Un sistema per tenere traccia delle dinamiche del comportamento delle preferenze sociali nei piccoli roditori

Summary

Descritto qui è un nuovo sistema sperimentale automatizzato che offre un'alternativa al test a tre camere e risolve anche diversi avvertimenti. Questo sistema fornisce più parametri comportamentali che consentono un'analisi rigorosa delle piccole dinamiche comportamentali dei roditori durante i test di preferenza sociale e di preferenza di social novella.

Abstract

Esplorare i meccanismi neurobiologici del comportamento sociale richiede test comportamentali che possono essere applicati ai modelli animali in modo imparziale e indipendente dall'osservatore. Dall'inizio del millennio, il test a tre camere è stato ampiamente utilizzato come paradigma standard per valutare la socialità (preferenza sociale) e la preferenza di novità sociale nei piccoli roditori. Tuttavia, questo test soffre di molteplici limitazioni, tra cui la sua dipendenza dalla navigazione spaziale e la negligenza delle dinamiche comportamentali. Presentato e convalidato qui è un nuovo sistema sperimentale che offre un'alternativa al test a tre camere, risolvendo anche alcuni dei suoi avvertimenti. Il sistema richiede un apparato sperimentale semplice e conveniente e un sistema di analisi open source disponibile al pubblico, che misura e analizza automaticamente più parametri comportamentali a livello individuale e di popolazione. Permette un'analisi dettagliata delle dinamiche comportamentali dei piccoli roditori durante qualsiasi test di discriminazione sociale. Dimostriamo l'efficienza del sistema nell'analisi delle dinamiche del comportamento sociale durante i test di preferenza sociale e di preferenza di social novella eseguiti da topi maschi adulti e ratti. Inoltre, convalidiamo la capacità del sistema di rivelare dinamiche modificate del comportamento sociale nei roditori a seguito di manipolazioni come il taglio baffo. Così, il sistema consente un'indagine rigorosa del comportamento sociale e delle dinamiche in piccoli modelli di roditori e supporta confronti più accurati tra ceppi, condizioni e trattamenti.

Introduction

Rivelare i meccanismi biologici alla base dei disturbi del neurosviluppo (NDD) è una delle principali sfide nel campo delle neuroscienze¹. Affrontare questa sfida richiede paradigmi comportamentali e sistemi sperimentali che caratterizzano il comportamento dei roditori in modo standard e imparziale. Uno studio influente pubblicato più di dieci anni fa da Moy e colleghi² ha presentato il test a tre camere. Da allora, questo test è stato ampiamente utilizzato per studiare il comportamento sociale nei modelli di roditori di NDD. Questo test valuta due tendenze innate dei roditori: 1) a rimanere in prossimità di uno stimolo sociale rispetto a un oggetto (società, anche definito preferenza sociale [SP]), e 2) a preferire la vicinanza di un nuovo stimolo sociale a uno familiare (preferenza di novità sociale [SNP])^3,4. Diversi studi successivi hanno suggerito metodi di analisi automatizzata del test a tre camere utilizzando metodi computerizzati^5,6.

Questo test soffre ancora di diversi avvertimenti. In primo luogo, esamina principalmente la preferenza sociale del luogo piuttosto che la motivazione del soggetto a interagire direttamente con uno stimolo sociale, anche se alcuni gruppi misurano anche il tempo di indagine olfattiva (sniffing), sia manualmente⁷ o utilizzando sistemi commerciali computerizzati^8,9,10. In secondo luogo, il test a tre camere viene utilizzato principalmente per misurare il tempo totale impiegato dal soggetto in ogni camera e trascura le dinamiche comportamentali. Infine, si basa su un solo aspetto del comportamento sociale, che è il tempo trascorso dal soggetto in ogni camera (o il tempo di sniffing, se misurato).

