In vitro ricostituzione dei modelli di contatto cellulare spaziale con Caenorhabditis isolato elegans Embrione Blastomeres e Perline in polistino adesivo

Sommario

Le complessità tissutali dei sistemi multicellulari confondere l'identificazione della relazione causale tra segnali extracellulari e comportamenti cellulari individuali. Qui, presentiamo un metodo per studiare il legame diretto tra segnali dipendenti dal contatto e assi di divisione utilizzando i blastomeri embrionali C. elegans e le perle adesive in polistirolo.

Abstract

Nei sistemi multicellulari, le singole cellule sono circondate dai vari segnali fisici e chimici provenienti dalle cellule vicine e dall'ambiente. Questa complessità tissutale confonde l'identificazione del legame causale tra segnali estrinseci e dinamiche cellulari. Un sistema multicellulare sinteticamente ricostituito supera questo problema consentendo ai ricercatori di testare uno spunto specifico eliminandone altri. Qui, presentiamo un metodo per ricostituire i modelli di contatto cellulare con caenorhabditis elegans blastomere isolati e perline di polistirolo adesivo. Le procedure prevedono la rimozione del guscio d'uovo, l'isolamento del blastomere interrompendo l'adesione cellulare-cellula, la preparazione di perline di polistirolo adesivo e la ricostituzione del contatto cell-cell o cell-perad. Infine, presentiamo l'applicazione di questo metodo per studiare l'orientamento degli assi della divisione cellulare che contribuisce alla regolazione del patterning cellulare spaziale e delle specifiche del destino cellulare nello sviluppo degli embrioni. Questo metodo in vitro robusto, riproducibile e versatile consente di studiare le relazioni dirette tra i modelli di contatto delle cellule spaziali e le risposte cellulari.

Introduzione

Durante lo sviluppo multicellulare, i comportamenti cellulari (ad esempio, l'asse di divisione) delle singole cellule sono specificati da vari segnali chimici e fisici. Comprendere come le singole cellule interpretano queste informazioni e come regolano l'assemblaggio multicellulare come proprietà emergente è uno degli obiettivi finali degli studi di morfogenesi. L'organismo modello C. elegans ha contribuito in modo significativo alla comprensione della regolazione a livello cellulare della morfogenesi come la polarità cellulare^1,la divisione cellulare^{modello 1}, la decisione del destino cellulare

Protocollo

1. Preparazione del tallone adesivo in polistirolo

NOTA: questo protocollo non richiede una tecnica asettica.

1. Pesare 10 mg di carboxylate modificato perline di polistirolo in un tubo di microcentrifuga 1,5 mL.
2. Per lavare le perline, aggiungere 1 mL di 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) tampone nel tubo. Poiché il buffer MES non contiene fosfato e acetato, che può ridurre la reattività del carbodiimide, è adatto all'uso nella reazione di accoppiamento delle proteine. Vorticare il tubo per mescolare le perline.
3. Girare il tubo per 60 s a 2.000 x g attraverso una centrifuga panca.
4. Scartare....

Risultati

Per la preparazione delle perline, abbiamo determinato la quantità ottimale di Rhodamine Red-X succinimidyl ester per la deformazione transgenica che esprime GFP-myosin II e mCherry-histone (Figura 1A-D). Abbiamo usato mCherry etichettato istono come marcatore della progressione del ciclo cellulare. Poiché sia Rhodamine Red-X che mCherry saranno illuminati da un laser da 561 nm, l'intensità ottimale del segnale Rhodamine Red-X è paragonabile a quella dell'istone per consenti.......

