Qui, presentiamo un metodo utilizzando supporti a membrana permeabili per facilitare lo studio della segnalazione paracrina senza contatto utilizzata dalle cellule tumorali per sopprimere la risposta immunitaria. Il sistema è suscettibile di studiare il ruolo dei fattori secreti sul tumore nell'smorzamento dell'attivazione dei macrofaci.
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Articolo metodologico
Studiare gli effetti dei ligandi paracrini setosecreti dal tumore sull'attivazione dei macrofagi utilizzando la co-cultura con i supporti membrana permeabili
In questo articolo
Sommario
Abstract
La segnalazione paracrina derivata dal tumore è una componente trascurata dell'immunosoppressione locale e può portare a un ambiente permissivo per la continua crescita del cancro e la metastasi. I segnali paracrini possono coinvolgere il contatto cellulare tra diversi tipi di cellule, come PD-L1 espresso sulla superficie dei tumori che interagiscono direttamente con PD-1 sulla superficie delle cellule T, o la secrezione di ligandi da una cellula tumorale per influenzare una cellula immunitaria. Qui descriviamo un metodo di co-cultura per interrogare gli effetti dei ligandi seminati dai tumori sull'attivazione delle cellule immunitarie (macrofago). Questa procedura semplice utilizza supporti permeabili a membrana di policarbonato disponibili in commercio da 0,4 m e piastre standard per la coltura dei tessuti. Nel processo descritto, i macrofagi sono coltivati nella camera superiore e nelle cellule tumorali nella camera inferiore. La presenza della barriera di 0,4 m consente lo studio della segnalazione intercellulare senza la variabile di confusione del contatto fisico, perché i due tipi di cellule condividono lo stesso mezzo e l'esposizione ai ligandi paracrini. Questo approccio può essere combinato con altri, come alterazioni genetiche del macrofago (ad esempio, l'isolamento dai topi genetici knock-out) o tumore (ad esempio, alterazioni mediate da CRISPR) per studiare il ruolo di specifici fattori e recettori secreti. L'approccio si presta anche ad analisi biologiche molecolari standard come la reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR) o l'analisi delle macchie occidentali, senza la necessità di smistamento del flusso per separare le due popolazioni cellulari. I saggi immunosorbena legati all'enzima (ELISA) possono essere utilizzati allo stesso modo per misurare i ligandi secreti per comprendere meglio l'interazione dinamica della segnalazione cellulare nel contesto del tipo di cella multipla. La durata della co-cultura può anche essere variata per lo studio di eventi regolati temporalmente. Questo metodo di co-cultura è uno strumento robusto che facilita lo studio dei segnali secreti da tumore nel contesto immunitario.
Introduzione
Recenti studi si sono concentrati sulla capacità delle cellule tumorali di evitare il rilevamento da parte delle cellule immunitarie, sopprimere l'attivazione immunitaria locale o di produrre un ambiente tolerogenico permissivo-permissivo nel microambiente tumorale. Sono state descritte due ampie classi di interazioni tumorali e cellulari immunitarie che facilitano questi effetti: interazioni mediate dal contatto o ligando secreti da tumore. Uno dei meccanismi più studiati e clinicamente trattabili dell'inibizione immunitaria mediata dal contatto utilizzata dai tumori è l'espressione del PD-L1, che interagisce con pd-1 sulle cellule T per inibire la loro attivazione e funzione1,2. In risposta all'interferone-gamma (IFNz), che è espresso da un certo numero di cellule immunitarie attivate, le cellule tumorali possono aumentare l'espressione della PD-L1 per indurre l'esaurimento delle cellule T attivate PD-1, impedendo così loro di sradicare efficacemente le cellule tumorali3. L'uso di anticorpi per bloccare l'interazione tra PD-L1 e PD-1 è attualmente utilizzato per trattare più tipi di cancro negli esseri umani4. Alla luce di questo successo clinico e di altri, l'identificazione e il targeting di meccanismi immunosoppressivi derivati dal tumore ha ricevuto una crescente attenzione.
Oltre alla soppressione dell'immunità adattiva, i tumori sono noti anche per secernere fattori che sopprimono le risposte pro-infiammatorie delle cellule immunitarie innate. Le secrezioni di tumore o indotte dal tumore, tra cui IL-6, IL-10, VEGF, IL-23, e il fattore stimolante della colonia (CSF-1), hanno dimostrato di inibire le risposte antitumorali di cellule killer naturali (NK), granulociti e cellule dendritiche nel microambiente tumorale5,6,7. Le cellule tumorali possono anche secernere fattori che distorceno il reclutamento e la differenziazione delle cellule derivate da mieloidi nel microambiente tumorale per promuovere la soppressione dell'attivazione delle cellule T8,9.
