1. Oligomeri anneali nel tubo PCR: aggiungete 1 luna di 100 ooli costanti di 100 M, 1 lgRNA di 100 M oligomero specifico dello sgRNA e 8 l di H2O senza nucleno
  2. Gli oligomeri anneali in un termociclore con il seguente programma: scaldano a 95 gradi centigradi per 5 minuti, raffreddano a -2 gradi centigradi a -2 gradi centigradi, raffreddano a 0,1 gradi centigradi e terratevi a 4 gradi centigradi.
  3. Per generare il modello sgRNA, aggiungere 2,5 ll di mix dNTP (10 mM), 2 -L di buffer 10x, 0,5 l di polimerasi di DNA T4 e 5 L di H2O senza nuclease agli oligomeri annealed dal punto 2.2. Incubare per 20 min a 12 gradi centigradi.
  4. Purificare il modello utilizzando una colonna di puli' PCR in base alle istruzioni del produttore.
  5. Elute in 20-30 gradi. Il modello deve essere 100–200 ng/l e 1,8–1,9 A260/280.
  6. Verificare tramite un gel di agarose eseguendo 1-5 . La banda dominante dovrebbe essere di 120 pb. Vedere la figura 1A per i risultati rappresentativi.
  7. Conservare il modello di sgRNA verificato in gel a -20 gradi centigradi (a lungo termine) o a 4 gradi centigradi (a breve termine, 1-4 settimane).
  8. Transcribe sgRNA utilizzando T7 RNA transcription kit aggiungendo a un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL alla temperatura ambiente 8 L di mix dNTP (volumi uguali di dA, dT, dG, dC), 2 L di 10x buffer (temperatura ambiente), 2 litri di polimerasi di T7 RNA, 10-200 ng di modello sgRNA e il volume totaledi 20 L senza nucleha fino a un volume totale di 20 L. Girare per raccogliere in basso. Incubare per 2-4 h a 37 .
  9. Aggiungete 1 -L di DNase e incubate altri 15 min a 37 gradi centigradi.
    1. Pulire lo sgRNA sommando 1 oL di glicogeno, 30 di H2O senza nuclesione, 30 luna di acetato di ammonio da 5 M e 180 luna di 100% EtOH allo sgRNA trascritto. Mescolare bene e incubare almeno 20 min a -80 gradi centigradi (fino a congelato) o a -20 gradi durante la notte. Centrifuga a 4 gradi centigradi per 15 min alla massima velocità.
  10. Rimuovere e scartare supernatante senza disturbare il pellet, e lavare con 1 mL di RNase-free 70% EtOH refrigerato a -20 gradi centigradi. Girare altri 5 min alla velocità massima a 4 gradi centigradi.
  11. Rimuovere e scartare il supernatante senza disturbare il pellet, e asciugare ad aria il pellet per 5 min.
  12. Risospendere in 30 gradi di H2O privo di nuclenonnon e determinare la purezza e la resa utilizzando la spettroscopia UV (resa minima di 200 ng/L).
  13. Verificare la presenza di sgRNA su un gel privo di RNase. Lo sgRNA appare tra 50 e 150 bp come due bande a causa della struttura secondaria (Figura 1B).
  14. Aliquota in 3 : L e conservare a -80 gradi centigradi.