Qui presentiamo un nuovo e conveniente sistema sperimentale che è un'alternativa all'apparato a tre camere. Permette anche le prestazioni degli stessi test comportamentali mentre risolve gli avvertimenti di cui sopra. Il sistema comportamentale presentato misura automaticamente e direttamente il comportamento investigativo di un roditore verso due stimoli. Inoltre, analizza le dinamiche comportamentali in modo indipendente dall'osservatore. Inoltre, questo sistema misura più parametri comportamentali e li analizza sia a livello individuale che di popolazione; supporta quindi un'analisi rigorosa del comportamento sociale e delle sue dinamiche durante ogni test. Inoltre, il riposizionamento casuale delle camere negli angoli opposti dell'arena durante le varie fasi di prova neutralizza eventuali effetti della memoria spaziale o della preferenza. Questo sistema può essere utilizzato anche per altri test di discriminazione, come la discriminazione sessuale. L'apparato personalizzato è facile da produrre e il sistema di analisi è accessibile al pubblico come codice open source, consentendone così l'uso in qualsiasi laboratorio. Dimostriamo la capacità di questo sistema di misurare più parametri del comportamento sociale in ceppi di roditori con colori di pelliccia distinti durante i test di preferenza sociale e di preferenza di novità sociale. Convalidiamo anche la capacità del sistema di rivelare dinamiche modificate del comportamento sociale nei roditori che seguono manipolazioni, come il taglio dei baffi.

Software TrackRodent: sono stati scritti tre algoritmi in MATLAB (2014a-2019a) per tracciare il soggetto sperimentale e le sue interazioni con gli stimoli. Tutti gli algoritmi sono stati depositati in GitHub, trovato all'indirizzo . L'obiettivo principale di tutti e quattro gli algoritmi è quello di monitorare i contorni del corpo del soggetto per rilevare qualsiasi contatto diretto con le aree di stimoli.

Algoritmo basato sul corpo: questo algoritmo ha tre versioni che tengono traccia dei contorni di un mouse scuro non cablato su uno sfondo bianco (BlackMouseBodyBased), un mouse bianco su uno sfondo scuro (WhiteMouseBodyBased) o un ratto bianco su uno sfondo scuro (WhiteRatBodyBased ). L'interfaccia utente grafica (GUI) del software richiede che lo sperimentatore scelga un esperimento utilizzando mouse o ratti e quindi seleziona il codice corretto. Per ogni versione dell'algoritmo, ci sono due codici opzionali: uno che presenta il processo di tracciamento sullo schermo mentre esegue l'analisi e uno che non lo fa (quindi, viene eseguito più velocemente e viene definito "veloce"). Ad esempio, i nomi dei codici rilevanti per l'algoritmo BlackMouseBodyBased sono: "BlackMouseBodyBased23_7_14" e "BlackMouseBodyBased23_7_14_Fast". Tutti gli algoritmi che terminano con "veloce" non mostrano il rilevamento online e gli utenti devono salvare direttamente i dati nel file dei risultati (file .mat). Tutti gli algoritmi basati sul corpo richiedono l'impostazione di una singola soglia ("soglia bassa" nella GUI del software) per rilevare il corpo del soggetto.

Algoritmo basato sulla direzionalità della testa: il secondo algoritmo, disponibile solo per i topi neri, si basa sull'algoritmo basato sul corpo, oltre a determinare la direzionalità della testa. Questo algoritmo rileva le interazioni della testa del soggetto con le aree "stimoli", evitando così falsi positivi che possono derivare da contatti casuali del soggetto' con queste aree. Per questo algoritmo, vengono definite due soglie di rilevamento dei contorni del corpo del mouse: soglia alta, che include la coda più luminosa dei topi neri, e soglia bassa, che include il corpo senza coda. Successivamente, l'algoritmo adatta un ellissoide ai limiti rilevati utilizzando la soglia inferiore e definisce la posizione della testa e della coda del mouse (senza distinzione tra i due). La discriminazione finale tra la coda e la testa si basa sui confini definiti dalla soglia più alta.

Algoritmo animale cablato: il terzo algoritmo mira a ridurre al minimo gli artefatti derivanti da cavi (ad esempio, cavi elettrici o fibre ottiche) collegati all'animale, consentendo l'analisi del comportamento dell'animale mentre è collegato a un cavo. Questo algoritmo ha codici solo per topi neri e ratti bianchi. Il codice per i ratti richiede che lo sperimentatore definisca le soglie basse e alte, mentre il codice del mouse richiede solo una soglia bassa.

