Generazione di organoidi testicolari porcini con Architettura Specifica Testis utilizzando Microwell Culture

Negli ultimi anni, c'è stata una rinascita di interesse per gli organoidi tridimensionali (3D). Diversi organi come intestino¹, stomaco², pancreas^3,4, fegato⁵, e cervello⁶ sono stati derivati con successo in sistemi organoidi 3D. Questi organoidi hanno somiglianze architettoniche e funzionali con gli organi in vivo e sono più biologicamente rilevanti per lo studio del microambiente tissutale rispetto ai sistemi di coltura monostrato⁷. Di conseguenza, gli organoidi testicolari hanno iniziato a raccogliere interesse anche^8,9,10,11,12. La maggior parte dei metodi riportati finora sono complessi, non-alto throughput¹⁰ e richiedono l'aggiunta di proteine ECM^8,10. Questa complessità porta anche a problemi di riproducibilità. È necessario un metodo semplice e riproducibile che consenta la generazione di organoidi testicolari con associazioni cellulari che sono come testis in vivo.

Recentemente abbiamo segnalato un sistema per soddisfare questi requisiti¹². Utilizzando il maiale come modello, abbiamo impiegato un approccio di aggregazione forzata centrifuga nel sistema del microwell. Nel sistema di microwell, ogni pozzo contiene un gran numero di micropozzi più piccoli identici¹³. Questo permette la generazione di numerosi sferoidi di dimensioni uniformi. Il sistema di microwell ha permesso la generazione di un gran numero di organoidi uniformi con un'architettura specifica per i testicoli. Il sistema è semplice e non richiede l'aggiunta di proteine ECM.

NOTA: I testicoli dei suinetti di 1 settimana sono stati ottenuti da un allevamento di suini commerciali come sottoprodotto della castrazione di suini commerciali. L'approvvigionamento di testicoli è stato approvato dall'Animal Care Committee dell'Università di Calgary.

1. Preparazione di soluzioni enzimatiche per la digestione tissutale

NOTA: sono necessarie tre diverse soluzioni ezimatiche, che includono due diverse soluzioni collagenase IV (soluzione A, B) e una soluzione deoxyribonuclease I (DNase I).

1. Per preparare la soluzione A, sciogliere 20 mg di collagenase IV S (Tabella dei materiali) e 40 mg di collagene IV W ( Tabella deimateriali) in 25 mL di alto glucosio Melo di Aquila modificato (DMEM). Quindi filtrare sterilizzare con un filtro 0,22 m. Aggiungere 0,4 mL di siero bovino fetale (FBS) alla soluzione A per inibire l'attività della trypsin.
2. Per preparare la soluzione B, sciogliere 80 mg di collagenae IV W (Tabella dei materiali) in 40 mL di DMEM. Quindi filtrare sterilizzare con un filtro 0,22 m.
3. Per preparare la soluzione DNase I (7 mg/mL), sciogliere 70 mg di DNase I in 10 mL di DMEM. Quindi filtrare sterilizzare con un filtro 0,22 m.
   NOTA: La concentrazione di enzimi per le soluzioni di collagenasi IV qui descritte varia dalle concentrazioni (2 mg/mL) indicate nell'articolo originale¹⁴. Il protocollo attuale produce cellule con una redditività leggermente superiore. Tuttavia, le cellule isolate da entrambi i protocolli producono organoidi con un'architettura tissutale identica.