3. Convalidare l'efficienza di taglio in Vitro

  1. Estrarre il DNA genomico dalle specie bersaglio utilizzando un kit di estrazione del DNA commerciale. I ritagli di pinna ventrali possono essere utilizzati senza dover sacrificare il pesce, perché i tessuti vengono rigenerati.
  2. Amplifica la regione del DNA bersaglio utilizzando i primer progettati come descritto nei passaggi 1.6 e 1.7 utilizzando la PCR standard. Verificare il prodotto mediante elettroforesi gel. Il sequenziamento del frammento per garantire l'amplazione della regione corretta è suggerito, ma non necessario. I risultati rappresentativi per il modello scn4aa sono illustrati nella Figura 2.
  3. Pulire il frammento PCR con un protocollo di laboratorio o aziendale stabilito.
  4. Conservare il DNA amplificato a -20 gradi centigradi. Considerare la possibilità di separarlo in aliquote per ridurre i cicli di congelamento-disgelo.
  5. Determinare gli importi e i volumi richiesti di ciascun componente. Considerare l'esecuzione di controlli negativi (esclusi sgRNA o Cas9) e un controllo positivo (uno sgRNA precedentemente testato che fende il DNA amplificato PCR di destinazione) se disponibile, nonché una serie di concentrazione dello sgRNA.
  6. Impostare la miscela di reazione riportata di seguito nell'ordine specificato in un tubo PCR a temperatura ambiente, aggiungendo l'ultimo sgRNA e la proteina Cas9 per ottenere i migliori risultati: 50-100 ng del prodotto PCR DNA bersaglio, 1 L di 10x buffer 3, 1 L di 10x BSA (0,1 g/mL) , 50–200 ng di proteina Cas9 (1 mg/mL, 150 ng suggeriti) e 30–200 di ng sgRNA (100 ng suggerito).
    1. Incubare la reazione a 37 gradi centigradi per 1 h e poi a 65 gradi centigradi per 10 minuti per inattivare la proteina Cas9.
    2. Eseguire l'intero campione su un gel di agarose del 2%-3% (dimensioni previste della banda compresa tra 30-200 bp) insieme a controlli positivi e negativi. Scissione di successo può mostrare alcuni del prodotto PCR, ma avrà anche due bande più piccole. I risultati rappresentativi sono riportati nella Figura 2.

4. Ottenere embrioni

NOT: Ottenere embrioni di pesce debolmente elettrico può essere difficile. Un attento monitoraggio della qualità dell'acqua, un tempo adeguato per la cura del pesce e un'alimentazione regolare sono la chiave per un programma di allevamento di successo. I pesci devono prima essere condizionati per diverse settimane per la riproduzione52 come descritto nella fase del protocollo 4.1. In seguito, viene presentato un protocollo che aumenta la gametogenesi naturale (4.2) per l'uso nel comportamento riproduttivo naturale (4.3), un'alternativa sviluppata in vitro recentemente sviluppata per ottenere embrioni a tempo preciso (4.4). Protocollo 4.3 è altrettanto efficace per B. brachyistius e B. gauderioe protocollo 4.4 è superiore in B. gauderio.

