Articolo metodologico

In vitro ricostituzione dei modelli di contatto cellulare spaziale con Caenorhabditis isolato elegans Embrione Blastomeres e Perline in polistino adesivo

DOI:

10.3791/60422

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26 novembre 2019

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1Department of Zoology, The University of British Columbia, 2Life Sciences Institute, The University of British Columbia

In questo articolo

Sommario

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Le complessità tissutali dei sistemi multicellulari confondere l'identificazione della relazione causale tra segnali extracellulari e comportamenti cellulari individuali. Qui, presentiamo un metodo per studiare il legame diretto tra segnali dipendenti dal contatto e assi di divisione utilizzando i blastomeri embrionali C. elegans e le perle adesive in polistirolo.

Abstract

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Nei sistemi multicellulari, le singole cellule sono circondate dai vari segnali fisici e chimici provenienti dalle cellule vicine e dall'ambiente. Questa complessità tissutale confonde l'identificazione del legame causale tra segnali estrinseci e dinamiche cellulari. Un sistema multicellulare sinteticamente ricostituito supera questo problema consentendo ai ricercatori di testare uno spunto specifico eliminandone altri. Qui, presentiamo un metodo per ricostituire i modelli di contatto cellulare con caenorhabditis elegans blastomere isolati e perline di polistirolo adesivo. Le procedure prevedono la rimozione del guscio d'uovo, l'isolamento del blastomere interrompendo l'adesione cellulare-cellula, la preparazione di perline di polistirolo adesivo e la ricostituzione del contatto cell-cell o cell-perad. Infine, presentiamo l'applicazione di questo metodo per studiare l'orientamento degli assi della divisione cellulare che contribuisce alla regolazione del patterning cellulare spaziale e delle specifiche del destino cellulare nello sviluppo degli embrioni. Questo metodo in vitro robusto, riproducibile e versatile consente di studiare le relazioni dirette tra i modelli di contatto delle cellule spaziali e le risposte cellulari.

Introduzione

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Durante lo sviluppo multicellulare, i comportamenti cellulari (ad esempio, l'asse di divisione) delle singole cellule sono specificati da vari segnali chimici e fisici. Comprendere come le singole cellule interpretano queste informazioni e come regolano l'assemblaggio multicellulare come proprietà emergente è uno degli obiettivi finali degli studi di morfogenesi. L'organismo modello C. elegans ha contribuito in modo significativo alla comprensione della regolazione a livello cellulare della morfogenesi come la polarità cellulare1,la divisione cellularemodello 1, la decisione del destino cellulare

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Protocollo

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1. Preparazione del tallone adesivo in polistirolo

NOTA: questo protocollo non richiede una tecnica asettica.

  1. Pesare 10 mg di carboxylate modificato perline di polistirolo in un tubo di microcentrifuga 1,5 mL.
  2. Per lavare le perline, aggiungere 1 mL di 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) tampone nel tubo. Poiché il buffer MES non contiene fosfato e acetato, che può ridurre la reattività del carbodiimide, è adatto all'uso nella reazione di accoppiamento delle proteine. Vorticare il tubo per mescolare le perline.
  3. Girare il tubo per 60 s a 2.000 x g attraverso una centrifuga panca.
  4. Scartare....

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Risultati

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Per la preparazione delle perline, abbiamo determinato la quantità ottimale di Rhodamine Red-X succinimidyl ester per la deformazione transgenica che esprime GFP-myosin II e mCherry-histone (Figura 1A-D). Abbiamo usato mCherry etichettato istono come marcatore della progressione del ciclo cellulare. Poiché sia Rhodamine Red-X che mCherry saranno illuminati da un laser da 561 nm, l'intensità ottimale del segnale Rhodamine Red-X è paragonabile a quella dell'istone per consenti.......