2. Testè digestione enzimatica dei tessuti

1. Raccogliere i testicoli in un becher sterile e lavare con salina tamponata da fosfato (PBS) contenente l'1% di penicillina/streptomicina (P/S). Dopo il lavaggio, trasferire i testicoli in un piatto di coltura tissutale di 100 mm con PBS contenente 1% P/S e rimuovere il tunicalis e l'epididymis utilizzando forbici autoclaved e pinze. Trasferire i testicoli isolati in un nuovo piatto da 100 mm e lavare accuratamente con PBS contenente 1% P/S.
2. Per mantenere la sterilità, utilizzare un altro set di forbici sterili e pinze per sbucciare il parenchyma testicolare dalla tunica albuginea. Tagliare i testicoli lungo l'asse longitudinale direttamente sotto il tunica. Quindi sbucciare i testicoli dal tunica con due pinze e metterle in un nuovo piatto da 100 mm contenente 1 mL DMEM con 1% P/S.
3. Tritate i testicoli sbucciati con forbici sterili in pezzi di tessuto da 1-2 mm. Dopo il taglio, utilizzare pinze sterili per rimuovere frammenti bianchi di tessuto connettivo.
4. Trasferire i pezzi di tessuto macinato nella soluzione A e rifornirla fino a 50 mL con DMEM per ottenere una concentrazione di 0,4 mg/mL per la collagenae IV S (Tabella dei materiali) e una concentrazione di 0,8 mg/mL per collagenase IV W ( Tabella deimateriali). Mettere la soluzione A contenente i pezzi di tessuto in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 30 min, invertire delicatamente i tubi ogni 5 min e controllare visivamente il rilascio del DNA.
   1. Aggiungete 500 l di DNase I se si osserva il DNA galleggiante libero. Dopo 30 min, centrifugare il tubo a 90 x g con freni a 25 gradi centigradi per 1,5 min e scartare il supernatante.
      NOTA: il DNA apparirebbe come sostanza torbida. Quando i tubi vengono scossi, i pezzi di tessuto si depositano mentre il DNA rimane a galla.
5. Aggiungere la soluzione B al tubo e ricaricare fino a 50 mL con DMEM per ottenere una concentrazione di 1,2 mg/mL di collagenae IV W (Tabella dei materiali). Mettete il tubo a 37 gradi centigradi per 30 min e invertete delicatamente il tubo ogni 5 min.
6. Dopo 30 min, centrifugare il tubo a 90 x g con freni a 25 gradi centigradi per 1,5 min. Dopo di che scartare il supernatante e lavare una volta con PBS con 1% P/S.
   NOTA: i supernatanti scartati delle soluzioni A e B conterranno principalmente cellule interstiziali.
7. Ricaricare il tubo con PBS fino a 50 mL. Raccogliere con cura i tubuli dall'alto e metterli in un nuovo tubo da 50 mL.
   NOTA: I grandi frammenti di tessuto non digerito si depositano rapidamente nella parte inferiore, mentre i tubuli seminiferi digeriti rimarranno in sospensione. Non devono essere raccolti grandi frammenti di tessuto. Questa procedura può essere ripetuta più volte fino a quando la soluzione nel tubo originale è quasi chiara e rimangono solo frammenti di tessuto non digerito, che possono essere smaltiti.
8. Centrifugare i tubuli a 90 x g con freni a 25 gradi centigradi per 1,5 min e scartare il supernatante. Aggiungere nuovamente pbS e centrifugare freschi. Ripetere questo passaggio di lavaggio due volte.
9. Dopo l'ultimo lavaggio PBS, rimuovere il supernatante e risospendere i tubuli seminiferi in 5 mL di PBS. Quindi aggiungere 15 mL di 0.25% trypsin-etilelenediaminetraacetic acid (EDTA) ai tubuli. Collocare il tubo a 37 gradi centigradi e invertire delicatamente ogni 2 min. Se si osserva molto DNA galleggiante, aggiungere 500 L di DNase I con 5 mL di DMEM.
10. Valutare la digestione enzimatica dei tubuli in singole cellule al microscopio (prima dopo 5 min, poi ogni 2 min). Se è possibile rilevare per lo più cellule singole, interrompere la reazione con 5 mL di FBS e filtrare attraverso una rete da 70 m e quindi attraverso una rete da 40 m.
    NOTA: Occorre prestare attenzione affinché i tappi sui tubi da 50 mL utilizzati per le digestione (Soluzione A, B e 0,25% trypsin-EDTA) siano serrati correttamente. Se la contaminazione nel bagno d'acqua è una preoccupazione, pellicola di paraffina può essere avvolto intorno al tappo per garantire la sterilità.
11. Centrifugare le singole celle a 500 x g con freni a 25 s per 5 min, rimettere in rinversione nel mezzo di arricchimento (Dulbecco Modified Eagle Medium F/12 (DMEM/F12) contenente il 5% Di FBS e 1% P/S) e contare il numero di cellule vitali. Questa è la popolazione cellulare iniziale. Fissare 100 x 10³ cellule ed eseguire l'immunocitochimica per il marcatore delle cellule germinali UCHL1 (Ubiquitina C-Terminal Hydrolase L1) come descritto¹² e determinare la percentuale di cellule germinali in questa popolazione cellulare iniziale.
    NOTA: Il marcatore a cellule germinali Promielocitica di tono di zinco (PL-F)¹⁵ potrebbe anche essere utilizzato come alternativa adatta per UCHL1. Nella popolazione cellulare iniziale, la resa cellulare prevista è di circa 700-800 x 10⁹/ g di tessuto. La percentuale di cellule germinali in questa popolazione cellulare dovrebbe essere del 4-5%.
12. Collocare circa 20 x 10⁶ di questa popolazione cellulare iniziale in due parabole Petri da 100 mm ultra basse (10 x 10⁶ celle sospese in 10 mL di DMEM/F12 contenenti 1% di P/S in ogni piatto) per 2 giorni in un'incubatrice di coltura dei tessuti (37 , 5% CO₂, 21% ossigeno). Eseguire l'arricchimento delle cellule germinali con le cellule rimanenti.
    NOTA: Per garantire una vitalità ottimale e la qualità cellulare, mentre avviene l'arricchimento delle cellule germinali e la successiva quantificazione, la popolazione cellulare iniziale viene collocata in coltura in piatti di coltura dei tessuti a bassissima attaccamento per 2 giorni.

