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Articolo metodologico

Analisi kinematica 3D per la valutazione funzionale nel modello di ratto di lesioni da schiacciamento del nervo sciatico

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DOI:

10.3791/60267

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12 febbraio 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Development and Rehabilitation of Motor Function, Human Health Sciences, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 2Department of Motor Function Analysis, Human Health Sciences, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 3Department of Otolaryngology, The Ohio State University Wexner Medical Center

In questo articolo

Sommario

Introduciamo un metodo di analisi cinetica che utilizza un apparato di motion capture tridimensionale contenente quattro telecamere e software di elaborazione dati per eseguire valutazioni funzionali durante la ricerca fondamentale che coinvolge modelli di roditori.

Abstract

Rispetto allo Sciatic Functional Index (SFI), l'analisi cinetica è un metodo più affidabile e sensibile per eseguire valutazioni funzionali di modelli di roditori di lesioni nervose sciatiche. In questo protocollo, descriviamo un nuovo metodo di analisi cinetica che utilizza un apparato di cattura del movimento tridimensionale (3D) per valutazioni funzionali utilizzando un modello di lesioni da schiacciamento del nervo sciatico del ratto. In primo luogo, il ratto ha familiarità con tapis roulant a piedi. I marcatori vengono quindi attaccati ai punti di riferimento ossei designati e il ratto viene fatto camminare sul tapis roulant alla velocità desiderata. Nel frattempo, i movimenti degli arti posteriori del ratto vengono registrati utilizzando quattro telecamere. A seconda del software utilizzato, i tracciati dei marcatori vengono creati utilizzando sia le modalità automatiche che manuali e i dati desiderati vengono prodotti dopo sottili regolazioni. Questo metodo di analisi cinematica, che utilizza un apparato di cattura del movimento 3D, offre numerosi vantaggi, tra cui precisione e precisione superiori. Molti altri parametri possono essere studiati durante le valutazioni funzionali complete. Questo metodo presenta diverse carenze che richiedono considerazione: il sistema è costoso, può essere complicato da utilizzare e può produrre deviazioni dei dati a causa dello spostamento della pelle. Tuttavia, l'analisi cinematica utilizzando un apparato di cattura del movimento 3D è utile per eseguire valutazioni funzionali degli arti anteriori e posteriori. In futuro, questo metodo potrebbe diventare sempre più utile per generare valutazioni accurate di vari traumi e malattie.

Introduzione

Lo Sciatic Functional Index (SFI) è il metodo di riferimento per effettuare valutazioni funzionali del nervo sciatico1. La SFI è stata ampiamente adottata ed è spesso utilizzata all'interno di vari studi di valutazione funzionale sulle lesioni nervose sciatiche del ratto2,3,4,5,6. Nonostante la sua popolarità, ci sono diversi problemi con SFI, tra cui l'automutilazione7, il rischio di contrattura articolare e la smearing delle impronte8. Questi problemi influenzano seriamente il suo valore prognostico9. Pertanto, è necessario un metodo alternativo, meno soggetto a errori, in sostituzione del SFI.

Uno di questi metodi alternativi è l'analisi cinematica. Questo include un'analisi completa dell'andatura utilizzando marcatori di tracciamento collegati a punti di riferimento ossei o giunti. L'analisi cinematica è sempre più utilizzata per le valutazioni funzionali9. Questo metodo viene progressivamente riconosciuto come uno strumento affidabile e sensibile per la valutazione funzionale10 senza le carenze attribuite al SFI11,12.

In questo protocollo, descriviamo una serie di analisi cinematiche che utilizzano un apparato di motion capture 3D costituito da un tapis roulant, quattro telecamere a dispositivo accoppiato caricato da 120 Hz (CCD) e software di elaborazione dati (vedere Tabella dei materiali). Questo metodo di analisi cinematica differisce dal video walking generale o analisi dell'andatura13,14. Due telecamere sono posizionate in direzioni diverse per registrare i movimenti degli arti posteriori da un solo lato. Successivamente, un modello digitale 3D dell'arto posteriore viene costruito utilizzando la computer grafica9. Possiamo calcolare angoli articolari designati, come l'anca, il ginocchio, la caviglia e l'articolazione delle alture, ricapitolando strettamente le dimensioni effettive degli arti. Inoltre, possiamo determinare vari parametri come la lunghezza passo/passo e il rapporto tra la fase di posizione e la fase di oscillazione. Queste ricostruzioni si basano su un modello digitale 3D completamente ricostruito degli arti posteriori, generato dai dati trasmessi da due serie di telecamere. Anche la traiettoria del centro di gravità immaginario (CoG) può essere calcolata automaticamente.