Protocol

Tutti i metodi descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università di Haifa.

1. Configurazione sperimentale

1. Arena
   1. Costruire l'arena sperimentale per i topi (Figura 1A,D) posizionando una scatola di plexiglass bianca o nera (a seconda del colore dell'animale) in plexiglass (37 cm x 22 cm x 35 cm) al centro di una camera acustica (60 cm x 65 cm x 80 cm, realizzata in legno spesso 2 cm rivestito all'interno con schiuma spessa 2 cm). Per la luce, rimuovere una striscia (2 cm di larghezza, 10 cm sotto il soffitto della camera) della schiuma intorno alla camera acustica (oltre alla porta), e collegare una striscia LED con lampadine rosse o bianche. Assicurati che la luce sia il più uniforme possibile intorno all'arena per evitare riflessi.
   2. Costruire l'arena per i ratti in modo simile a quello descritto sopra per i topi, con dimensioni diverse che si adattano in modo appropriato alle dimensioni dei ratti Sprague-Dawley (SD) (Figura 1G). Posizionare una scatola in plexiglass nera (50 cm x 50 cm x 40 cm) al centro di una camera acustica (90 cm x 60 cm x 85 cm, realizzata in legno spesso 2 cm rivestito all'interno con schiuma spessa 2 cm).
2. Camere
   1. Per i topi, creare due camere triangolari nere o bianche (a seconda del colore della pelliccia) triangolari (12 cm isosceli, altezza 35 cm, con i pavimenti chiusi) da plexiglass spessi 6 mm. Individuarli in due angoli opposti selezionati casualmente dell'arena (Figura 1B,E). Attaccare una rete metallica (18 mm x 6 cm; 1 cm x 1 cm di fori) nella parte inferiore di ogni camera utilizzando colla epossidica per consentire interazioni dirette con lo stimolo attraverso la mesh (Figura 1C,F). Contrassegnare ogni camera in un modo che consente la discriminazione da parte degli altri in un video senza dare indizi ai soggetti (vedi Figura 1B,E per esempi).
      NOT: Ogni camera alla fine conterrà uno stimolo sociale (mouse) o un oggetto (giocattolo di plastica, 5 cm x 5 cm x 5 cm, con una forma e un colore distinti; Figura 1C,I insets). Lasciare evaporare l'odore della colla epossidica per almeno una settimana prima dell'uso.
   2. Per i ratti, creare due camere triangolari nere (20,5 cm isosceli, 40 cm di altezza, in plexiglass spessa 6 mm, con i pavimenti chiusi) e posizionarli in due angoli opposti casualmente selezionati dell'arena (Figura 1H), ciascuno con una rete metallica (25x cm 7 cm; 2,5 cm x 1 cm) fori che coprono la sua parte inferiore (Figura 1I).
3. Posizionare una fotocamera monocromatica di alta qualità, dotata di un obiettivo grandangolare, nella parte superiore della camera acustica e collegarla a un computer per consentire una visione e la registrazione chiare del comportamento del soggetto utilizzando un software commerciale (vedere Tabella dei materiali per suggerimenti).

2. Paradigma Comportamentale

NOT: I passaggi 2.1-2.7 descrivono il paradigma comportamentale per i topi. Vedere la sezione 2.8 per istruzioni specifiche relative ai ratti.

