Articolo metodologico

Emissione di fluorescenza indotta dal laser (L.I.F.E.) come nuovo strumento non invasivo per le misurazioni in-situ dei biomarcatori in Habitat criosferici

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DOI:

10.3791/60447

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26 ottobre 2019

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1Institute of Ecology, University of Innsbruck, 2Austrian Polar Research Institute, University of Vienna, 3BrainLinks-BrainTools, Bernstein Center Freiburg, 4Atom Science, Kasevich Lab, Stanford University, 5Institute of Experimental Physics, University of Innsbruck, 6Department of Physics, Extraterrestrial Vehicle Instruments Laboratory, Harvey Mudd College

In questo articolo

Sommario

I flussi di carbonio nella criosfera sono difficilmente valutati, ma sono cruciali per quanto riguarda il cambiamento climatico. Qui mostriamo un nuovo prototipo di dispositivo che cattura il potenziale fototrofico in ambienti sopraglaciali basati sulla tecnologia di emissione di fluorescenza indotta dal laser (L.I.F.E.) che offre dati ad alta risoluzione spettrale e spaziale in condizioni di situ.

Abstract

Il riscaldamento globale colpisce le comunità microbiche in una varietà di ecosistemi, in particolare gli habitat criosferici. Tuttavia, si sa poco sui flussi di carbonio mediati microbici in ambienti estremi. Pertanto, la metodologia di acquisizione dei campioni descritta nei pochissimi studi disponibili implica due problemi principali: A) i dati ad alta risoluzione richiedono un gran numero di campioni, il che è difficile da ottenere in aree remote; B) inevalubile manipolazione del campione come il taglio, la segatura e lo scioglimento delle carote di ghiaccio che porta ad un malinteso delle condizioni in situ. In questo studio, non viene presentato un prototipo di dispositivo che non richiede né la preparazione del campione né la distruzione del campione. Il dispositivo può essere utilizzato per misurazioni in situ con un'alta risoluzione spettrale e spaziale negli ecosistemi terrestri e di ghiaccio e si basa sulla tecnica Laser-Induced Fluorescence Emission(L.I.F.E.). Le comunità sopraglaciali fotoautotrofiche possono essere identificate rilevando le firme L.I.F.E. nei fotopigmenti. Viene dimostrata la calibrazione dello strumento L.I.F.E. per i derivazioni di porphyrin clorofillaa (chla) (405 nm eccitazione laser) e B-phycoerythrin (B-PE) (532 nm di eccitazione laser). Per la convalida di questa metodologia, i dati L.I.F.E. sono stati ratificati con un metodo convenzionale per la quantificazione che prevedeva l'estrazione del pigmento e la successiva spettroscopia di assorbimento. L'applicabilità del prototipo sul campo è stata dimostrata in ambienti polari estremi. Ulteriori test sugli habitat terrestri hanno avuto luogo durante le simulazioni analogiche di Marte nel dessert marocchino e su un ghiacciaio roccioso austriaco. Lo strumento L.I.F.E. consente scansioni ad alta risoluzione di grandi aree con logistica operativa accettabile e contribuisce a una migliore comprensione del potenziale ecologico delle comunità sopraglaciali nel contesto del cambiamento globale.

Introduzione

La criosfera ospita ghiaccio marino, ghiacciai, laghi di alta montagna, zone di neve, ghiaccio del lago, corsi d'acqua di fusione e permafrost. Queste aree coprono circa l'11% delle masse terrestri della terra1,2 e sono sovrastate dall'atmosfera come un ambiente criosferico riconosciuto. Recenti studi dimostrano che le aree massicce della criosfera si stanno rapidamente ritirando3,4. L'Antartide5,6, le Alpi7, l'Artico8, e altre regioni mostrano saldi di massa di ghiaccio negativi. Il ritiro delle calotte glaciali e dei ghiacciai porta all'esaurimento del nostro più grande serbatoio d'acqua dolce sulla Terra. In alcune zone, il ritiro dei ghiacciai è inarrestabile5.

Per molto tempo, gli ecosistemi di ghiaccio sono stati considerati ambienti sterili. Tuttavia, nonostante le dure condizioni, la presenza di vita attiva nella criosfera terrestre è evidente9,10,11,12,13,14,15 . A causa della tendenza verso massicce perdite di ghiaccio mediante scioglimento, la criosfera sta attraversando uno spostamento dell'attività biologica, che colpisce gli habitat adiacenti. Per comprendere questi cambiamenti parzialmente irreversibili abbiamo bisogno di metodi per studiare l'attività biologica nel ghiaccio in condizioni di situ con alta risoluzione spaziale e temporale.

In ambienti sopraglaciali, la vita può essere trovata in fori di crioconite, coperture di neve, acqua fusa, corsi d'acqua e su superfici di ghiaccio nude. Tuttavia, gli habitat sopraglaciali più evidenti sono i fori di crioconite. Essi appaiono a livello globale in ambienti glaciati e sono stati descritti per la prima volta dall'esploratore svedese Adolf Erik Nordenskjold durante una spedizione in Groenlandia nel 187016,17. Il nome deriva dalle parole greche "kryos" (freddo) e "konia" (polvere). I detriti organici e inorganici di origine aeoliana si attaccano sulla superficie del ghiaccio e riducono l'albedo localmente. La radiazione solare favorisce lo scioglimento dei detriti in strati di ghiaccio più profondi, formando bacini cilindrici con sedimenti (crioconite) nella parte inferiore9. I fori di crioconite coprono lo 0,1-10% delle zone di ablazione glaciale11.