  1. condizionamento
    1. Mantenere B. brachyistius in coppie / piccoli gruppi (100-150 L carri armati) o in serbatoi molto grandi (2 maschi e 5-6 femmine in circa 475 L serbatoio), come diventano molto aggressivi in condizioni di allevamento. Devono essere presenti almeno 1-2 tubi in PVC per pesce da utilizzare come riparo (Figura 3A,B).
    2. B. gauderio può essere allevato ad una densità molto più alta. Mantenere fino a otto individui in un serbatoio da 100 L (2 maschi e 6 femmine). Ci dovrebbe essere almeno 1 tubo di PVC per pesce da utilizzare come riparo. L'aggiunta di filati aggrovigliati aumenta l'arricchimento e i nascondigli. Aggiungere tubi di centrifuga 50 mL con fori di 1 cm di diametro forati in essi alla parte superiore del serbatoio per consentire agli adulti di deporre le uova naturalmente nei tubi (Figura 3C).
    3. Durante la stagione riproduttiva, nutrire i pesci ogni giorno vermi neri freschi integrati con vermi vermi rossi congelati. Il cibo può essere arricchito con vitamine e integratori, se lo si desidera.
    4. I pesci della casa normalmente in una conduttività relativamente elevata (300-600 s), soluzione bilanciata per il pH. Durante la stagione riproduttiva, ridurre gradualmente la conduttività di almeno la metà nel corso di 1-3 settimane per indurre la recrudescenza gonad e la deposizione delle uova. Minore conduttività per aggiunte giornaliere di acqua di osmosi inversa (RO), mantenendo molta attenzione al pH quando la conduttività è bassa (pH <6).
    5. Le condizioni di riproduzione possono essere mantenute per circa 3/5 mesi con la produzione di uova che si sta dimenando nel tempo. Dopo questo periodo, riportare il pesce ad alta conduttività lentamente per 1-3 settimane. Mantenere altri 3 mesi ad alta conduttività prima di essere esposti nuovamente alle condizioni di riproduzione.
  2. Utilizzare iniezioni di agente di deposizione delle uova (SGnRHa e Domperidone).
    1. Identificare i pesci di femmina in condizioni di allevamento che appaiono gravid(Figura 4). In B. gauderio la femmina avrà gonadi gonfie gondai appena caudali allo sfiato. B. brachyistius femmine avranno pance gonfie e appaiono corpo profondo (Figura 4A). I maschi generalmente non hanno un problema producendo spermato. Tuttavia, i maschi più grandi sono preferiti a causa del volume di sperma più grande raccolti.
      NOT: L'agente spawning è un mix di ormoni commerciali che facilita la maturazione dei gameti e coordina la deposizione delle uova. Se il pesce è stato iniettato con agente di deposizione delle uova in passato, attendere >4 settimane di riposo e un'ampia alimentazione tra le iniezioni. Si consiglia di iniettare almeno 2 maschi e 4-5 femmine per garantire un paio di covate di uova e un sacco di spermatozoi.
    2. Anestesizzare il pesce in MS-222 (0,4 g/3 L) per alcuni minuti, fino a quando il pesce non è in grado di mantenere la sua postura, è immobile, ma continua ad avere movimento opercolare (Stadio II53).
    3. Pesare il pesce (g) per calcolare la quantità dell'agente di deposizione delle uova, (0,5 l/g) - 0,5 l. L'extra 0,5- L tiene conto degli errori di pipettaggio.
    4. Aggiungere l'agente di deposizione delle uova a volumi 4x di buffer (1x PBS o DPBS) in un tubo PCR e mescolare bene. La soluzione diventerà torbida. Aiuta a erogare l'agente di deposizione delle uova sulla termoplastica e quindi utilizzare una pipetta per misurare la dose calcolata. L'agente riproduttivo è viscoso, quindi assicuratevi di dispensare l'intera dose e fare attenzione con la pipettatura.