Abbiamo usato questo apparato di cattura del movimento 3D per introdurre e valutare più parametri cinematici che rivelano cambiamenti funzionali nel tempo nel contesto del modello di lesioni da deflusso del nervo sciatico del ratto.

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Protocollo

Il protocollo è stato approvato dal comitato di sperimentazione animale dell'Università di Kyoto, e tutte le fasi del protocollo sono state eseguite in conformità con le linee guida del comitato di sperimentazione animale, Kyoto University (numero di approvazione: MedKyo17029).

1. Familiarizzare i ratti con il tapis roulant che cammina

  1. Impostare due fogli di plastica trasparente su entrambi i lati del tapis roulant per far camminare un ratto Lewis di 12 settimane in una direzione dritta e anteriore, quindi accendere la griglia di scossa elettrica.
  2. Fai camminare ogni topo sul tapis roulant. Accelerare gradualmente il tapis roulant alla velocità desiderata (20 cm/s o 12 m/min) e lasciare che il topo cammini normalmente a questa velocità per 5 min. Dopo ogni sessione a piedi, offri una pausa di riposo di 1-2 min. Ripetere questo processo 3 volte al giorno, 5 giorni alla settimana, per 1 settimana.
    NOTA: Avviare il tapis roulant camminando 1 settimana prima del passaggio 2.
  3. Ratti domestici in gruppi di tre per gabbia con un ciclo di 12 h luce-scuro e alimentano cibo commerciale ratto e acqua del rubinetto ad libitum.

2. Esecuzione della lesione da schiacciamento del nervo sciatico

  1. Mettere il ratto in una camera di induzione dell'anestesia e introdurre la soluzione di inalazione dell'isoflurane del 5%.
  2. Fornire un'iniezione intraperitoneale di un anestetico combinato preparato con 0,15 mg/kg di idrocloruro di medetomidina, 2 mg/kg midazolam e 2,5 mg/kg maororfatolo tartrate al ratto. Verificare la mancanza di riflessi del pedale. Poi radere un'area dalla sinistra trochanter maggiore alla coscia media con un rasoio elettrico.
  3. Stendere un pezzo di stoffa asettica, posizionare il topo su di esso, e farlo sdraiare nella posizione laterale sinistra. Posizionare strumenti chirurgici sterili anche sul panno.
  4. Creare un'incisione dritta dal trochanter maggiore alla coscia media con una lama chirurgica n. 10. Quindi eseguire una dissezione smussata tra quadricipiti femoris e bicipiti femoris utilizzando un hemostat chirurgico per esporre il nervo sciatico.
  5. Staccare il nervo sciatico dal tessuto circostante con due paia di microforzate e schiacciare il nervo sciatico per 10 s, utilizzando un hemostat chirurgico standard, per creare una lesione di schiacciamento lungo 2 mm nel sito direttamente sotto la tuberosità glutea.
  6. Eseguire un punto epineurale in nylon 9-0 all'estremità prossima dell'infortunio utilizzando un paio di microforzape e quindi chiudere il muscolo e la pelle con suture di nylon 4-0.
  7. Fornire un'iniezione intraperitetica di un antagonista anestetico anestetico preparato con 0,3 mg/kg di idrocloruro al ratto, per svegliarlo entro 10 minuti. Dopo che il ratto si riprende dall'anestesia, osservare i movimenti dei dito sinistro mentre il ratto è sospeso dalla base della coda. Se il dito non si diffonde affatto, l'intervento è riuscito.
  8. Casa i ratti individualmente dopo l'intervento chirurgico con un ciclo di 12 h luce-scuro e dar loro da mangiare cibo commerciale ratto e acqua del rubinetto ad libitum.