Le comunità di crioconite sono costituite da virus, funghi, batteri, cianobatteri, microalghe e protozoi. A seconda della regione, possono essere trovati anche organismi metazoicome rotiferi, nematodi, copepodi, tardigradi e larve di insetti. Edwards e altri18 descrivono i buchi di crioconite come "punti caldi ghiacciati". Hanno anche tracciato geni funzionali nei fori di crioconite che sono responsabili del ciclo N, Fe, S e P. Gli ecosistemi dei mini laghi respire e fotosintetizzano a i tassi che si trovano in habitat molto più caldi e ricchi di nutrienti11. Questi risultati sottolineano l'importante ruolo del sequestro microbico negli ambienti sopraglaciali. Oltre alle comunità viventi in fori crioconiti, le superfici di ghiaccio nude sono abitate da alghe di ghiaccio. La loro fisiologia è benstudiata 19 ma la loro distribuzione spaziale non è stata valutata20. La loro presenza in ambienti sopraglaciali diminuisce l'albedo e quindi promuove lo scioglimento che porta a un outwash nutriente e all'afflusso di nutrienti negli habitat a valle9. L'aumento delle temperature e quindi una maggiore disponibilità di acqua liquida influiscono sulla produttività netta dell'ecosistema in questi ecosistemi ghiacciati.

In ambienti sopraglaciali, gli organismi fotosinteticamente attivi trasformano il carbonio inorganico e l'azoto in fonti organiche e disponibili per la rete alimentare microbica21,22. Fino ad ora ci sono pochi studi che stimano i flussi di carbonio sopraglaciali11,20,23. La discrepanza nei tassi proposti di flusso di carbonio deriva da una bassa risoluzione dei dati spaziali e temporali. Inoltre, la distribuzione spaziale delle comunità sovraglaciali al di fuori dei fori di crioconite è appena valutata. Cook e altri20 hanno previsto nei loro modelli che le comunità di alghe sopraglaciali riparano fino a 11 volte più carbonio rispetto ai fori crioconiti contemporanei a causa della loro grande copertura superficiale. La scoperta di comunità di alghe sopraglaciali che garantiscono l'integrità dei campioni è ancora impedibile a causa della mancanza di strumenti per la rilevazione e la quantificazione in situ.

In risposta alle difficoltà logistiche, gli ecosistemi di ghiaccio sono studiati meno frequentemente degli habitat nelle aree temperate. La risoluzione dei dati dipende dal numero di campioni valutati e dall'accessibilità dei siti di studio. I metodi di campionamento standard come segatura, coring e successiva fusione comportano la manipolazione della comunità microbica. Ad esempio, la clorofillaa (chla) valutazione in campioni di ghiaccio solido è impossibile con metodi standard senza interferenze sostanziali. Di conseguenza, i cambiamenti di temperatura indotti dallo scioglimento all'interno delle comunità microbiche studiate sono inevitabili. In risposta alla termolabilità del fotosistema II e di altre strutture cellulari in psifili22, le analisi di laboratorio di campioni di ghiaccio fuso porteranno sempre ad una falsificazione delle condizioni in situ.

Le misurazioni in situ non distruttive sono l'unico modo ragionevole per ottenere dati affidabili. Questo obiettivo può essere raggiunto utilizzando metodi basati sulla fluorescenza. A causa della loro funzione di raccolta della luce, chla e B-phycoerythrin (B-PE) sono presenti in organismi che contribuiscono al ciclo del carbonio in ambienti sopraglaciali, come è stato dimostrato da Anesio e altri11. Quindi, queste molecole fluorescenti sono biomarcatori adatti per la quantificazione dei flussi di carbonio mediati microbici negli ecosistemi del ghiaccio.

In questo studio, presentiamo lo sviluppo, la calibrazione e l'applicabilità di un nuovo strumento non invasivo per la quantificazione in situ delle molecole chla e B-PE negli ecosistemi terrestri e glaciali. Il prototipo del dispositivo si basa sull'emissione fluorescente indotta dal laser, noto anche come L.I.F.E. Lo strumento ottico (Figura 1) cattura le firme dei biomarcatori fluorescenti dopo l'eccitazione a fluorescenza indotta dal laser. La procedura non è distruttiva e può essere eseguita presso il sito di studio o in laboratorio.

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Figura 1: Il prototipo L.I.F.E. Sinistra: Foto dello strumento senza coperchio protettivo. A destra: Illustrazione schematica dello strumento. Massa totale: 5,4 kg (laser e ottica- 4,025 kg, laptop - 1,37 kg). Telaio in alluminio: 32,5 cm x 20,3 cm x 6,5 cm. Tubo ottico: 18,4 cm x 4 cm (diametro). CCD: sensore bluefox mv220g; F: filtri a passaggi lunghi servo-steered (450 nm e 550 nm); L: lenti ottiche; M1: specchi; M2: specchio dicroico; MC: microcontrollore; P: prisma; PBS: separatore del fascio polarizzante; S: apertura a taglio fatta di lame di rasoio regolabili. Barra di scala - 70 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il kit portatile a doppia lunghezza d'onda pesa 4,5 kg e viene utilizzato su un treppiede in combinazione con un computer esterno. La configurazione del campo è semplice e veloce. Lo strumento è collegato al treppiede e il tubo dell'obiettivo è collegato al dispositivo insieme a un cavo USB e al cavo della fotocamera. Il computer esterno è collegato allo strumento tramite un cavo USB. Le gambe del treppiede sono regolate in modo tale che il tubo dell'obiettivo sia diretto e copra il campione. Quindi, un laser verde da 5 mW colpisce il campione dopo aver superato uno splitter a fascio polarizzante che reindirizza la luce polarizzata verso l'asse ottico dello spettrometro. L'esemplare presenta una luce fluorescente, illustrata in rosso nella Figura 1. Metà della luce collimata passa lo splitter del fascio polarizzante ed è focalizzata attraverso un filtro a passo lungo servo-guidato che rimuove i segnali laser. Successivamente, il segnale colpisce una fionda di apertura che consiste di due lame di rasoio regolabili. Un prisma spettrale separa la linea sottile dell'ortogonale della luce all'apertura della vela prima che il segnale venga catturato dal sensore. La procedura viene ripetuta con un laser blu. I dati grezzi vengono trasferiti automaticamente a un computer portatile che viene utilizzato anche per il funzionamento del software.

