يصف هذا البروتوكول كيفيه تقليد الانتقال من الرضاعة إلى الفطام في المختبر باستخدام الماوس الاخيره الجنينية المعوية الجنين مثقف لمده 30 يوما.
في نهاية فتره الرضاعة ، تخضع العديد من أنواع الثدييات لتغيرات كبيره في ظهاره الأمعاء المرتبطة بالقدرة علي هضم الطعام الصلب. وتسمي هذه العملية الانتقال الرضاعة إلى الفطام والنتائج في استبدال ظهاره حديثي الولادة مع ظهاره الكبار التي تسير جنبا إلى جنب مع التعديلات الايضيه والمورفولوجية. هذه التغييرات التنموية المعقدة هي نتيجة لبرنامج الوراثية التي هي متاصله في الخلايا الظهاريه المعوية ولكن يمكن ، إلى حد ما ، ان تكون التضمين من قبل عوامل خارجه. ثقافة لفترات طويلة من الخلايا الظهاريه المعوية الاوليه من الفترة الجنينية المتاخره ، وتلخص الانتقال الرضاعة إلى الفطام في المختبر. هنا ، ونحن وصف بروتوكول مفصل للثقافة organoid الجنين الفئران الأكثر ملاءمة لنمذجة هذه العملية في المختبر. ونحن نقدم العديد من الاختبارات المفيدة المصممة لمراقبه تغير وظائف الأمعاء المرتبطة بانتقال الرضاعة إلى الفطام مع مرور الوقت. بالاضافه إلى ذلك ، فاننا نقدم مثالا لعامل خارجي قادر علي التاثير علي انتقال الرضاعة إلى الفطام في الجسم المجري ، كتمثيل لتحوير توقيت الانتقال من الرضاعة إلى الفطام في المختبر. ويمكن استخدام هذا النهج في المختبر لدراسة أليات الجزيئية للانتقال الرضاعة إلى الفطام ، فضلا عن المغيرين لهذه العملية. الأهم من ذلك ، فيما يتعلق بأخلاقيات الحيوانية في مجال البحوث ، واستبدال نماذج طن فيفو من قبل هذا في نموذج المختبر يساهم في صقل التجارب الحيوانية وربما إلى انخفاض في استخدام الماشية لدراسة عمليات نضوج الأمعاء.
في العديد من أنواع الثدييات ، بما في ذلك الفئران والرجال ، والأمعاء الوليد لديها العديد من الميزات التي تختلف عن ظهاره الأمعاء ناضجه تماما. هذه الميزات تسهل الخلايا المعوية حديثي الولادة لهضم وامتصاص الحليب ، والذي يحتوي علي الدهون العالية والكربوهيدرات المنخفضة ، مع اللاكتوز كالكربوهيدرات الرئيسية. الحدود فرشاه الخلايا الظهاريه المعوية حديثي الولادة التعبير عن تكسير اللاكتاز-phlorizin هيدرولاز (lct)1 لهضم اللاكتوز ديساكارد الحليب. بعد فتره الرضاعة ، تتكيف الخلايا المعوية لهضم الطعام الصلب الغني بالكربوهيدرات المعقدة والدهون المنخفضة. ويتجلى هذا من خلال التبديل في التعبير تكسير الحدود فرشاه من اللاكتاز إلى سوكريس-ايزوميتاز (Sis) و trehalase (Treh) ، والتي يمكن هضم الكربوهيدرات أكثر تعقيدا الموجودة في المواد الغذائية الصلبة2. ويرتبط التبديل الأيض آخر إلى تركيز منخفض من ارجينين في الحليب. لتوفير الحاجة إلى ارجينين, المعوية حديثي الولادة التعبير عن معدل الانزيم الحد في التخليق الحيوي ارجينين, أرجينينوسوكسيناتي synthase-1 (Ass1), إلى synthase ارجينين3. في المقابل, المعوية الكبار التعبير عن ارجيناز 2 (Arg2), انزيم قادر علي تقويض ارجينين التي وفيرة في الاطعمه الصلبة. وعلاوة علي ذلك ، فان ظهاره الأمعاء حديثي الولادة تعبر عن مستقبلات Fc الحديثة الولادة للجلوبولين المناعية (FcRn) ، والتي تتوسط امتصاص مفتش الام من الحليب في الدورة الدموية/مجري الدم4. التعبير عن FcRn ينخفض بشكل كبير خلال الانتقال الرضاعة إلى الفطام5. في الفئران ، ونضوج الخلايا paneth يحدث postnatally ، مصادفه مع تشكيل ونضوج الcrypts ، ويتميز التعبير عن الببتيدات المضادة للميكروبات يحلول (lyz) والمدافعين عن6.