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Discussione

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La ricostituzione dei modelli di contatto cellulare semplificati consentirà ai ricercatori di testare i ruoli di specifici modelli di contatto cellulare in diversi aspetti della morfogenesi. Abbiamo usato questa tecnica per dimostrare che l'asse di divisione cellulare è controllato dal contatto fisico con perline adesive10. Poiché la specifica dell'asse di divisione è fondamentale per lo sviluppo multicellulare contribuendo alla morfogenesi14, divisione delle cellule stamin.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Ringraziamo James Priess e Bruce Bowerman per la consulenza e la fornitura di ceppi C. elegans, Don Moerman, Kota Mizumoto, e Life Sciences Institute Imaging Core Facility per la condivisione di attrezzature e reagenti, Aoi Hiroyasu, Lisa Fernando, Min Jee Kim per la manutenzione di C. elegans e la lettura critica del nostro manoscritto. Il nostro lavoro è supportato dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), (RGPIN-2019-04442).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1-(3-Dimetilamminopropil)-3-etilcarbodiimmide cloridratoAlfa AesarAAA1080703Per la preparazione del micrometallo
Assemblaggio del tubo aspiratoreDrummond21-180-13Per l'isolamento del blastomero.
Caenorhabditis elegans ceppo: N2, wild-typeCaenorhabditis Genetics CenterN2Ceppo utilizzato in questo studio
Caenorhabditis elegans ceppo: KSG5, genotipo: zuIs45; itIs37in houseKSG5Ceppo utilizzato in questo studio
Mircopipets calibrato, 10 &; LDrummond21-180-13Per l'isolamento del blastomero
Perle di polistirene modificato con carbossilato (30 µ m di diametro)KISKER BiotechPPS-30.0COOHPPer la preparazione delle perle
CD Concentrato lipidicoLife Technologies11905031Per l'isolamento dei blastomeri. Lavorare nella cappa di coltura tissutale.
CloroxCloroxN. A.Per l'isolamento dei blastomeri. Aprire un nuovo flacone quando il trattamento con ipoclorito non funziona bene.
Porta vetrino coprioggettiIn houseN.A.Per l'isolamento dei blastomeri.
Microscopio da dissezione: Zeiss Stemi 508 con supporto M. La fonte di luce è il LED incorporato. L'ingrandimento dell'oculare è 10X.Carl ZeissStemi 508Per l'isolamento dei blastomeri.
Siero fetale bovino, qualificato One Shot, origine CanadaGibcoA3160701Per l'isolamento dei blastomeri. Lavorare nella cappa di coltura tissutale.
Aghi ipodermici per uso generale e scorrimento di precisione, calibro 25BD14-826AAPer l'isolamento dei blastomeri
InulinaAlfa AesarAAA1842509Per l'isolamento dei blastomeri
Soluzione vitaminica MEM (100x)Gibco11120052Per l'isolamento dei blastomeri.
MES (cristalli bianchi fini)Fisher BioReagentsBP300-100Per la preparazione delle microsfere
Vetrino Multitest 10 pozzettiMP BiomedicalsICN6041805Per l'isolamento dei blastomeri
PBS, soluzione salina tamponata con fosfato, 10 x PolvereFisher BioReagentsBP665-1Per la preparazione delle perle
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)Gibco15140148Per il Isolamento dei blastomeri.
PolivinilpirrolidoneFisher BioReagentiBP431-100Per l'isolamento del blastomero
Cloruro di potassioBioshopPOC888Per l'isolamento del blastomero
Rodamina Red-X, Succinimidil estere, 5-isomeroSonde molecolariR6160Per la preparazione delle microsfere
Schneider' s Drosophila Sterile MediumGibco21720024Per l'isolamento del blastomero. Lavorare nella cappa di coltura tissutale.
Cloruro di sodioBioshopSOD001Per l'isolamento del blastomero
Soluzione di idrossido di sodio, 10 NFisher ChemicalSS255-1Per l'isolamento del blastomero
Microscopio confocale a disco rotante: Yokogawa CSU-X1, cannocchiale invertito Zeiss Axiovert, fotocamera Quant EM 512, obiettivo apocromatico 63X NA 1.4 Plan. Il sistema era controllato da Slidebook 6.0.Innovazione nell'imaging intelligenteN.A.Per l'imaging dal vivo
Filtri per siringhe, PTFE, Basix non sterili13100115Per l'isolamento dei blastomeri.
Tygon S3 Tubo da Laboratorio, Formulazione E-3603, Diametro interno 3.175 mmSaint Gobain Performance Plastics89403-862Per l'isolamento dei blastomeri.
Tygon S3 Tubo da Laboratorio,, Formulazione E-3603, Diametro interno 6,35 mmSaint Gobain Performance Plastics89403-854Per l'isolamento dei blastomeri.

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herman, M. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , (2006).
  2. Rose, L., Gonczy, P. Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos. WormBook. , (2014).
  3. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner....

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C Elegans EmbryoBlastomere IsolationPolystyrene BeadsCell Contact ReconstitutionEggshell RemovalCapillary PreparationFluorescent LabelingLive ImagingSpindle OrientationCell Division Axis

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