Lo strumento è controllato da un computer esterno utilizzando un ambiente LabVIEW che sincronizza la presa di immagini con la telecamera CCD, accendendo/spegnendo i laser e ruotando la rotellina del filtro a passo lungo. L'interfaccia utente grafica (GUI) è suddivisa in tre sezioni principali. La regolazione dell'esposizione viene eseguita manualmente. Sebbene la correzione tra il tempo di esposizione e l'intensità del segnale sia lineare (Figura 2B), il tempo massimo di esposizione è limitato a 10 s perché tempi di integrazione più lunghi portano a una riduzione significativa del rapporto segnale-rumore. Il campo commento viene utilizzato per la descrizione dell'esempio (Figura 2A). Nella sezione destra, le immagini non elaborate vengono visualizzate non appena le misurazioni sono terminate. Questa funzionalità è fondamentale per la valutazione immediata dei dati sul campo (Figura 2C–E). Le aree rosse indicano pixel sovraesposti, che possono essere evitati riducendo il tempo di esposizione.

Il successivo processo di riduzione dei dati non elaborati viene disaccoppiato dalla procedura di acquisizione dell'immagine e può essere eseguito in qualsiasi momento dopo l'acquisizione dell'immagine.

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Figura 2: interfaccia utente grafica L.I.F.E. per l'acquisizione dei dati e la valutazione dei dati grezzi. (A) Il software abilita l'immissione manuale del testo per le descrizioni di esempio. (B) Il tempo di esposizione può essere regolato prima della misurazione. (C-E) Le immagini raw vengono visualizzate sul lato destro dell'interfaccia. (E) I colori rossi indicano una saturazione del sensore. (F) L'attivazione del pulsante RUN MEASUREMENT attiva il processo di acquisizione dei dati. Nella matrice (G), vengono visualizzati tutti i comandi eseguiti automaticamente durante l'acquisizione dei dati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Esempio di immagine raw. Sinistra: Dati grezzi di chluno standard nella soluzione acetone, registrati con lo strumento L.I.F.E. A causa delle proprietà ottiche del dispositivo, il segnale viene visualizzato come una linea deformata. A destra: Interpretazione dell'immagine raw per pixel (px). L'asse spettrale (risoluzione 5 nm/px) viene tracciato rispetto all'asse spaziale (risoluzione 30 m/px). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le immagini raw in scala di grigi a 12 bit mostrano un componente spaziale a causa della linea di apertura unidimensionale e di un componente spettrale a causa del prisma davanti al CCD (Figura 3). In risposta ai vincoli ottici, le immagini raw vengono distorte. Pertanto, devono essere ritagliati e dewarped applicando un codice che riconosce il grado di distorsione. Questa operazione viene eseguita con una procedura guidata del software (Figura 4). Successivamente, la calibrazione della lunghezza d'onda viene eseguita con il laser da 532 nm. La luce verde è prodotta dal raddoppio di frequenza di un laser a infrarossi da 1.064 nm. Entrambe le lunghezze d'onda possono essere rilevate dal CCD e, pertanto, la posizione spettrale di ogni pixel può essere calcolata automaticamente in immagini dewarped (Figura 4).

L'immagine viene quindi ritagliata fino a raggiungere un determinato intervallo di lunghezza d'onda (550-1.000 nm per le misurazioni laser verdi e 400-1.000 per le misurazioni laser blu). I valori di grigio di ogni pixel in una linea di pixel selezionata vengono conteggiati e sommati. Un valore grigio può essere compreso tra 0 e 255. Dopo di che, ogni linea di pixel rappresenta un numero. Ulteriori istruzioni software sullo schermo portano alla generazione di un grafico che mostra i conteggi dei valori grigi di ogni linea pixel tracciata rispetto alle coordinate spaziali. Ciò consente una discriminazione spaziale quantitativa di chla e B-PE contemporaneamente nel campione. Inoltre, le proprietà spettrali di un campione possono essere tracciate automaticamente dalle linee di pixel selezionate.

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Figura 4: Deformazione delle immagini non elaborate. Sinistra: Immagine grezza catturata con un laser verde. Non è stato utilizzato alcun filtro. I segnali vengono visualizzati a 532 nm e 1.064 nm. Tempo di esposizione: 0,015 s. Centro: il segnale ritagliato da 532 nm viene utilizzato come linea di riferimento per dewarp un set di immagini. A destra: Immagine dewarpat dall'origine dell'immagine raw. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

1. Calibrazione e convalida

NOTA: Per la calibrazione del pigmento, preparare le file di diluizione da soluzioni stock di chla e B-PE. La soluzione di riserva chlviene diluita con acetone e B-PE viene diluita con acqua sterile distillata. In seguito, saranno necessari 15 mL di ogni fase di diluizione. Proteggere i pigmenti dalla luce avvolgendoli con un foglio di alluminio. Conservare il chla in un congelatore e il B-PE in frigorifero fino a ulteriore utilizzo. Un protocollo dettagliato per la riga di diluizione segue nelle sezioni 1.1 per chla e 1.2 per B-PE. Di seguito è descritto sia il chla che la calibrazione di laboratorio B-PE per il rilevamento e la quantificazione dei pigmenti con lo strumento L.I.F.E. di seguito. Una calibrazione precedente24 è stata fatta con gli stessi pigmenti di questo studio.