Un tipo di cellula immunitaria innata che ha un profondo effetto sulla progressione del tumore è il macrofago. Per molti anni, la presenza di macrofagi associati al tumore (TAM) è stata utilizzata come prognostico negativo della sopravvivenza del paziente10. Il concetto che i TAM immunosoppressi smorzinano la clearance dei tumori mediata dalle cellule immunitarie è stato introdotto più di 40 anni fa11. Più recentemente, è stato dimostrato che la risposta pro-infiammatoria dei macrofafi può essere abbassata mentre un fenotipo pro-tumorale può essere indotto nel microambiente tumorale. Questi macrofagi immunosoppressivi possono contribuire a una risposta tolerogenica, spingendo la progressione del tumore e la resistenza alla chemio e all'immunoterapia12. Dato che i macrofagi sono spesso uno dei leucociti più abbondanti con il tumore, il ripristino della loro attività immunitaria specifica del tumore rappresenta un potenziale bersaglio per le terapie anticancer13.
Mentre le interazioni mediate dal contatto tra cellule tumorali e macrofagi possono essere modellate attraverso la cocultura diretta, l'uso di supporti a membrana permeabili può chiarire quali fattori sevetore sono immunomodulatori senza l'influenza potenzialmente confusa del contatto tra cellule tumorali e immuni. Utilizzando metodi in qualche modo simili, altri hanno dimostrato il potenziale di identificare i fattori secreti nelle interazioni microglia/neuronale14 così come le cellule tumorali con cellule mesoteliane15. Abbiamo anche utilizzato con successo questa tecnica di co-coltura per caratterizzare il ruolo di una proteina sepolmorale, Pros1, come soppressore dell'espressione genica pro-infiammatoria dopo la stimolazione dei macrofagi peritoneali con LPS e interferone-gamma16. Qui descriviamo una metodologia semplice che può essere utilizzata per interrogare il modo in cui i fattori secreti sul tumore possono influenzare l'attivazione dei macrofafi.
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Protocollo
Tutte le procedure relative alla raccolta e all'uso di macrofagi murini peritoneali sono state condotte presso l'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill (UNC) e sono state approvate dall'UNC Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Cultura dei Macrofafi
NOTA: questa procedura può utilizzare macrofagi peritoneali primari (descritti in dettaglio di seguito), macrofagi derivati dal midollo osseo o linee cellulari di macrofagi come J774 (ATCC) o RAW264 (ATCC).
- Raccogliere macrofagi peritoneali come descritto in precedenza16,17 e piastra direttamente nella camera superiore (s) di un 0,4 m di membrana di poliestere inserto co-cultura 6 bene (Figura 1A).
NOTA: La resa approssimativa dei macrofagi da ogni isolamento è 1 x 106 celle in totale, quindi il numero medio di celle per pozzo è di 1,5–1,6 x 105 celle in un 6 pozzetti. - Cultura dei macrofagi raccolti nel Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12, 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 1x penicillin/streptomycin, 20 ng/mL macrophage colonia stimolante fattore stimolante (M-CSF) per 3 giorni a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
NOTA: La camera superiore contiene 1 mL di mezzo di coltura mentre la camera inferiore è riempita con 1,5 mL. Il mezzo deve essere aggiunto ad ogni camera.
2. Cocoltura di cellule tumorali con macrofagi
- Prima dell'uso, coltura cellule tumorali disponibili in commercio nel loro rispettivo mezzo seguendo i metodi di coltura dei tessuti ATCC-raccomandato.
- Lavare le cellule tumorali aderenti una volta con la salina tamponata da fosfato (PBS), aggiungere 0,05% trypsin - acido etileneaminetracetraacetico (EDTA), e incubare a 37 s fino a quando le cellule si staccano. Risospendere le cellule in FBS contenenti mezzo, quantizzare il numero totale di cellule utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare, quindi centrifugare per 5 min a 220 x g al pellet.
- Durante la centrifugazione, aspirare il mezzo dalle camere superiore e inferiore delle piastre di supporto permeabili contenenti membrana contenente macrofaci e sostituire con un mezzo fresco.
- Per le camere inferiori in cui saranno placcate le cellule tumorali, riempire con 1 mL di mezzo invece di 1,5 mL per consentire un volume sufficiente per l'aggiunta di cellule.