    5. Pipette la soluzione di iniezione su termoplastica e disegnare in una siringa di vetro di precisione, evitando bolle d'aria. Si consiglia un ago smussato da 28 G, 19–25 mm.
    6. Iniettare la soluzione nel muscolo del tronco dorsale ad un ritmo regolare. Lasciare l'ago sedersi per 2-4 s e poi rimuovere. Mettere immediatamente il pesce in acqua di sistema fresco per il recupero.
    7. Dopo circa 24 h prepararsi per la raccolta degli embrioni (vedi 4.3 o 4.4). Raccogliere tutti i materiali necessari, tra cui ciò che è necessario per la microiniezione a singola cellula (vedi sezione 5).
  3. Ottenere gli embrioni attraverso la deposizione naturale delle uova.
    1. Casa deposizione delle uova agenti iniettati adulti (4.2) in un grande 450 L serbatoi. I rapporti sessuali più efficaci sono stati tipicamente 1-2 maschi e 3-4 femmine con adeguati nascondigli fatti da tubi in PVC, e substrato di marmo scuro sul fondo del serbatoio per impedire il consumo di uova. I marmi sono in genere più importanti per B. brachyistius rispetto a B. gauderio, che preferiscono depositare le loro uova appiccicose in fessure o tubi centrifugati 50 mL come descritto sopra.
    2. Posizionare i pesci in un ciclo di luce inverso per abbinare la deposizione notturna delle uova agli orari di lavoro di laboratorio regolari. Utilizzando un sistema di sicurezza di livello consumer pronto per l'uso, monitorare i pesci utilizzando l'illuminazione a infrarossi per ridurre al minimo il disturbo da un PC collegato in remoto (Figura 3).
    3. Il pesce si depongono spontaneamente durante il periodo fotografico scuro di circa 24 h dopo l'iniezione dell'agente di deposizione delle uova.
    4. Quando inizia la deposizione delle uova, raccogliere le uova ogni ora mentre si verifica il comportamento di deposizione delle uova. In B. brachyistius, raccogliere le uova utilizzando un sifone di piccolo diametro su una rete di rete di cotone fine per ridurre al minimo i danni alle uova appena degenerate. Raccogliere le uova b. gauderio da tubi di centrifuga 50 mL o substrato del serbatoio. Lavora in modo efficiente con un disturbo minimo per generare pesci utilizzando una lampada a testa con una luce rossa a bassa intensità. Poiché la prima scissione si verifica circa 1 h dopo la fecondazione (HPF), una grande porzione di uova sarà adatta per la microiniezione a cella singola.
    5. Procedere immediatamente alla microiniezione (cfr. sezione 5).
  4. Spremere i maschi per la fecondazione in vitro di B. gauderio.
    1. Preparare la soluzione di sperma sieluto (SES) come descritto in The zeebrafish Book54: 10 mM HEPES, 80 mM KCl, 45 mM NaCl, acetato di sodio da 45 mM, 0,4 mM CaCl2e 0,2 mM MgCl2 .
      1. Utilizzare ddH2O per portare a volume e regolare il pH a 7,7 con 1 M NaOH.
      2. Conservare in frigorifero.
      3. Filtrare attraverso un filtro di 0,22 m prima dell'uso.
    2. Anestesizzare il pesce in MS-222 (0,4 g/3 L) per alcuni minuti, fino a quando il pesce non è in grado di mantenere la sua postura, è immobile, ma continua ad avere movimento opercolare (Stadio II53). Mettete nel ghiaccio 500 aliquote di SES.
    3. Mani secche e pesci accuratamente, soprattutto intorno alla testa e sfiato. Posizionare il lato ventrale verso l'alto, anteriore a sinistra (per gli individui destrorsi) in un porta schiuma/spugna di polistirolo coperto in un asciugamano di carta umido e imbevuto di MS-222. La testa deve essere il più parallela possibile al tavolo.