3. Arricchimento delle cellule germinali

NOTA: La procedura descritta sopra produce principalmente cellule Sertoli e cellule germinali. Diverse proprietà di adesione consentono la separazione delle cellule di Sertoli e delle cellule germinali attraverso la placcatura differenziale.

1. Seme 20-25 x 10⁶ cellule della popolazione cellulare iniziale per 100 mm piatto di coltura dei tessuti in un volume totale di 8 mL di mezzo di arricchimento (DMEM/F12 con 5% FBS e 1% P/S) per placcatura differenziale. Posizionare le cellule in un'incubatrice (37 gradi centigradi, 5% CO₂, 21% O₂) e dopo 1,5 h, assicurarsi che la maggior parte delle cellule Sertoli si attacchi alla piastra.
2. Raccogliere e combinare il supernatante (contenente principalmente cellule germinali) di 2 piastre a una nuova piastra da 100 mm e rimetterla nell'incubatrice. Dopo 1 h, ancora una volta combinare il supernatante di 2 piastre ad una nuova piastra da 100 mm. Rimettere le piastre nell'incubatrice per una notte.
   NOTA: i supernatanti combinati conterranno principalmente cellule germinali. Le cellule aderte che vengono scartate insieme alle piastre sono principalmente cellule somatiche testicolari come Sertoli e le cellule mioidi peritolare.
3. Raccogliere le cellule germinali arricchite in due frazioni come segue.
   NOTA: Le cellule germinali arricchite aderiscono in modo diverso, frazione non aderente e frazione leggermente aderita. Entrambe queste frazioni insieme formano la popolazione di cellule germinali arricchite
   1. Frazione non aderente: raccogliere il super-natante.
   2. Frazione leggermente aderente: lavare delicatamente le piastre con PBS, trattare con 2 mL di 1:20 di diluizione dello 0,25% trypsin-EDTA per 5 minuti a temperatura ambiente, fermare la reazione con 2 mL di mezzo di arricchimento e raccogliere nello stesso tubo come frazione non aderente.
      NOTA: 0.25% Trypsin-EDTA deve essere diluito con PBS per produrre una soluzione 1:20 trypsin.
4. Contare il numero totale di cellule utilizzando un contatore cellulare, fissare 100 x 10³ cellule ed eseguire l'immunocitochimica per marcatore di cellule germinali UCHL1 come descritto¹² e determinare la percentuale di cellule germinali in questa popolazione cellulare arricchita.
   NOTA: La percentuale di cellule germinali in questa popolazione cellulare deve essere almeno 60-70%. Poiché l'immunocitochimica per la quantificazione richiederebbe 1 giorno, le cellule arricchite devono essere collocate in un attacco ultra basso 100 mm piatto Petri con DMEM/F12 integrato con 1% P/S per la durata per garantire la qualità cellulare ottimale e la vitalità.