  1. Clorofillauna fila di diluizione
    1. Sciogliere 1 mg di chla (purificato dalle alghe A. nidulans) con acetone in un tubo campione da 50 mL e diluire questo chluna soluzione di brodo con acetone alle seguenti concentrazioni finali: 1.000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10; 5; 1; e 0,5 ng/mL.
    2. Trasferire 15 mL di ogni diluizione in tubi campione da 50 mL e coprirli in un foglio di alluminio a causa della sensibilità alla luce. Conservare i tubi in un congelatore da -20 gradi centigradi fino a quando non vengono prese le misure di calibrazione.
      NOTA: il protocollo può essere interrotto qui.
    3. Misurare le caratteristiche di assorbimento chla da ogni diluizione in uno spettrofotometro a doppio fascio come triplicati e calcolare il contenuto chla come descritto da Lorenzen25, che sarà descritto in dettaglio nella sezione 2.2.2.
  2. Riga di diluizione PE
    1. Diluire una soluzione di riserva B-PE da 4 mg/mL con acqua sterile filtrata (pH - 7) alle seguenti concentrazioni finali: 1.000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10; e 5 ng/mL B-PE. Trasferire 15 mL di ogni diluizione in un tubo campione da 50 mL e coprirlo con un foglio di alluminio. Conservare a 4 gradi centigradi fino a ulteriore utilizzo.
      NOTA: il protocollo può essere interrotto qui.
  3. Configurazione per la calibrazione
    1. Creare un rack come illustrato nella Figura 5 per stabilire tre piattaforme di misurazione, ciascuna 1,5 cm superiore alla successiva.
      NOTA: L'altezza del rack e della colonna svolgono un ruolo importante per le misurazioni perché la superficie dei liquidi deve rimanere nel punto focale dello strumento L.I.F.E. come indicato nella figura 5.
    2. Aggiungere 5 mL della diluizione più concentrata in una fiala di plastica di poliscintilla e metterla sul punto più alto del rack. Misurare l'intensità della fluorescenza.
    3. Posizionare la fiala nella posizione centrale del rack e aggiungere altri 5 mL (10 mL di volume totale). Misurare l'intensità della fluorescenza. Ripetere la procedura nella posizione più bassa sul rack con altri 5 mL (15 mL di volume totale; per un totale di 45 mm in altezza della colonna).
      NOTA: Adattare il tempo di esposizione per ogni fase di diluizione per impedire la saturazione del rivelatore (valori di grigio superiori a 255 nelle immagini a 12 bit) e per un rapporto segnale-rumore sufficiente dei segnali di fluorescenza deboli.
    4. Ripetere i passaggi 1.3.2 e 1.3.3 con tutti i diluizioni (passaggi 1.1.1 e 1.2.1) di chla e B-PE.
    5. Caricare i file di dati generati nella procedura guidata di riduzione dei dati per contare e sommare automaticamente i valori grigi di ogni linea di pixel lungo l'asse Y (distribuzione spaziale).
      NOTA: i tempi di esposizione variabili vengono compensati automaticamente normalizzando l'intensità della fluorescenza a un tempo di integrazione di 1 s.
    6. Calcolare la densità dell'area del pigmento con un'analisi di regressione di Poisson utilizzando le concentrazioni note della serie di diluizione e le intensità di fluorescenza normalizzate calcolate. Quindi normalizzare i conteggi di fluorescenza dalle tre diverse altezze della colonna a 1,5 cm (5 mL) moltiplicando i conteggi da ogni altezza della colonna con un fattore (fattori 1, 0,5 e 0,33, rispettivamente per le soluzioni di concentrazione da 5 mL, 10 mL e 15 mL).

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Figura 5: Impostazione per la calibrazione L.I.F.E. con chla e B-PE in condizioni di laboratorio.
(A) Tubo lente dello strumento. (B) Laser verde per l'eccitazione B-PE. (C) Laser blu per chl un'eccitazione. (D) Fiala scintillante. (E) Punto focale dello strumento L.I.F.E. (F) B-PE/acqua o chlunasoluzione /acetone con 5 mL, 10 mL e 15 mL. (G) Distanziali che mantengono la superficie di ogni soluzione sul piano focale per tre volumi diversi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Campionamento ed elaborazione del campione