      NOT: I passi da 4.4.4–4.4.6 devono essere eseguiti il più rapidamente possibile, e il pesce dovrebbe essere fuori dall'acqua solo per 30-60 s.
    4. Applicare la pressione nel caudale alla direzione rostrale con la luce che stringe mediamente sulle gonadi verso lo sfiato. Il pesce può espellere i rifiuti. Fare attenzione a pulire lo sfiato con un compito delicato pulire se i rifiuti vengono espulsi. Non raccogliere i rifiuti con spermato. A seconda delle dimensioni del maschio, è comune 10-60 .
    5. Utilizzando un micropipetter con una punta, raccogliere con cura lo sperma come viene spremuto dal maschio in incrementi di 50 .L. Mettere lo sperma direttamente in 500 litri di SES sul ghiaccio. Può essere utile avere un altro ricercatore assistere nella raccolta di spermatori, mentre l'altro stringe. Lo sperma deve essere utilizzato il prima possibile, ma rimane vitale per almeno 1 h.
    6. Subito dopo la raccolta, mettere il pesce in acqua di sistema fresco per il recupero. Il pesce dovrebbe essere fuori dall'acqua solo per 30-60 s.
  5. Spremere le femmine per la fecondazione in vitro di B. gauderio.
    1. Anestesizzare il pesce in MS-222 (0,4 g/3 L) per alcuni minuti, fino a quando il pesce non è in grado di mantenere la sua postura, è immobile, ma continua ad avere movimento opercolare (Stadio II53). Posizionare il foglio in politetrafluoroethene sulla stazione di lavoro.
      NOT: Le sezioni 4.5.1–4.5.5 devono essere fatte il più rapidamente possibile e il pesce dovrebbe essere fuori dall'acqua solo per 30-60 s.
    2. Mani secche, utensili, fogli di politetrafluorethene e pesci accuratamente, soprattutto intorno alla testa e allo sfiato. Posizionare sul lato con la testa rivolta anteriore (per le persone destre).
    3. Applicare la pressione nel caudale alla direzione rostrale con la luce che stringe mediamente sulle gonadi verso lo sfiato. Il pesce può espellere i rifiuti. Fare attenzione a pulire lo sfiato con un compito delicato pulire se i rifiuti vengono espulsi. A seconda delle dimensioni del pesce, 20-150 uova sono comuni. Utilizzando una spatola/strumento rivestito in politetrafluoroethene raccogliere con cura le uova come vengono spremute dalla cloaca. Spostare rapidamente le uova in un piccolo piatto Petri e coprire. Assicurarsi che le uova rimangano asciutte durante questo processo. In alternativa, dopo la spremitura, toccare la massa di uova alla base di un piccolo piatto Petri o al foglio di politetrafluoroethene mentre vengono espulsi dalla femmina.
    4. Subito dopo la raccolta, mettere il pesce in acqua di sistema fresco per il recupero.
  6. Eseguire la fecondazione ossea per la fecondazione in vitro di B. gauderio.
    1. Aggiungete 100 l di sperma tosù ben mescolati in SES (vedi passo 4.4) direttamente sopra la massa dell'uovo.
    2. Aggiungere 1 mL di acqua di sistema (filtrata attraverso un filtro da 0,22 m) e mescolare bene per 30-60 s.
    3. Aggiungere un ulteriore 1-2 mL di acqua di sistema (lasciare un po 'di spazio nella piastra Petri) e mettere in incubatrice. Registrare il tempo di fecondazione in vitro sul piatto Petri e passare a un'incubatrice di 29 gradi centigradi. Impostare un timer di 50 min per controllare l'avanzamento dello sviluppo (ad esempio, la formazione della singola cella al polo dell'animale, vedere Figura 6). Durante questo periodo, preparare i materiali per la microiniezione.