3. Attaccare i marcatori

  1. Posizionare il ratto addestrato in una camera di induzione per anestesia e introdurre una soluzione di inalazione isoflurane del 5%. Verificare la mancanza del riflesso del pedale pizzicando la punta.
  2. Lasciare che il ratto sia continuamente aerato utilizzando una maschera anestetica (2% soluzione di inalazione isoflurano). Mentre il ratto riceve anestesia stabile, radere un'area dalla parte bassa della schiena ai malleoli bilaterali utilizzando un rasoio elettrico.
    AVVISO: Per evitare di esporre i ricercatori all'isoflurane che perde, assicurarsi che la maschera copra strettamente la testa e la faccia del ratto.
    NOTA: Per evitare lesioni al topo, rasare i capelli il più delicatamente possibile.
  3. Posizionare il ratto in posizione prona. Utilizzare una pennarello nera per contrassegnare i seguenti punti di riferimento ossei sulla pelle rasata: una linea attraverso i processi spinosi dalle vertebre lombari a quella sacra, le spine iliache superiori anteriori, i trochanter maggiori, le articolazioni del ginocchio, i malleoli laterali, il quinto articolazioni metatarshalangeal, e la punta del quarto dito del dito.
    NOTA: La linea attraverso i processi spinosi viene utilizzata per determinare se i marcatori bilaterali sono assialmente simmetrici.
  4. Utilizzare un adesivo liquido per attaccare marcatori emisferici a questi punti di riferimento ossei, ad eccezione della linea attraverso i processi spinosi dallo zolle alle vertebre sacrali e la punta del quarto dito. Usa colori distinti per ogni altro punto di riferimento per evitare confusione. La punta del quarto dito è contrassegnata con inchiostro rosa.
    MASSIMA: Fare attenzione a non gocciolare adesivo sulla pelle esposta dell'operatore.
  5. Dopo aver posizionato tutti i marcatori, rimettere il topo nella gabbia. Non mettere il ratto sul tapis roulant fino a quando non si riprende completamente dall'anestesia.
    NOTA: La ridotta consapevolezza può influenzare seriamente la camminata normale se il ratto non si riprende completamente dall'anestesia.

4. Calibrazione e configurazione del software

  1. Impostare due fogli di plastica trasparente su entrambi i lati del tapis roulant e posizionare la scatola di calibrazione al centro del tapis roulant. Aprire il software di registrazione e quindi fare clic sull'icona Calibrazione immagine sul display (File supplementare 1).
  2. Fare clic sull'icona Registrazione per registrare 1-2 s di video da quattro direzioni utilizzando telecamere CCD da 120 Hz. Fare di nuovo clic sull'icona Registrazione per interrompere la registrazione.
    NOTA: Il video verrà salvato automaticamente una volta interrotta la registrazione.
  3. Aprire il file video nel software di calcolo. Fare clic e trascinare i punti caratteristici dei modelli 3D della casella di calibrazione nell'angolo inferiore destro dello schermo ai marcatori corrispondenti sulle quattro immagini, che vengono trasformati automaticamente dal video nel modello di calibrazione (Supplementary File 2). Quindi fare clic sull'icona Salva.
    NOTA: non modificare le posizioni delle telecamere al termine della calibrazione.

5. Registrazione della camminata

  1. Estrarre la scatola di calibrazione dal tapis roulant, accendere la griglia di scosse elettriche e posizionare il ratto completamente sveglio sul tapis roulant. Aprire il software di registrazione e immettere le informazioni di base sul ratto, tra cui il numero di serie, la velocità di deambulazione e il nome dell'operatore principale.
  2. Accendere il tapis roulant e impostare la velocità a 20 cm/s. Dopo che il ratto si adatta alla velocità ed è in grado di camminare normalmente, fare clic sull'icona Registrazione sul display per registrare il ratto a piedi con le quattro telecamere. Una volta registrati abbastanza passi (>10), fare di nuovo clic sull'icona per interrompere la registrazione e disattivare il tapis roulant.
    NOTA: Il video verrà salvato automaticamente una volta interrotta la registrazione.
  3. Rimettere il ratto nella camera di induzione dell'anestesia per l'anestesizzazione. Mentre il ratto è in anestesia continua (somministrato tramite la maschera anestetica), rimuovere i marcatori emisferici.
    NOTA: Rimuovere i marcatori il più delicatamente possibile per evitare di causare dolore al ratto.
  4. All'ora prestabilita (ad esempio, 1 settimana, 3 settimane o 6 settimane dopo l'intervento chirurgico), eseguire la misurazione cinematica sul ratto ripetendo i passi da 3.1–5.3. Effettuare la misurazione cinematica solo una volta, all'inizio dell'esperimento, per i ratti che non hanno ricevuto un intervento chirurgico (cioè il gruppo di controllo).

6. Tracciamento dei marcatori

  1. Aprire il software di calcolo e aprire il file video sull'interfaccia.
  2. Fare clic e trascinare la barra di controllo bilaterale sulla barra di avanzamento del video per assicurarsi che venga visualizzato solo un record a piedi del tapis roulant in 10 passaggi (File supplementare 3). Fare clic e trascinare ogni punto caratteristico dal modello 3D nell'angolo in basso a destra dello schermo al marcatore corrispondente su ciascuna delle quattro immagini iniziali dei video che sono stati presi dalle telecamere (File supplementare 4).
  3. Fare clic sull'icona Traccia automaticamente per avviare il processo di tracciamento automatico dei marcatori (File supplementare 5, File supplementare 6). Se il sistema non traccia con precisione un marcatore, fare clic sull'icona Digitalizzazione manuale per passare alla modalità di tracciamento manuale (File supplementare 7), fare clic sul punto caratteristico di tracciamento nel modello 3D e quindi sul marcatore di risposta nell'immagine.
  4. Dopo aver fatto clic sul marcatore, acquisteteteteteche che l'immagine passi al fotogramma successivo del video. Ora cliccate continuamente sul marcatore fino al completamento del processo di tracciamento del marcatore. Al termine, fare clic sull'icona Salva.