  1. Raccolta di neve e ghiaccio
    1. Raccogliere neve e ghiaccio sopraglaciale da un ghiacciaio in sterili sacchetti di polietilene e conservarli congelati fino a un'ulteriore lavorazione.
      NOTA: Per questo studio, i campioni sono stati raccolti a Midtre Lovenbreen (MLB), un ghiacciaio politermico vicino al villaggio di ricerca Ny-Slesund nell'alto arcipelago artico delle Svalbard (78'53' N, 12'03' E).
    2. Campiona i tappetini batterici dal moncello del ghiacciaio in sacchetti sterili di polietilene e trasporta tutti i campioni in un laboratorio per un'ulteriore lavorazione.
    3. Sciogliere il materiale congelato lentamente al buio a 4 gradi centigradi. Filtrare i campioni di liquido sui filtri GF/F (47 mm di diametro) e notare il volume filtrato. Mantenere i filtri congelati fino a ulteriori elaborazioni.
  2. Clorofillauna misura
    1. Utilizzando lo strumento L.I.F.E., misurare il filtro in quattro aree casuali, ciascuna in triplicati utilizzando il laser verde e blu. Calcolare la concentrazione complessiva di pigmenti moltiplicando la densità dell'area con l'area filtrata e il volume filtrato. Normalizzare la concentrazione di pigmenti (G/L) in un volume di 1 L.
    2. Valutare il contenuto di chla dei filtri GF/F con uno standard di laboratorio secondo il protocollo di Lorenzen25. Per farlo, mettere ciascuno dei filtri in una fiala con 13 mL di acetone e conservarli al buio a 4 gradi durante la notte. Successivamente, prendere una fiala e posizionarlo sul ghiaccio prima della sonicazione per 2 min al 50% di potenza in modalità continua. Stringere e rimuovere il filtro dalla fiala.
    3. Attaccare i tubi di tygon a una siringa e rimuovere il chlun mix di estrazione-acetone dalla fiala. Sostituire il tubo di tipo tygon con un supporto filtrante GF-5. Trasferire la soluzione in una cuvette al quarzo.
    4. Dopo aver calibrato lo spettrometro di assorbimento per l'acetone, posizionare il campione nella cuvette nello spettrometro e misurare le caratteristiche di assorbimento tra 400 e 750 nm. Quindi, rimuovere la cuvette dallo spettrometro e aggiungere al campione 200 luna di 2 M HCl. Quindi, ripetere la misura di assorbimento per misurare il contenuto di phaeophytin nel campione.
  3. Misurazione dell'attività microbica tramite marcatori radioetichettati e impatto dell'intensità del laser e del tempo di esposizione sui tassi di produttività
    AVVISO: Attenzione alla radioattività del marcatore (radiazione z-radiazione). Usa un cappotto da laboratorio, guanti e occhiali e lavora sotto un cofano di fumi in un laboratorio di isotopi autorizzato.
    1. Per la produzione batterica trasferire cinque aliquote di stuoie batteriche in sacchetti sterili di polietilene. Inattivare i controlli con formaldeide ad una concentrazione finale del 4%.
      NOTA: Tre aliquote vengono utilizzate per l'assorbimento di leucina con etichetta 3H e due aliquote vengono utilizzate come controlli.
    2. Esponi i tappetini con un laser blu (405 nm, 5 mW) e con un laser verde (532 nm, 5 mW) per 10 s e 30 s ciascuno. Ripetere la procedura con laser da 50 mW. Quindi, disattivare i campioni che non sono stati trattati con formaldeide.
      NOTA: Un tappetino viene utilizzato per una sola esposizione laser. Utilizzare tappetini microbici non esposti come controlli.
    3. Dopo il trattamento laser, stimare la produzione batterica e primaria incorporando 3H-leucina e NaH14CO3, rispettivamente. Per le misurazioni della produzione batterica, utilizzare cinque campioni per campione (20 mL) e aggiungere la forma (concentrazione finale del 4%) a due dei paralleli, che fungono da controlli per l'incorporazione abiotica del marcatore. Aggiungere 3H-leucina (40 nM) a tutti i campioni dei vari trattamenti e incubarli per 4 h in condizioni di situ (0,1 gradi centigradi). Terminare la reazione aggiungendo linea di forma ai restanti campioni vivi.
    4. Per la produzione batterica di stuoie batteriche, trasferire campioni etichettati in crioviali. Estrarre cellule con 5% acido tricrloroacetico e centrifugare a 10.000 x g per 5 min secondo i protocolli di Kirchman26 e Bell27. Aggiungere il liquido scintillante e mettere il crioviale in una fiala di poliscintilla. Analizzare i campioni con un contatore di scintillazione liquida e calcolare i tassi di assorbimento.
      NOTA: per l'assorbimento di leucina con etichetta Hvengono utilizzati tre aliquote, due aliquote vengono utilizzate come controlli.
    5. Per la produzione primaria, preparare cinque repliche di vari trattamenti (100 mL), avvolgerne due in un foglio di alluminio per imitare i campioni scuri e aggiungere NaH14CO3 (1 -Ci) a tutti. Incubare per 4 h nella luce ambiente e in temperatura in situ (0,1 gradi centigradi). Terminare la reazione oscurando le restanti tre repliche e filtrare il campione su filtri GF/F (diametro di 25 mm).
    6. Aggiungete 100 luna di 2 N HCl ai filtri per rimuovere tutto il carbonio in eccesso e farlo uscire sotto il cofano dei fumi. Asciugare i campioni su una piastra di riscaldamento a 80 gradi centigradi e metterli i campioni nelle fiale di poliscintilla.
    7. Per misurare le disgregazioni radioattive al minuto (dpm) di tutti i trattamenti di produzione primaria e batterica, mettere i crioviali in fiale di poliscintilla e aggiungere 5 mL di cocktail di filtrazione. Misurare dpm con un contatore scintillio liquido e calcolare i tassi di assorbimento.

Risultati

Calibrazione di laboratorio per B-PE
I segnali di risposta della riga di diluizione B-PE sono stati misurati con lo strumento L.I.F.E. in una stanza buia a 20 gradi centigradi(Figura 6). Il tasso di conteggio dipendeva sia dalla concentrazione che dall'altezza della colonna del campione misurato. Campione B-PE a bassa concentrazione e bassa altezza della colonna fluoresce più forte rispetto a campioni della stessa concentrazione e altezza della colonna più alta.