5. Microiniezione a cella singola

  1. Tirare gli aghi di microiniezione prima delle iniezioni dell'agente di deposizione delle uova (passaggio 4.2) o la deposizione naturale delle uova (passaggio 4.3). Utilizzare un capillare in vetro borosilicato con un filamento (O.D. 1.0 mm, I.D. 0,58 mm, 10 cm di lunghezza) e un ape estraente per tirare gli aghi di microiniezione. Preparare 2-4 aghi per ogni iniezione di trattamento pianificata.
    NOT: Gli aghi di backloading con un filamento sono preferiti, perché il filamento blocca la soluzione verso la punta ed elimina le bolle. Tuttavia, gli aghi senza filamento possono essere utilizzati e il frontloading non dovrebbe avere alcun effetto sul risultato. L'ago dovrebbe avere un cono lungo ma robusto. Utilizzare il programma di trazione dell'ago con le seguenti specifiche come punto di partenza: calore 500; Tirare 70; Velocità : 70; e il tempo è 100. Le morfologie dell'ago rappresentativo sono mostrate nella Figura 5A.
  2. Preparare la soluzione di iniezione e preparare l'ago.
    1. Aggiungete 0,9 l di sgRNA e 0,9 l di enzima DiCas9 (1 mg/mL) a 0,2 - L del 10% o 100% di fenolo rosso (rispettivamente per 1% e 10% di concentrazione rossa di fenolo finale) in un tubo PCR. Mescolare bene e lasciare sondare sul ghiaccio 2/5 min per consentire sgRNA e Cas9 a complesso. Calcolare la concentrazione finale di sgRNA, Cas9 e fenolo rosso nella soluzione di iniezione.
      NOT: Se ci sono problemi con l'intasamento dell'ago o l'efficienza di taglio utilizzando la ricetta di cui sopra, può essere utile utilizzare un 1x mix sale/buffer di concentrazione finale per stabilizzare Cas9 e prevenire l'intasamento dell'ago.
    2. Utilizzare una punta di pipetta microloader per eseguire il backload della soluzione 2 -L nell'ago di microiniezione. Espellere il liquido il più vicino possibile alla punta.
    3. Caricare l'ago nel micromanipolatore e impostare le impostazioni di pressione (iniziare con 775 pi, 0,1,2 s e 8-12 pc).
    4. Sotto il mirino, utilizzare una coppia di pinze sottili per rompere la punta dell'ago con un angolo smussato. Rompere verso dove il cono dell'ago inizia ad avere rigidità. È meglio rompere più vicino alla punta, testare le dimensioni della soluzione di iniezione e poi rompere ulteriormente se necessario. Il foro dell'ago deve rimanere il più piccolo possibile, pur mantenendo un cono rigido (Figura 5A).
    5. Utilizzare olio minerale e un micrometro per misurare le dimensioni della soluzione di iniezione. 1–2 nL viene in genere utilizzato; Il diametro di 0,1 mm è 0,5 nL.
    6. Regolare le impostazioni della punta dell'ago o della pressione per ottenere un volume di iniezione entro le specifiche.
  3. Identificare gli zigoti in via di sviluppo e preparare la fase di iniezione. Impostare la fase di iniezione. Prendete una parabola Petri di 100 mm di diametro. Invertire la parte inferiore e quella posizionata sotto la parte superiore invertita. Posizionare un vetrino in vetro all'interno della parte superiore invertita. A seconda di come il micromanipolatore è montato al mirino, l'altezza aggiunta dalla base invertita potrebbe non essere necessaria.
    1. Guardate le uova in via di sviluppo e identificate presunti zigoti fecondati 50-60 min dopo la fecondazione in vitro. Il polo animale inizierà a formarsi e ci sarà un eccesso di piccole goccioline di grasso intorno all'interfaccia delle cellule del tuorlo /animale (Figura 6).
    2. Raccogliere 10-20 uova con meno acqua possibile utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica (tagliare leggermente la punta per consentire alle uova di passare) e posizionare sul bordo del vetrino. L'acqua sarà malvagia sotto lo scivolo e tirare le uova contro il bordo.
    3. Utilizzare un delicato compito pulire e premere delicatamente la diapositiva per rimuovere l'acqua in eccesso e lasciare che le uova ad aderire saldamente al bordo della diapositiva. Ci dovrebbe essere abbastanza acqua per mantenere le uova umide pur mantenendo poca umidità in piedi per evitare il movimento delle uova durante l'iniezione.
  4. Iniettare direttamente in cella singola.
    1. Allineare le uova contro la diapositiva verticalmente, perpendicolarmente all'ago che si avvicina (Figura 5B).
    2. Utilizzando il micromanipolatore, posizionare l'ago contro il chorion. Ad un angolo di circa 45 gradi, inserire l'ago nel chorion, quindi nella singola cella. Può essere utile inserire la singola cella attraverso il tuorlo. Lo spostamento di entrambe le fasi di iniezione con la mano libera e il micromanipolatore può fornire un maggiore controllo sul processo di iniezione (Figura 5B).
    3. Iniettare la soluzione rossa sgRNA/Cas9/fenolo nella singola cellula. Rimuovere con attenzione l'ago. Procedere all'uovo successivo e ripetere i passaggi da 5,4.1 a 5.4.3 fino a quando non vengono iniettati tutti gli ovuli.
    4. Rimuovere eventuali uova rotte durante l'iniezione con pinze sottili. Utilizzare 0,22 m di acqua di sistema filtrata in una bottiglia di spruzzo per rimuovere delicatamente le uova dalla fase di iniezione in una nuova tela Petri di 100 mm di diametro.
    5. Ripetere i passaggi da 5.3.3–5.4.6 fino a quando tutte le uova non sono state iniettate o sviluppate allo stadio a due cellule. Assicurarsi di mettere da parte circa 20 presunti ovuli fecondati come controllo di non iniezione per determinare i tassi di fecondazione e il successo dell'iniezione. Per le frizioni più grandi utilizzare embrioni non iniettati che si sono sviluppati fino allo stadio a due cellule, e per le frizioni più piccole accantonati presunti uova fecondate.
    6. Inoltre, considera un controllo sgRNA/iniezione iniettando 15-25 embrioni con Cas9 complesso con uno sgRNA contro un gene che non è presente nel genoma. Il gene GFP raccomandato per gli embrioni selvatici. Registrare il numero di uova, i genitori, il tempo di fecondazione in vitro e la data su ogni piatto Petri. Includere il bersaglio sgRNA o l'etichetta come non iniettati. Spostarsi in un'incubatrice di 29 gradi centigradi.