4. Preparazione delle cellule per la semina

1. Per raccogliere la preparazione cellulare di partenza, raccogliere il supernatante in un tubo da 50 mL dai piatti allegato ultra basso 100 mm. Lavare le piastre vigorosamente con PBS per raccogliere le cellule aderenti. Non è necessaria alcuna digestione ezimatica.
   NOTA: Alcune delle cellule testicolari, principalmente le cellule Sertoli, possono aderire leggermente alle piastre di attacco ultra basse.
2. Combinare la preparazione cellulare iniziale e le cellule germinali arricchite per ottenere una preparazione delle cellule di lavoro contenente il 25% di cellule germinali. Centrifuga a 500 x g con freni a 25 s per 5 min, scartare il supernatante e risospendere nuovamente le cellule in mezzo di formazione organoide (DMEM/F12 integrato con insulina 10 g/mL, transferrin 5,5 g/mL, selenio 6,7 ng/mL, 20 ng/mL del fattore di crescita epiderle , 1% P/S). Regolare la densità della cella a 2,4 x 10⁶ per mL.
   NOTA: Ogni pozzo nelle piastre di microwell utilizzato¹³ in questo protocollo conteneva 1.200 micropozzi.
3. Utilizzare la formula seguente per calcolare il numero di celle per così come descritto di seguito.
   Numero di cellule per pozzo: numero di micropozzi x numero di cellule da raggruppare per ogni organoide.
4. Per generare organoidi da 1.000 cellule ciascuna, siede ciascuna con (1.200 x 1.000 cellule ciascuna) 1,2 x 10⁶ cellule. Regolare la densità delle celle nella sospensione cellulare in modo che le cellule vengano semiate in un volume di 0,5 mL di mezzo. Per gli organoidi formati da 1.000 cellule ciascuna, utilizzare una densità di 2,4 x 10⁶ cellule per mL (1,2 x 10⁶ cellule in 0,5 mL).

5. Preparazione di micropozzi per la ricezione delle cellule

NOTA: Per garantire che le cellule non aderiscano alla superficie del microwell, trattare con una soluzione di risciacquo surfactant disponibile per l'acquisto da parte del produttore.

1. Aggiungere 0,5 mL di soluzione di risciacquo ad ogni pozzo. Assicurarsi che nessuna d'aria sia intrappolata nel pozzo. Per rimuovere le bolle d'aria, se presenti, centrificare la piastra a 2.000 x g con freni a 25 gradi centigradi per 2 min.
2. Osservare la piastra al microscopio invertito a basso ingrandimento, per verificare che le bolle siano state rimosse dai micropozzi. Se si osservano bolle intrappolate, centrificare di nuovo a 2.000 x g con freni a 25 gradi centigradi per 2 minuti per rimuovere eventuali bolle rimanenti.
3. Coprire la piastra con il coperchio e incubare per 30 min a temperatura ambiente. Al termine del trattamento, rimuovere la soluzione di risciacquo e lavare immediatamente la piastra con acqua sterile o PBS. Assicurarsi che la piastra non si asciughi dopo il trattamento con la soluzione di risciacquo.