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Figura 6: calibrazione di laboratorio B-PE. Viene visualizzata la calibrazione del contenuto B-PE e della densità delle colonne. I tassi di conteggio normalizzati sono stati calcolati per un'altezza della colonna di 1,5 cm. Ristampa con permesso28. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per l'adattamento della linea di calibrazione finale è stata utilizzata una regressione di Poisson. C'era una correlazione lineare tra le densità di area e i conteggi dei valori di grigio pixel. La funzione della curva era y - 81.04x (Figura 7), il che significa che un tasso di conteggio del valore grigio di 8.104 in un campione esposto di 1 s è uguale a una densità di area di 100 ng/cm2 B-PE. La calibrazione chla è impostata in modo analogico. La funzione era y - 8,94x.

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Figura 7: Curva di calibrazione finale per B-PE. I conteggi dei valori di grigio sono stati normalizzati in un tempo di esposizione di 1 s e tracciati rispetto alla densità dell'area. Ristampa con permesso28. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Applicazione su campioni di crioconite da Svalbard e convalida di laboratorio dei dati
I valori medi delle misurazioni L.I.F.E. e le singole misurazioni degli stessi campioni derivati dall'estrazione convenzionale mediante l'acetone e l'analisi successiva con uno spettrofotometro sono illustrati nella figura 8.

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Figura 8: Convalida dei dati con campioni naturali. I campioni (MLB) sono classificati per chlun contenuto, in base ai risultati di uno spettrofotometro di laboratorio (singoli valori) e confrontati con i dati di a fluorescenza chlmisurati su quattro aree casuali per filtro. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard delle misurazioni L.I.F.E. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Chlun contenuto compreso tra 48 g/L-67 g/L sono stati sottovalutati, e il prototipo L.I.F.E. è stato sopravvalutato da 0,7 g/l. Le deviazioni standard dalle misurazioni L.I.F.E. erano basse.

Confronto dei dati spettrali delle misurazioni in situ con gli standard di laboratorio
Chluno spettri erano comparabili tra i campioni di crioconite e quelli provenienti da alghe A. nidulans. I picchi di fluorescenza in tutti i campioni erano situati a 700 nm-710 nm. Tuttavia, gli spettri derivati da campioni di crioconite mostravano segnali di rumore più elevati tra 400 nm-650 nm e da 800 nm–1.000 nm rispetto agli spettri dello standarddi pigmento chl (Figura 9).

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Figura 9: Interpretazione dei dati spettrali. Misurazioni di quattro granuli di crioconite (blu) e un chluna soluzione pigmento standard (rosso) dopo l'eccitazione con laser da 405 nm. Gli spettri sono stati registrati 1 anno dopo la raccolta del campione. I campioni sono stati tenuti congelati e non sono stati esposti alla luce prima della misurazione. In risposta a problemi di calibrazione della lunghezza d'onda, il picco di fluorescenza si trova a 700 nm-710 nm anziché 680 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Analisi automatizzata del grano crioconita
In un esempio di analisi automatizzata di un foro crioconite (Figura 10), le densità più alte dell'area di pigmento sono state osservate alla linea di pixel 50. Lo spettro campione dopo l'eccitazione con un laser da 532 nm ha mostrato un picco con un taglio con un valore grigio di 255 in risposta alla sovrasaturazione del sensore. Questo picco deriva dal laser verde e non dal segnale fluorescente.

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Figura 10: Analisi automatica dei dati di un singolo granulo crioconite con un diametro di 1 mm. Il campione è stato raccolto a Vestre Bràggerbreen (VBB) e misurato entro 4 ore dopo il campionamento in una sala di laboratorio buia presso la Stazione Artica (GB) a Ny-Elesund. La colonna di sinistra mostra le misure B-PE e la colonna di destra rappresenta chlun dato. Le immagini raw vengono visualizzate in alto. Le risposte a fluorescenza indotta dal laser vengono visualizzate in grigio. Le aree rosse indicano la risposta dai pigmenti standard. La sezione centrale illustra la distribuzione spaziale dei pigmenti bersaglio. Le proprietà spettrali del segnale di fluorescenza vengono visualizzate nelle immagini inferiori. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Impatto dell'eccitazione laser sulla produttività nei tappeti batterici
Né la produttività primaria né quella batterica sono state influenzate quando si aumentava la potenza del laser e/o il tempo di esposizione (Figura 11). Non sono state rilevate differenze significative nei trattamenti laser con maggiore potenza.

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Figura 11: Misurazioni di produttività dei campioni provenienti dalle Svalbard. I tappetini batterici sono stati esposti con laser verdi e blu di intensità laser variabili e tempi di esposizione. I dati sono colorati in base alla sorgente della lunghezza d'onda laser (verde e blu). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Calibrazione
C'è stata una correlazione lineare tra la concentrazione di pigmenti e l'intensità della fluorescenza dopo la normalizzazione dei conteggi dei fotoni a un tempo di esposizione di 1 s. Campioni con bassa altezza della colonna e basse concentrazioni di pigmenti hanno portato a una sopravvalutazione dei pigmenti bersaglio, rispetto alle altezze delle colonne più elevate con la stessa concentrazione di pigmento. Inoltre, i deboli segnali di fluorescenza richiedevano lunghi tempi di esposizione per un numero sufficiente di fotoni sul sensore. Tuttavia, i lunghi tempi di integrazione hanno anche aumentato la quantità di luce vagante sul sensore, con conseguente riduzione del rapporto segnale-rumore. Nella sua versione attuale, il software non è in grado di distinguere tra rumore e segnale durante il processo di riduzione dei dati. Di conseguenza, le misurazioni a bassa intensità di fluorescenza hanno portato a una sopravvalutazione del pigmento perché il rumore è stato contato come un segnale derivante dai pigmenti bersaglio. Inoltre, le intensità di fluorescenza da soluzioni di pigmento più concentrate hanno mostrato una maggiore variabilità rispetto alle soluzioni a bassa concentrazione. Questo effetto potrebbe essere spiegato dai processi di assorbimento all'interno delle soluzioni di pigmento che sono state utilizzate per la curva di calibrazione.