6. Allevamento degli animali

  1. Prenditi cura delle uova.
    1. Controllare la vitalità dell'uovo 4–6 h dopo le iniezioni.
    2. Registrare il numero di uova morte, così come quelli che non sono fecondati. Le uova non fecondate si arresteranno intorno allo stadio a otto cellule e avranno un modello di rosetta delle cellule al polo animale (Figura 6). A seconda del numero di uova morte e della quantità di detriti di uova nell'acqua, rimuovere almeno il 50%-80% dell'acqua e sostituirlo con acqua di sistema filtrata. Può essere utile strofinare il fondo della parabola di Petri se si forma una pellicola di detriti cellulari o un biofilm.
    3. Per i prossimi 2-3 giorni, controlla le uova da 1 a 2 volte al giorno. Ripetere i passaggi da 6.1.2– 6.1.3 ogni volta che le uova vengono controllate.
    4. Dopo 2/3 giorni le larve si schiuderanno. Rimuovere tutti gli involucri delle uova mentre si schiudono. La pipettatura delicata può aiutare a liberare le larve semi-hatched.
  2. Cura per le larve.
    1. Controlla le uova 1/2x al giorno. Ripetere i passaggi da 6.1.2–6.1.3 ogni volta che vengono controllate le larve.
    2. Dal 6 al 14 DPF, nutrire le anguille di aceto alle larve. Un leggero eccesso di cibo è buono, perché le anguille di aceto rimarranno vive nel piatto. Aggiungere le anici di aceto ogni volta che il piatto viene controllato e pulito.
    3. Dall'11 al 14 DPF, aggiungere 5-10 Artemia appena schiusa per larve oltre alle anguille di aceto. Durante questo periodo le larve impareranno a mangiare l'Artemiache nuota liberamente.
    4. A 15 DPF, spostare le larve in tazze di uova (vedi sezione 6.2.5) in un serbatoio con acqua corrente, filtrazione e aerazione. Non ci dovrebbero essere più di 25 embrioni per tazza. Le tazze di uova sono tazze di plastica con una rete a rete sul fondo. Un piatto Petri da 100 mm superiore/inferiore può essere aggiunto sul fondo della tazza di uova per aiutare a fermare il cibo di cadere attraverso la rete. Le tazze di uova permettono al pesce di essere alloggiato in un volume maggiore di acqua per motivi di qualità dell'acqua, pur mantenendo gruppi discreti. Continua ad aggiungere sia le anguille di aceto che l'Artemia appena schiusa per i giorni 15-18. Pulire pezzo piatto Petri tutti i giorni e utilizzare una pipetta per rimuovere masse di Artemiamorta .
    5. Dai giorni 18-30, nutrire solo Artemiaappena schiusa . Aumentare la quantità di alimentazione come il pesce cresce e se la coda mordere è visto.
    6. Dopo circa 30 giorni, spostare il pesce a 10 L (2,5 galloni) serbatoi, circa 25 individui per serbatoio. Assicurati che ci sia la filtrazione, l'aerazione e i luoghi per nasconderti. Considerare i supporti di biofiltrazione cilindrica e i tubi in PVC di piccolo diametro.
    7. Nutrire Artemia appena nati e vermi neri da circa 30-45 giorni in poi. Mantenere la pulizia standard e i cambi d'acqua per il serbatoio (ad esempio, al minimo 10%–20% di variazione dell'acqua per 1 settimana).
    8. Dopo il 45 usd dPF, nutrire solo i vermi neri fino a 60 dollari DPF.
    9. Dopo 60 Dollari DPF, spostare le coorti di circa 15 a 40 l (10 galloni) serbatoi e iniziare le procedure di allevamento degli adulti. Aggiungere tubi in PVC e un filo "mop" (una massa di filato marrone legato intorno a un tappo di sughero) per nascondigli (Figura 3C). I pesci dovrebbero essere vicini alle dimensioni dell'allevamento (10-12 cm) dopo circa 3/4 mesi dopo la fecondazione.