1. Assicurarsi che le gabbie di tutti gli animali (soggetti: topi maschi di 2-4 mesi; stimoli: topi giovani di 21-30 giorni) rimangano nella stanza sperimentale per almeno 1 h prima di iniziare l'esperimento comportamentale.
2. Dopo il periodo di acclimatazione, inserire due camere vuote nell'arena in modo casuale in due angoli opposti. Posizionare il soggetto al centro dell'arena per 15 min di assuefazione. Durante questo periodo, mettere i due stimoli sociali, ciascuno in una camera diversa situata fuori dall'arena per l'assuefazione. Posizionare un oggetto (un giocattolo di plastica, 5 cm x 5 cm x 5 cm, con una forma e un colore distinti) in un'altra camera.
3. Per eseguire il test delle preferenze sociali (SP), avviare la registrazione video e mantenere la registrazione fino alla fine del test.
4. Rimuovere le due camere vuote e inserire immediatamente l'oggetto e uno degli stimoli sociali, ciascuno in una camera distinta. Individuare queste camere in modo casuale negli angoli opposti dell'arena che erano vuote durante l'assuefazione. Lasciare che il soggetto interagisca con gli stimoli per i 5 min del test SP. Alla fine del test, interrompere la registrazione.
5. Dopo il test SP, rimuovere le camere contenenti stimoli dall'arena e lasciare il soggetto nell'arena vuota per 15 min. Pulire le camere dall'esterno con salviette di etanolo del 10%.
6. Per eseguire il test di preferenza di novità sociale (SNP), avviare la registrazione video e inserire due camere nell'arena: una contenente lo stesso stimolo sociale utilizzato per il test SP (stimolo familiare), e l'altro contenente il nuovo stimolo sociale. Posizionare queste camere in modo casuale in due angoli opposti dell'arena, assicurandosi che questi luoghi non siano stati utilizzati per il test SP. Lasciare che il soggetto interagisca con gli stimoli per i 5 min del test SNP.
7. Alla fine del test SNP, interrompere la registrazione video, rimuovere il soggetto e le camere dall'arena e riporre il soggetto nella sua gabbia di casa. Lasciare gli stimoli nelle camere per l'esperimento successivo (con un altro soggetto) o riportarli alle loro gabbie di casa. Pulire l'arena e le camere con acqua corrente seguite dal 10% di etanolo e lasciarle asciugare.
8. Paradigma comportamentale per i ratti
   1. Per i ratti, ripetere il paradigma comportamentale descritto nei passaggi 2.1-2.7, con due modifiche: 1) gestire i soggetti ratti e abituare gli stimoli sociali alle camere per 2 giorni (10 min ogni giorno) prima dell'esperimento; e 2) estendere il test SP per 15 min per dare ai ratti un periodo più lungo di esposizione agli stimoli sociali. Successivamente, limitare l'analisi del test SP ai 5 min iniziali.
      NOT: Sono necessarie almeno un'arena e cinque camere per eseguire una sola sessione.

3. Utilizzo della GUI TrackRodent per l'analisi comportamentale

NOT: Vedere il pannello superiore di Figura 2A per la GUI TrackRodent.