Convalida dei dati per la clorofilladi una quantificazione
Dopo aver filtrato campioni di ghiaccio e neve, i campioni tridimensionali sono quasi apparsi come un campione bidimensionale sul filtro. Ciò giustificava un confronto diretto tra L.I.F.E (densità di area) e dati spettrofotometrici (misurazione volumetrica).

La serie di dati (Figura 8) indicava che un'elevata concentrazione di pigmenti porta a una sottostima, mentre una bassa concentrazione di pigmenti porta ad una sopravvalutazione del valore effettivo. Questo effetto può essere spiegato dallo spessore della torta del filtro e, quindi, dal carattere volumetrico del campione. La profondità di penetrazione del laser dipendeva dalla densità ottica e dallo spessore del campione. L'elevato contenuto di pigmenti è stato sottovalutato perché il laser non poteva indurre la fluorescenza del pigmento negli strati più profondi. Tuttavia, nelle torte sottili del filtro, sono stati catturati segnali a bassa fluorescenza a causa della bassa densità di area dei pigmenti. Apparentemente, il filtro stesso ha mostrato segnali indotti dal laser dopo aver superato il filtro long-pass di 450 nm (Figura 12). Questo segnale è stato conteggiato in modo fuorviante come segnale di fluorescenza derivato da chla. Così, torte filtranti sottili e troppo spesse sono difficili da misurare con lo strumento L.I.F.E.

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Figura 12: Segnali di fluorescenza da torte filtranti spesse (A) e sottili (B) su un filtro GF/F. (A) L'autoombreggiatura impedisce la fluorescenza indotta dal laser dagli strati più profondi, che si traduce in una sottostima dell'effettiva concentrazione di pigmento. (B) Emissione di fluorescenza dalla torta filtrata con sovrapposizione mediante riflessi filtranti. (C) I dati grezzi mostrano la riflessione del filtro (grigio). La proprietà spettrale di un cl derivato da laboratorioun modello di fluorescenza è illustrata in rosso. Barra di scala - 45 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Limitazioni del prototipo L.I.F.E.
Durante la riduzione dei dati, il software codificato MATLAB ha interpretato le immagini raw sommando le linee dei pixel all'interno di un determinato intervallo di lunghezza d'onda. L'attuale versione del software non distingueva tra segnali derivati organici e inorganici. La presenza di più segnali potrebbe portare a una sopraelevazione del contenuto effettivo del pigmento. I lunghi tempi di esposizione dovuti a basse intensità di fluorescenza hanno portato a una diminuzione del rapporto segnale-rumore, promuovendo l'effetto come descritto sopra (vedere la figura 8 e la figura 12).

Una roccia di geode mostrata nella Figura 13 mostrava luce fluorescente rossa quando esposta con luce verde e blu. Attualmente, non è chiaro se la fluorescenza derivasse da minerali o da molecole a base di porfirina. Di conseguenza, una sovrapposizione di segnali biologici e non biologici può limitare l'applicazione di questo metodo e richiedere la creazione di un database di fluorescenza appositamente realizzato per il prototipo L.I.F.E.

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Figura 13: Fluorescenza minerale da una roccia di geode, che si trova a Ny-Elesund. La roccia era eccitata con un laser da 532 nm da 50 mW (A) e un laser da 405 nm da 50 mW (B). Entrambe le immagini sono state catturate con un filtro di polarizzazione attaccato sulla lente, che ha portato ad una falsificazione dei colori a fluorescenza effettivi. (C) Immagine a colori reale senza l'uso di un filtro di polarizzazione in condizioni di luce diurna. Barra di scala - 40 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Beutler e altri29 hanno concluso che gli spettri di emissione caratteristica dei cianobatteri negli ecosistemi marini dipendono dalle condizioni ambientali. Inoltre, lo stato metabolico ha un impatto sulle proprietà di fluorescenza negli organismi fototrofici30. Lo strumento L.I.F.E può distinguere tra il modello di fluorescenza algale e cianobatterico utilizzando librerie di bio-impronte digitali che contengono informazioni spettrali del campione correlate alle condizioni ambientali.