7. Marito Adulto

  1. Nutrire i pesci ogni giorno con abbastanza vermi neri in modo che una piccola quantità di vermi neri sono presenti alla prossima alimentazione. Questa alimentazione ad libitum permette la crescita massima.
  2. Un paio di volte a settimana, può essere utile per integrare l'alimentazione di vermi neri con vermi del sangue.
  3. Pulire i serbatoi ogni 2-4 settimane con un cambio d'acqua del 20%-30%. Se il filo si ama di biofilm/alga, strofinare pulito sotto acqua RO.

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Risultati

I siti di destinazione dello sgRNA sono stati identificati all'interno dell'esone 1 di scn4aa in B. gauderio e B. brachyistius come descritto nella Sezione 1. Gli sgRNA sono stati generati come descritto nella Sezione 2. A seguito del successo della selezione e della sintesi dello sgRNA (Figura 1), è stata testata la scissione in vitro (Figura 2). Gli sgRNA che dimostrano il taglio in vitro sono stati poi selezionati per le microiniezi...

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Discussione

La ricchezza fenotipica dei pesci debolmente elettrici, insieme a una recente proliferazione delle risorse genomiche, motiva un forte bisogno di strumenti genomici funzionali nel modello di pesce debolmente elettrico. Questo sistema è particolarmente attraente a causa della convergente evoluzione di numerosi tratti fenotipici in linee parallele di pesci, che sono facilmente conservati in laboratorio.

Il protocollo qui descritto dimostra l'efficacia della tecnica CRISPR/Cas9 nei lignaggi di pes...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono gli sforzi eroici di Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud e Hope Healey per l'aiuto con l'allevamento dei pesci, la raccolta dei dati e lo sviluppo del protocollo iniziale. Vorremmo anche ringraziare i tre recensori per i loro suggerimenti al manoscritto. Crediamo che il prodotto finale sia di migliore qualità dopo aver affrontato i loro commenti. Questo lavoro è stato finanziato dal sostegno della National Science Foundation #1644965 e #1455405 al JRG, e dalla sovvenzione della DG del Consiglio per le Scienze Naturali e la Ricerca Ingegneria a VLS.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
20 mg/mL RNA grado GlicogenoThermo ScientificR0551
50 bp DNA ladderNEBN3236L
Capillare in vetro borosilicato con filamentoSutter InstrumentBF100-58-10(O.D. 1,0 mm, I.D. 0,58 mm, 10 cm lunghezza)
Proteina Cas9 con NLS; 1 mg/mLPNA BiologyCP01
Dneasy Blood & Kit di fazzolettiQiagen69506
Eppendorf FemptoJet 4i MicroiniettoreFisher ScientificE5252000021
Eppendorf Microloader Puntali per pipetteFisher Scientific 10289651
Siringa HamiltonFisher Scientific14-824-654indicata come "siringa di vetro di precisione" nel protocollo
KimwipeFisher Scientific06-666indicato come "delicate task wipe" nel protocollo
MEGAscript T7 Kit di trascrizioneInvitrogenAM1334
NEBuffer 3NEBB7003Sutilizzato per il test di scissione in vitro
Kit OneTaq DNANEBM0480L
OvaprimSyndel USAhttps://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.htmlindicato come "agente di riproduzione" nel protocollo
ParafilmFisherScientific S37440indicato come "termoplastico" nel protocollo
Estrattore per pipetteWPISU-P97marca sutter
di purificazione QIAquick PCR Qiagen28106
Ago riutilizzabile- richiede la personalizzazioneFisherScientific 7803-02Personalizza a 0,7 pollici di lunghezza; punto stile 4 e angolo 25
DNA polimerasi T4NEBM0203LUtilizzare con il tampone NEB 10x incluso
Strumenti rivestiti in teflonbonefolder.comT-SPATULA4PIECEindicato come "politetrafluoroetilene" nel protocollo
Kit

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