7. Analisi cinematica

  1. Aprire il software di analisi e quindi aprire il file video elaborato sull'interfaccia.
  2. Fare clic sull'icona Impostazione e selezionare e aggiungere parametri designati quali l'angolo della caviglia, l'angolo della punta e lo spostamento pelvico (assi X e z) all'elenco di visualizzazione nella finestra pop-up a destra (File supplementare 8). Fare clic su OK, in modo che le curve che rappresentano le modifiche dei valori nei parametri appaiano sull'interfaccia.
  3. Fare clic sull'icona Misura e selezionare Elaborazione uniforme nel relativo menu a discesa. Immettere 20 Hz nella finestra pop-up per rimuovere frequenze superiori a 20 Hz all'interno delle curve (File supplementare 9).
  4. Assicurarsi che ci siano cinque pannelli sull'interfaccia: il video a piedi del ratto, il modello 3D dinamico, curve che rappresentano le variazioni di valore nei parametri del ciclo a 10 fasi, le curve che rappresentano le variazioni medie dei valori nei parametri e gli istogrammi e i diagrammi schematici che rappresentano il rapporto tra la posizione e la fase di oscillazione (Supplementary File 10).
  5. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul pannello per le curve che rappresentano le modifiche del valore medio nei parametri e selezionare Output dati nel menu a discesa (File supplementare 11). Questo produrrà i valori medi degli angoli articolari degli arti posteriori, inclusi gli angoli della caviglia e del dito, lo spostamento pelvico e qualsiasi altro parametro desiderato nei periodi del ciclo di 10 fasi.

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Risultati

Abbiamo selezionato quattro parametri per studiare le modifiche funzionali nel tempo in un modello di lesione di schiacciamento del nervo sciatico di ratto. Questi erano il rapporto tra la traiettoria posizione-oscillazione, il centro di gravità (CoG), gli angoli della caviglia e gli angoli dei diti nella fase 'toe off'9. Ventiquattro ratti sono stati assegnati casualmente a uno dei quattro gruppi: il gruppo di controllo (C), i ratti alla prima (1w), la terza (3w) e la sesta settimana dopo l'infor...

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Discussione

In questo protocollo, un ratto stabile e continuo è la componente più vitale dell'analisi cinematica. La velocità del tapis roulant è stata impostata su 20 cm/s. Questa velocità di marcia non è affatto considerata "alta" se i ratti si muovono senza vincoli di spazio16. Tuttavia, questa velocità è troppo veloce per i ratti non addestrati a camminare stabilmente sul tapis roulant e probabilmente si tradurrà in un'andatura anomala e movimenti non uniformi. Questi eventi possono influire seriamente su...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato supportato da JSPS KAKENHI Grant Number JP19K19793, JP18H03129 e JP18K19739.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sutura in nylon 9-0Bear Medic Corporation.T06A09N20-25
Apparecchio anestetico per piccoli animaliSHINANO MFG CO., LTD.SN-487-0T
ISOFLURANO Soluzione per inalazionePfizer Japan Inc.(01)14987114133400
Analizzatore di KineKISSEI COMTEC CO., LTD.N.A.Un software di analisi
Colla liquidaKANBO PRAS CORPORATIONPT-B180
Micro pinzeBRC CO.
Registratore di movimentoKISSEI COMTEC CO.,LTD.N.A.Un software di registrazione
Emostatico chirurgico standardFine Science Tools, Inc.12501-13
Lama chirurgica No.10FEATHER Safety Razor CO., LTD100D
Emostatico chirurgicoWorld Precision Instruments503740
Apparato di motion capture tridimensionale (KinemaTracer for Animal)KISSEI COMTEC CO., LTD.N.A.Un sistema di analisi del movimento 3D composto da telecamere
Calcolatrice tridimensionale (3D)KISSEI COMTEC CO., LTD.N.A.Un software di tracciamento dei marcatori
Tapis roulantMUROMACHI KIKAI CO., LTDMK-685un tapis roulant con l'affiliato lo schocker elettrico, guaine trasparenti e un apparato di controllo della velocità
16171080

Riferimenti

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