1. Aprire MATLAB (testato con 2014a-2019a) e scegliere la cartella TrackRodent.
2. Aggiungere tutte le sottocartelle al percorso di lavoro facendo clic con il pulsante destro del mouse su ogni cartella e selezionando Aggiungi al percorso . Cartelle e sottocartelle selezionate.
3. Digitare TrackRodent nella finestra di comando e premere INVIO.
4. Carica un singolo file o più file video (formato AVI o MP4) selezionando Carica file di sessione (AVI).
5. Un controllo filmato, che consente l'ispezione del video clip fotogramma per fotogramma, verrà immediatamente aperto per il primo file dell'elenco (Figura 2A). Utilizzatelo per esaminare il video clip e definire il primo e l'ultimo fotogramma del segmento da analizzare. Registrare i numeri di questi fotogrammi, che saranno necessari in seguito. Al termine, chiudere la finestra.
6. Per controllare altri file video, aprire la finestra di ispezione video in qualsiasi momento premendo Controlla filmato e selezionando un file video specifico.
7. Selezionare le specie testate (topo o ratto; il topo è l'impostazione predefinita).
8. Escludere tutte le aree che possono interrompere il tracciamento, in base ai colori del soggetto e dell'arena (nero o bianco).
   1. Per escludere una determinata area, premere Escludi areae dopo che il cursore assume la forma a croce, contrassegnare tutti gli angoli dell'area per l'esclusione. Al termine, fare clic con il pulsante destro del mouse, quindi fare doppio clic con il pulsante sinistro del mouse e scegliere il centro dell'area contrassegnata. L'area esclusa diventerà una tonalità di rosso sullo schermo. Ripetere questa procedura per escludere tutte le aree necessarie.
9. Per rimuovere un'area dall'esclusione, premere Rimuovi area esclusa, quindi (utilizzando il cursore incrociato) fare clic sull'area da rimuovere dall'esclusione.
10. Per definire ogni camera come un'area di stimolo, per il rilevamento automatico della sua indagine da parte del soggetto, scegliere la forma dell'area di stimolo come poligono o ellittica selezionando la casella appropriata, quindi premendo Stimolo X (dove "X" rappresenta 1, 2 o 3). Contrassegnare le aree di stimolo in modo simile alle aree escluse, che diventeranno di colore giallo. Per modificare la posizione di un'area specifica, premere nuovamente Stimulus X e contrassegnare la nuova posizione dell'area (aggiorna automaticamente la posizione).
    NOT: Scegliere il diverso numero di stimoli in modo coerente per tutti i file (ad esempio oggetto come stimolo 1 per tutti i file di test SP).
11. Per monitorare la presenza del soggetto in uno specifico vano virtuale all'interno dell'arena, scegliere la forma dell'area di "compartimento" (poligono o ellittica), quindi premere Compartment X (dove "X" rappresenta 1, 2, 3, 4 o 5). Contrassegnare le aree di "compartimento" in modo simile alle aree escluse o stimoli, che diventeranno di colore blu. Per modificare la posizione di un'area "compartimentale" specifica, premere nuovamente Compartment X e contrassegnare la nuova posizione dell'area (aggiorna automaticamente la posizione).
12. Scegliere l'algoritmo desiderato (BlackMouseBodyBased è stato utilizzato per il video) dall'elenco (vedere gli algoritmi disponibili nella Figura 2B).
13. Scrivere i numeri dei fotogrammi iniziale e finale per l'analisi nelle caselle di modifica corrispondenti della GUI.
14. Scegliere una soglia per il rilevamento del corpo del soggetto.
    NOT: La maggior parte degli algoritmi utilizza solo la soglia "Basso", mentre gli algoritmi basati sulla direzionalità della testa utilizzano anche la soglia "Alta". Per la soglia "Bassa", scegliere un livello che includa il corpo del topo/ratto senza la coda (per quanto possibile), mentre la soglia "Alta" deve includere anche la coda. Nel caso di utilizzo di algoritmi basati sulla direzionalità della testa, il software determinerà la posizione della testa come opposta alla posizione della coda.
    NOT: Il software in seguito ignora i piccoli oggetti rilevati utilizzando la soglia scelta.
15. Per valutare il rilevamento automatico dei bordi del soggetto per una determinata soglia, inserire un valore nel campo soglia pertinente e premere INVIO sulla tastiera.
16. Quando si scelgono più file, passare al file successivo (utilizzando il pulsante Avanti nella parte superiore) e selezionare le definizioni appropriate per ogni file. Al termine, verificare i parametri e le posizioni delle aree per tutti i file spostandoli tra di essi, utilizzando i pulsanti Precedente e Successivo nella parte superiore della GUI.
    NOT: Le definizioni di tutte le aree e i parametri sono specifiche di un determinato file.
17. Per avviare l'analisi comportamentale di tutti i file selezionati, passare al primo file e premere Avvia.
18. Al termine dell'analisi, un file dei risultati (file .mat) viene salvato per ogni filmato nella stessa directory dei file di filmato.
    NOT: Se viene utilizzata la versione lenta (non veloce) dell'algoritmo, salverà anche una versione del filmato con una croce bianca del centro di massa corporea, che cambia colore ogni fotogramma che viene rilevato come investigatore, a meno che il pulsante Salva filmato analizzato della GUI non sia deselezionato. Questa versione del filmato (salvata nella stessa directory, con lo stesso nome del filmato originale, con il suffisso 'filmato analizzato') può essere utilizzata offline per valutare la qualità del rilevamento automatico eseguito dal sistema.

4. Utilizzo della GUI TrackRodent per la presentazione dei risultati

NOT: Vedere il pannello inferiore di Figura 2A per la presentazione dei risultati.