Nel chl adattato al buiouna molecola, tutti i centri di reazione sono completamente ossidati e disponibili per la fotochimica e nessuna resa di fluorescenza viene spenta31. Utilizzando la procedura L.I.F.E., un campione viene prima eccitato da un laser da 532 nm (verde) e poi con un laser da 405 nm (blu). Durante la seconda eccitazione da parte del laser blu, chla potrebbe mostrare una diminuzione della risposta di fluorescenza a causa dell'eccitazione precedente da parte del laser verde. Chla assorbe energia a 532 nm lunghezza d'onda, nonostante la sua distanza dalla sua lunghezza d'onda massima di assorbimento32. Prima dell'effettiva misurazione di chla 405 nm, il laser verde può causare reazioni fotochimiche, attivando meccanismi di spegnimento nei pigmenti bersaglio. Inoltre, la pre-illuminazione degli organismi fototrofici marini non ha portato a un cambiamento delle curve delle norme spettrali tra 450 nm-600 nm, mentre la deviazione standard nelle intensità di fluorescenza è aumentata del 25%29. A seconda della specie, le intensità di fluorescenza sono anche aumentate in risposta all'eccitazione precedente. Questo argomento richiede ulteriori indagini.

applicabilità
Abbiamo testato lo strumento L.I.F.E. in vari habitat con particolare attenzione ai fori di crioconite. Il laser è stato applicato con successo negli habitat del suolo e dei biofilm a causa dell'assenza di luce ambientale durante la misurazione. I granuli di crioconite potevano essere misurati quando gli strati di sedimenti bloccavano la luce da sotto il foro (Figura 14A,C). I fori crioconiti di sedimenti sottili erano permeabili per la luce vagante da sotto (Figura 14B). La luce vagante interferisce con la misurazione. Pertanto, la concentrazione di pigmenti nelle superfici di ghiaccio nudo non è ancora misurabile in condizioni di luce diurna. Gli sforzi di elaborazione del segnale sono attualmente in corso per consentire il funzionamento del sistema in condizioni di luce ambientale elevata.

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Figura 14: Foro crioconite con acqua liquida sulla parte superiore. (A) Crioconite sul ghiacciaio con tubo lente L.I.F.E. Barra di scala - 70 mm. (B) Lo strato di sedimenti (rosso) è molto sottile. La luce vagante sanguina attraverso lo strato di crioconite. (C) Lo strato di sedimenti è abbastanza spesso da bloccare la luce vagante da sotto. Questo tipo di foro crioconite è misurabile con lo strumento L.I.F.E. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In conclusione, il nostro strumento L.I.F.E. ha rilevato organismi fotoautotrofici in habitat terrestri come terreni, stuoie batteriche, biofilm e fori di crioconite sulle superfici glaciali. Le molecole bersaglio erano chla e B-PE. La risoluzione spaziale era di 30 m/px. Il limite di rilevazione per chla era 250 pg/mL e 2 ng/mL per B-PE. Dopo una calibrazione di laboratorio siamo stati in grado di quantificare il contenuto di pigmenti in campioni che sono stati raccolti nel nostro sito di studio nell'Artico. Abbiamo applicato un software autoprogrammato per un processo automatizzato di riduzione dei dati. Gli effetti della presenza di minerali e delle mutevoli condizioni di luce durante le misurazioni richiedono ulteriori indagini.

Con il riscaldamento climatico, l'aumento delle temperature porta a una maggiore disponibilità di acqua liquida, che si traduce in una maggiore attività biologica su superfici ghiacciate di natura autotrofica ed eterotrofica. Dovrebbero essere compiuti sforzi vigorosi per rilevare gli organismi eterotrofici in situ per dare un quadro completo della vita attiva nella criosfera. Questo potrebbe essere testato con altri pigmenti bersaglio e lunghezze d'onda di eccitazione laser appropriate. Pertanto, L.I.F.E. fornisce un adeguato sistema di monitoraggio che fornisce un'elevata risoluzione temporale e spaziale per condizioni sovraglaciali nel contesto con il cambiamento globale e le possibili applicazioni astrobiologiche.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano con gratitudine il colonnello (IL) J.N. Pritzker, la Fondazione Tawani, gli Stati Uniti, il Ministero federale austriaco della scienza, della ricerca e dell'economia (Sparkling Science SPA04_149 e SPA05_201), Alpine Forschungsstelle Obergurgl (AFO), Forum spaziale austriaco ( Roman Erler dell'Hintertuxer Natur Eis Palast, il direttore forestale e base austriaco Nick Cox della Stazione Artica di Ny Alesund (Svalbard). Siamo anche in debito con Sabrina Obwegeser, Carina Rofner e Fabian Drewes per il loro aiuto durante le riprese. Infine, vogliamo ringraziare James Bradley per aver dato la voce per il video concomitante.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
acetonMerck67-64-1
B-FicoeritrinInvirtrogenP6305
Clorofilla a standardSigma-AldrichC6144-1MG
formalinaMerckHT50112836%
GF/C filtriWhatmanWHA182202525mm diametro
HClMerckH175836,5-38%
L.I.F.E. PrototipoUniversità di Innsbruckcostruito su richiesta
LabViewNational InstrumentsSoftware, Laboratorio Virtual Instrumentation Engineering Workbench
Leucina, L-[4,5-3H], 1 mCiPerkin ElmerNET1166001MCradioattivo
Cocktail di scintillazione liquida Beckman Ready UseBeckmannon più disponibile, può essere compensato da Ultra Gold,
BeckmanesauritoLSC 6000 IC
NaH14CO3 (4 µ Ci/ml)DHI Danimarca4 μ Ci/ml, 1 mlradioattivo
Filtri in policarbonato osmonicoDHI DanimarcaPCTE25mm diametro, 0,2µ m dimensione dei pori
Fiale di poliscintillazionePerkin ElmerWHA1825047Provette per campioni da 20 ml
Sigma AldrichT2318-500EAProvette per centrifuga Greiner,
spettrofotometroHitachiNAModello U2001, qualsiasi fotometro per la spettroscopia di assorbimento che misura a 664 nm e 750 nm sarebbe appropriato
acido acetico tricrico (TCA)MerckT6399sonda ultrasonica al 100%
nano labQS1T-2
contatore a scintillazione liquida Packard da 50 ml

Riferimenti

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