6. Generazione di organoidi testicolici

1. Aggiungere 0,5 mL di mezzo di formazione organoide (senza cellule) ad ogni pozzo e centrifugare a 2.000 x g con freni a 25 s per 2 min per rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate. Osservare il pozzo al microscopio invertito a basso ingrandimento per verificare che le bolle d'aria siano state rimosse. Se si osservano bolle intrappolate, centrificare di nuovo a 2.000 x g con freni a 25 gradi centigradi per 2 minuti per rimuovere eventuali bolle rimanenti.
2. Aggiungere 0,5 mL della sospensione della cella di lavoro e mescolare delicatamente pipetting su e giù. Centrifuga a 500 x g con freni a 25 gradi centigradi per 5 min. Utilizzare un microscopio invertito per verificare che le cellule si siano raggruppate all'interno dei micropozzi.
3. Trasferire la piastra in un incubatore di coltura cellulare e coltura per 5 giorni. Cambiare metà del mezzo ogni altro giorno.
   1. Per cambiare il mezzo senza perdere gli organoidi, toccare la punta della pipetta alla parete del pozzo e abbassare dolcemente per toccare il menisco e disegnare lentamente il mezzo. Assicurati di seguire il menisco mentre scende. Per aggiungere il mezzo fresco, toccare la punta della pipetta alla parete del pozzo sullo stesso lato del prelievo medio e aggiungere il mezzo fresco delicatamente contro la parete del pozzo, permettendogli di scorrere lentamente lungo la parete.
4. Per recuperare gli organoidi, pipettare delicatamente il mezzo su e giù con un'ampia pipetta bocca. Questo permetterebbe agli organoidi di uscire dai micropozzi.
5. Raccogliere gli organoidi, lavare con PBS, fissare ed eseguire l'immunocitochimica per marcatore di cellule germinali (UCH-L1), sertoli marcatore di cellule (GATA Binding Protein 4-GATA4), marcatore di cellule mioide peritubare (z-Smooth Muscle Actin-SMA) e marcatore di cellule Leydig (Cytochrome P450-CYP450) come descritto¹² e visualizzare al microscopio confocale.

Celle isolate da testicoli porcini di 1 settimana che sono stati coltivati nei micropozzi auto-organizzati in sferoidi (Figura 1A, Figura 2), con esterno delineato e distinto (epitelio seminiferous) e compartimenti interni ( interstizio) (Figura 1B, Figura 2). I due compartimenti sono stati separati da una membranaseminterrato IV collagene IV ve. Le cellule germinali UCH-L1-ve e le cellule GATA4-ve Sertoli erano nel compartimento esterno sullamembranadel seminterrato ( Figura 1 B, Figura 2). Le cellule mioidi peritubulari s-SMA sono state localizzate lungo l'interno della membrana del seminterrato, mentre le cellule Cytochrome P450-ve Leydig erano al centro dell'interstizio (Figura 1B, Figura 2). Questa struttura (Figura 2) è simile alle condizioni in situ (Figura 1C), in cui le celle di Leydig, le celle mioidi peritubarie si trovano nel compartimento interstiziale; e le cellule germinali, le cellule di Sertoli si trovano all'epitelio seminiferoso.

Figura 1: Gli organoidi testicoli di Microwell presentano un'architettura tissutale specifica per i testicoli con una topografia invertita. (A) Cellule testicolari di porcina a 0, 3 e 5 giorni di coltura microwell. (B) Immagini immunofluorescenze di organoidi testicolari che identificano tipi di cellule specifiche: cellule di Sertoli (GATA4), membrana seminterrato (Collagen IV); cellule germinali (UCH-L1); cellule mioidi peritubulari (z-SMA); Cellule di Leydig (CYP450). (C) Aspetto istologico (H&E) e rappresentazione schematica di 1 settimana-vecchio testis suino. Tipi di cella specifici sono indicati con le frecce corrispondenti. Barre della scala: 50 m. Questa cifra è stata modificata da Sakib etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Rappresentazione schematica della formazione organoide. Le cellule a testicolo singolo isolato vengono semiggiate e coltivate nei micropozzi per 5 giorni per produrre organoidi testicolari. Questa cifra è stata modificata da Sakib etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dr. Ungrin ha un interesse finanziario nella tecnologia AggreWell come inventore.