1. Per esaminare i risultati di ogni file filmato, premere Carica file dei risultati e scegliere i file .mat generati dall'analisi comportamentale.
2. Spostarsi tra i pulsanti di attivazione/disattivazione per esaminare su schermo una delle seguenti analisi: Traccia della posizione del mouse(Figura 2A); Occupazione dei compartimenti lungo la sessione (se sono stati definiti i "compartimenti", non mostrati); Esplorazione degli stimoli lungo la sessione (Figura 2C); Tempo totale in compartimenti (se sono stati definiti "compartimenti", non indicato); e Tempo totale di esplorazione degli stimoli (Figura 2D).
   NOT: Le aree "stimulus" sono aree in cui il software valuta l'interazione con il soggetto, mentre le aree "Compartment" sono aree in cui il software tiene traccia della presenza del soggetto. L'interruzione dell'analisi mediante il pulsante Interrompi analisi salverà automaticamente i risultati generati fino all'ultimo frame analizzato. Per la maggior parte dei computer, dovrebbe essere possibile caricare e analizzare fino a 20 film contemporaneamente (a seconda delle prestazioni del computer).

5. Utilizzo della GUI TrackRodentPopulationSummary per l'analisi della popolazione (Figura 2E)

1. Aprire MATLAB (testato con 2014a-2019a) e scegliere la cartella TrackRodent.
2. Digitare TrackRodentPopulationSummary nella finestra di comando e premere INVIO.
3. Caricare più file dei risultati TrackRodent (formato .mat) premendo Scegli file dei risultati.
4. Immettere i numeri di Ultimo fotogramma per l'analisi, Nome test, Nome stimulo 1e Nome stimolante 2.
5. Scegliere le analisi desiderate dall'elenco delle analisi facoltative selezionando tutte le caselle appropriate.
6. Scegliere Esporta i risultati in un foglio di lavoro selezionando la casella appropriata per estrarre tutti i risultati delle analisi selezionate come un singolo file di foglio di calcolo.
7. Premere Start e attendere il completamento dell'analisi.
   NOT: Questo conclude l'analisi. Il software può essere utilizzato per analizzare i risultati di tutti i file di film come desiderato, dato che sono stati tutti analizzati in modo comportamentale utilizzando il software TrackRodent. L'analisi eseguita dal software presuppone la registrazione video ad una frequenza fotogrammi di 30 Hz. Nel caso in cui sia stata utilizzata una frequenza fotogrammi diversa, moltiplicare il tempo per 30 e dividere per la frequenza fotogrammi utilizzata per la registrazione per convertirlo nel valore corretto.

Results

Utilizzo del sistema per il test di preferenza sociale nei topi C57BL/6J
La figura 1 mostra tre versioni dell'impostazione sperimentale. La prima versione (Figura 1A-C) è progettata per topi con colori di pelliccia scura, come i topi C57BL/6J. Il secondo (Figura 1D-F) è previsto per i topi con colori brillanti della pelliccia, come i topi BALB/c o...

Discussion

Il sistema sperimentale qui descritto, che è stato progettato come alternativa all'apparato a tre camere^2,5, consente di eseguire gli stessi test risolvendo alcuni dei suoi limiti. L'uso di camere triangolari, che si trovano in due angoli opposti dell'arena rettangolare, limita l'area di interazione soggetto-stimolo a un piano ben definito, consentendo così un'analisi automatizzata precisa del comportamento dell'indagine. Un vantaggio è l'uso del software di anal...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flea3 1.3 MP Mono USB3 Vision	FLIR (precedentemente PointGrey)	FL3-U3-13Y3M-C	Fotocamera monocromatica
FlyCap 2.0	FLIR (precedentemente PointGrey)	FlyCapture 2.13.3.61X64	Software di registrazione video
Home 5 minuti Colla epossidica	Devocon	20845	Per incollare la rete metallica alle camere degli stimoli in plexiglas
Matlab 2014-2019	MathWorks	R2014a - R2019a	Ambiente di programmazione
Schede in plexiglas (6 mm di spessoreNero o bianco)	Melina (1990) LTD, Israele	NaN	Per la costruzione di arene e camere di stimolo
Strisce led rosse (60 led per metro) collegate a un alimentatore a 12 V	2012topdeal eBay fornitore	NaN	Per l'illuminazione della camera acustica