- Mezzo aspirato dalle cellule tumorali pelletate e resospendono le cellule in DMEM/F12 con 10% FBS, 1x penicillina / streptomiacina, e 20 ng/mL M-CSF ad una concentrazione di 3 x 105 cellule / mL.
- Aggiungere 0,5 mL di 3 x 105 cellule /mL delle cellule tumorali alla camera inferiore dei pozzi desiderati (Figura 1B).
NOTA: Le celle possono essere trattate immediatamente.
3. Trattamento delle cellule cocoltivate
- Per indurre l'espressione genica pro-infiammatoria dei macrofagi, trattare i macrofagi coscienti o co-coltivati aggiungendo 100 ng/mL IFN e 50 ng/mL LPS.
- Variare la durata dei tempi di trattamento in base alle esigenze. L'attivazione del macrofago avviene entro 2 h e una soppressione mediata dal tumore si verifica di 8 h. La co-cultura per 24 h produce una soppressione robusta e coerente derivata dal tumore.
NOTA: In alternativa, i macrofagi possono essere indotti ad adottare un fenotipo curativo pro-ferito attraverso l'aggiunta di fattori come l'interleucina-10 (IL10) e l'effetto del ligando secreto tumorato valutato.
- Variare la durata dei tempi di trattamento in base alle esigenze. L'attivazione del macrofago avviene entro 2 h e una soppressione mediata dal tumore si verifica di 8 h. La co-cultura per 24 h produce una soppressione robusta e coerente derivata dal tumore.
- Come controllo negativo, i macrofagi di coltura sorreggono singly e lasciano non trattati. Come controllo positivo, trattare i macrofagi coltivati in modo runzale con 100 ng/mL IFN e 50 ng/mL LPS.
4. Analisi a valle delle cellule cocoltivate
- Dopo che il tempo di incubazione desiderato è trascorso, isolare il mezzo di coltura lisiate o condizionata cellulare come desiderato, a seconda delle esigenze di test.
- Per isolare il lisato cellulare per l'analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi (qPCR), aspirare i media da entrambe le camere del pozzo e lavare una volta con 2 mL di PBS. Applicare il buffer di lisi RNA alla camera superiore contenente i macrofagi. Raschiare delicatamente la membrana per rilasciare il lisato cellulare e trasferirlo in un tubo di raccolta per un'ulteriore elaborazione secondo il protocollo del produttore del kit di isolamento dell'RNA.
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Risultati
Per determinare l'effetto dei ligandi setosecreti dal tumore sulla polarizzazione dei macrofagi, è stata utilizzata la procedura descritta. I macrofagi peritoneali coltivati in assenza di cellule tumorali sono stati utilizzati come controlli negativi (non trattati e a estrema sinistra) e positivi (IFN e LPS stimolati al2nd da sinistra)(Figura 2A). In alternativa, i macrofagi peritoneali sono stati co-coltivati con cellule tumorali del melanoma B16F10 (ATCC) (F...
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Discussione
Il saggio di co-cultura qui presentato è una modifica dei saggi stabiliti in precedenza che consente lo studio dei fattori secreti dal tumore sull'attivazione delle cellule immunitarie. Mentre il contatto cellulare è noto per indurre cambiamenti nell'attività immunitaria, la capacità dei ligandi seminati dai tumori di modulare l'attivazione immunitaria è meno ben compresa. Descriviamo un metodo che, a differenza della cocoltura diretta, può essere usato per interrogare come i fattori secreti derivati dai tumori influisco...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Eric Ubil è stato finanziato, in parte, dalla American Cancer Society Postdoctoral Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB). Il lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del NIH (R01-CA205398) e da un premio della Breast Cancer Research Foundation (BCRF-18-041) all'HSE.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| B16-F10 | ATCC | ATCC CRL-6475 | |
| Promega | A3500 | ||
| DMEM/F12 media | ThermoFisher Scientific- Gibco 11320033 | ||
| Siero fetale bovino | Millipore | TMS-013-B | |
| J774A.1 | ATCC | ATCC TIB-67 | |
| Lipopolisaccaridi da Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L5293-2ML | |
| Murine M-CSF | Prospec | CYT-439 | |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL) | ThermoFisher Scientific- Gibco | 15140122 | |
| Pros1 ELISA | MyBioSource | MBS2886720 | |
| RAW264.7 | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Mouse ricombinante IFNγ | Kit BioLegend | 575302 | |
| Sensimix SYBR Low-ROX | Bioline | QT625-05 | |
| Supporti permeabili Transwell | Fisher Scientific | 07-200-170 | |
| Tripsina-EDTA | ThermoFisher Scientific- Gibco | 25200056 |
Riferimenti
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