Discussione

La ricostituzione dei modelli di contatto cellulare semplificati consentirà ai ricercatori di testare i ruoli di specifici modelli di contatto cellulare in diversi aspetti della morfogenesi. Abbiamo usato questa tecnica per dimostrare che l'asse di divisione cellulare è controllato dal contatto fisico con perline adesive¹⁰. Poiché la specifica dell'asse di divisione è fondamentale per lo sviluppo multicellulare contribuendo alla morfogenesi¹⁴, divisione delle cellule stamin.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1-(3-Dimetilamminopropil)-3-etilcarbodiimmide cloridrato	Alfa Aesar	AAA1080703	Per la preparazione del micrometallo
Assemblaggio del tubo aspiratore	Drummond	21-180-13	Per l'isolamento del blastomero.
Caenorhabditis elegans ceppo: N2, wild-type	Caenorhabditis Genetics Center	N2	Ceppo utilizzato in questo studio
Caenorhabditis elegans ceppo: KSG5, genotipo: zuIs45; itIs37	in house	KSG5	Ceppo utilizzato in questo studio
Mircopipets calibrato, 10 &; L	Drummond	21-180-13	Per l'isolamento del blastomero
Perle di polistirene modificato con carbossilato (30 µ m di diametro)	KISKER Biotech	PPS-30.0COOHP	Per la preparazione delle perle
CD Concentrato lipidico	Life Technologies	11905031	Per l'isolamento dei blastomeri. Lavorare nella cappa di coltura tissutale.
Clorox	Clorox	N. A.	Per l'isolamento dei blastomeri. Aprire un nuovo flacone quando il trattamento con ipoclorito non funziona bene.
Porta vetrino coprioggetti	In house	N.A.	Per l'isolamento dei blastomeri.
Microscopio da dissezione: Zeiss Stemi 508 con supporto M. La fonte di luce è il LED incorporato. L'ingrandimento dell'oculare è 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	Per l'isolamento dei blastomeri.
Siero fetale bovino, qualificato One Shot, origine Canada	Gibco	A3160701	Per l'isolamento dei blastomeri. Lavorare nella cappa di coltura tissutale.
Aghi ipodermici per uso generale e scorrimento di precisione, calibro 25	BD	14-826AA	Per l'isolamento dei blastomeri
Inulina	Alfa Aesar	AAA1842509	Per l'isolamento dei blastomeri
Soluzione vitaminica MEM (100x)	Gibco	11120052	Per l'isolamento dei blastomeri.
MES (cristalli bianchi fini)	Fisher BioReagents	BP300-100	Per la preparazione delle microsfere
Vetrino Multitest 10 pozzetti	MP Biomedicals	ICN6041805	Per l'isolamento dei blastomeri
PBS, soluzione salina tamponata con fosfato, 10 x Polvere	Fisher BioReagents	BP665-1	Per la preparazione delle perle
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15140148	Per il Isolamento dei blastomeri.
Polivinilpirrolidone	Fisher BioReagenti	BP431-100	Per l'isolamento del blastomero
Cloruro di potassio	Bioshop	POC888	Per l'isolamento del blastomero
Rodamina Red-X, Succinimidil estere, 5-isomero	Sonde molecolari	R6160	Per la preparazione delle microsfere
Schneider' s Drosophila Sterile Medium	Gibco	21720024	Per l'isolamento del blastomero. Lavorare nella cappa di coltura tissutale.
Cloruro di sodio	Bioshop	SOD001	Per l'isolamento del blastomero
Soluzione di idrossido di sodio, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	Per l'isolamento del blastomero
Microscopio confocale a disco rotante: Yokogawa CSU-X1, cannocchiale invertito Zeiss Axiovert, fotocamera Quant EM 512, obiettivo apocromatico 63X NA 1.4 Plan. Il sistema era controllato da Slidebook 6.0.	Innovazione nell'imaging intelligente	N.A.	Per l'imaging dal vivo
Filtri per siringhe, PTFE, Basix non sterili		13100115	Per l'isolamento dei blastomeri.
Tygon S3 Tubo da Laboratorio, Formulazione E-3603, Diametro interno 3.175 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	Per l'isolamento dei blastomeri.
Tygon S3 Tubo da Laboratorio,, Formulazione E-3603, Diametro interno 6,35 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	Per l'isolamento dei blastomeri.