كل هذه التغييرات هي جزء من انتقال الرضاعة إلى الفطام ، وهي عمليه تحدث تدريجيا بعد الولادة إلى شهر واحد من العمر في الفئران ، عندما تصل ظهاره الأمعاء إلى حالتها البالغة الناضجة. يتم تنظيم انتقال الرضاعة إلى الفطام بشكل جوهري ووضعها في أنبوب الأمعاء. عامل النسخ B اللمفاوية الناجمة عن نضوج البروتين-1 (المنطاد-1) يلعب دورا رئيسيا في هذه العملية النضج المتاصله7. ويعبر عن المنطاد-1 بشكل كبير في ظهاره حديثي الولادة ، في حين ان التعبير عنه ينخفض ويفقد خلال الانتقال الرضاعة إلى الفطام ، التالي يمكن ان تكون بمثابه علامة موثوق بها من ظهاره الأمعاء حديثي الولادة. وعلي الرغم من كونها عمليه جوهريه ، فان الانتقال من الرضاعة إلى الفطام يمكن ان يتم تضمينه بعوامل خارجيه. علي سبيل المثال ، من المعروف ان التناظرية الاصطناعية من الكورتيزول ، ديكساميثازون ، لتسريع نضوج الأمعاء في الجسم المجري8،9.
الحالية في المختبر النماذج المستخدمة لدراسة نضوج الظهاريه المعوية بما في ذلك الانتقال الرضاعة إلى الفطام, الاستفادة من خطوط الخلايا الظهاريه الكبار و/أو organoids الكبار التي تحمل خصائص ظهاره المعوية الكبار. وقد أظهرنا مؤخرا ان الخلايا الظهاريه المعوية الاوليه المعزولة عن الأمعاء الجنينية المتاخره تنضج وتلخص الانتقال من الرضاعة إلى الفطام عندما تنمو في المختبر كما organoids10. وأظهرنا كذلك ان هذه العملية نضوج الأمعاء في المختبر يحدث بنفس الوتيرة كما هو الحال في الجسم المجري. وأخيرا ، استخدمنا ديكساميثازون لتسريع عمليه النضج بنفس الطريقة الموصوفة في الدراسات المجرية .
هنا ، ونحن الخطوط العريضة لبروتوكول دقيق للعزل وثقافة الماوس الغدد المعوية الجنينية في وقت متاخر. ونحن نقدم وصفا للطريقة المفضلة لجمع العينات للثقافة العضوية المطولة وأساليب لمراقبه انتقال الرضاعة إلى الفطام في المختبر. ويمكن استخدام هذا البروتوكول للدراسات في المختبر من النضج الظهاريه المعوية والمغيرين لهذه العملية والنتائج في الانتاجيه العالية ، وزيادة الجودة والقيمة الانتقالية للبيانات والحد من استخدام الحيوانية.
يصف هذا البروتوكول زراعه الغدد المعوية الجنينية المتاخره لفترات طويلة لتقليد انتقال الرضاعة إلى الفطام في المختبر. عمليه النضوج تساوي السرعة في الجسم المجري وتكتمل بعد شهر واحد في الثقافة. تحليل المصب لهذه الثقافة باستخدام الحمض الريبي النيبالي الكمي وتقنيات البروتين مفصله.
في هذا البروتوكول ، يتم استخدام الخلايا المعوية الاوليه من أجنه الفاره E18-E20. المرحلة التنموية من خلايا الماوس الاوليه المستخدمة لتوليد العضوية لهذا البروتوكول مهم بشكل خاص. باستخدام مرحله النمو المبكر سوف يؤدي إلى توليد خزان المعوية التي تحافظ علي التعبير الجينات الجنينية المحددة علي مدي فتره طويلة من الزمن مع الانتقال المحدود إلى العضو العضوي البالغ15,16. فقط في وقت متاخر مرحله الجنين خزان قادره علي المرور العابر إلى العضو العضوي البالغ في المختبر10. لتعظيم نافذه الفرصة فيما يتعلق بتاثير العوامل الخارجة علي نضوج الأمعاء ، ينصح بالأمعاء من مرحله الجنين المتاخر وليس الأمعاء من المواليد الذين تعرضوا للميكروبات وحليب الام. ويقال ان بعض الأيض البكتيرية ومكونات الحليب يمكن ان تعمل كمعدلات لعمليه النضج17.
للحصول علي كميات كافيه من الخلايا للحفاظ علي الثقافة لمده شهر واحد لدراسة نضوج كامل من الولادة حتى سن الرشد ، في حين جمع عينات للتحليلات المصب ، يجب استخدام الأمعاء من 6-8 الاجنه كمواد البداية. ويفضل استخدام الاجنه من نفس المرحلة التنموية لتوليد الثقافة. لا ننصح بتجميع العديد من العوامل المختلفة حيث ان الاختلافات الطفيفة في مرحله النمو يمكن ان تؤثر علي التعبير عن جينات النضوج.
البروتوكول الموصوف هنا يفسر الجيل العضوي من الأمعاء الصغيرة القريبة والبعيدة للحفاظ علي الملامح التنموية لأجزاء مختلفه من الأمعاء. كبديل ، يمكن استخدام الأمعاء الكاملة للتحقيق في النضج الكلي فيما يتعلق بزيادة/نقصان التعبير عن علامات محدده. وفي الحالة الاخيره ، يمكن استخدام عدد اقل من الاجنه لعزل الخلايا المعوية لبدء الاستزراع.
تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام ثقافات organoid ثلاثية الابعاد. كما تخضع العضوية النمو الديناميكي في الثقافة ، فمن المهم لجمع عينات للتحليلات المصب في نفس الوقت بعد المرور. في هذا البروتوكول ، اخترنا يوم 3 بعد مرور ، كما انه يمثل الوقت المتوسط بين اثنين من الانشقاقات التي تحتوي علي العضوية العضوية براعم قويه والقليل إلى اي موت الخلية. يمكن استخدام نقطه زمنيه بديله بعد التمرير ، ولكن يجب ان تكون متناسقة اثناء التجربة بأكملها. نحن لا ننصح تزايد العضوية لأكثر من 7 أيام بعد مرور ، وزيادة خلايا الموت في التجويف organoids يمكن ان تؤثر علي النتائج.
في تجاربنا, وقد استخدمنا ديكساميثازون كمثال علي عامل خارجي الذي يظهر وأفضل درس في الأدب لتسريع نضوج الأمعاء في الجسم المجري9,18. ويمارس ديكساميثازون أثاره عبر الطرق الجينية وغير الجينية. علي سبيل المثال ، علي مستوي تنظيم الجينوم ، ويمكن ملاحظه زيادة مبكرة من مستويات mrna Sis . علي مستوي غير الجينوم ، نلاحظ التغييرات في نشاط الانزيمات الهضمية مثل trehalase. علي حد سواء وفقا لوصف جوانب محدده من ديكساميثازون علي تنشيط الجينات سوكريس وتاثير غير الجينوم تفعيل علي الانزيمات الحدود فرشاه الأمعاء لوحظ في الجسم المجري19. حقيقة ان العوامل خارج الجسم ، مثل السكرية الاصطناعية ، يمكن ان تعدل جوانب معينه من الانتقال الرضاعة إلى الفطام في الثقافة العضوية ، المثل لتلك التي وصفت في المجرية ، وكذلك يؤسس الفئران المعوية الجنينية الجنين كنموذج للتحقيق في نوع مختلف من المغيرين من نضوج الأمعاء.
علي الرغم من اكتمال النضج المورفولوجية من ظهاره الأمعاء البشرية في الرحم في مرحله الحمل من 22 أسبوعا ، وظيفة حاجز الأمعاء ينضج حتى الطفولة في علاقة وثيقة مع نوع من التغذية ، وتطوير الجراثيم الاستجابة المناعية. نظرا لمحدوديه توافر الانسجه البشرية في هذه المراحل التنموية ، تكمن القيمة الانتقالية لنموذج murine في المختبر في امكانيه وجود شاشات عاليه الانتاجيه من العوامل القادرة علي تحوير النضج المعوي ، وهي عمليه حفظت بين الثدييات الرضيعة.
ومن المهم ، فيما يتعلق بأخلاقيات الحيوانية في البحوث ، وهذا النموذج يمكن ان تسهم في صقل التجارب الحيوانية لأنها لا تشمل التدخلات التي أجريت علي الماشية. ويمكن زيادة خفض عدد الماشية عن طريق أعاده تصميم الاسئله البحثية إلى نقطه واحده أو نقطتين من الثقافة التي ستسمح باختبار مكونات متعددة ضمن ثقافة واحده.
The authors have nothing to disclose.
اي.
Advanced DMEM/F12 1:1 | Invitrogen | 12634-028 | |
Arginase Activity Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK112-1KT | |
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 100x |
BCA protein assay Kit | Fisher | 10741395 | |
Cell lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9803S | |
Cell Recovery Solution | Corning B.V. | 354253 | |
Cell strainer 70µM | BD/VWR | 734-0003 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
EDTA | Merck | 10,84,18,250 | EDTA Titriplex III |
EGF | Invitrogen | PMG8045 | |
Ethanol | Merck | 1,00,98,31,000 | |
Glucose solution | Sigma-Aldrich | G6918 | |
Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | 100x |
Hepes | Invitrogen | 15630-056 | 1M |
Isolate II RNA Mini Kit | Bioline | BIO-52073 | |
Lactose | Sigma-Aldrich | L3625 | a-Lactose monohydrate |
Maleic Buffer | Sigma-Aldrich | M0375 | Maleic acid |
Maltose | Sigma-Aldrich | M5885 | D-(+)-Maltose monohydrate >99% |
Matrigel | Corning B.V. | 356231 | Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix |
Millipore water | N.A. | ||
N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100x |
n-Acetylcystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Noggin-conditioned media | Homemade | ||
o-dianisidine | Sigma-Aldrich | 191248 | |
PBS | Homemade | ||
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 0,2 U/mL |
PGO-enzyme preparation | Sigma-Aldrich | P-7119-10CAP | capsules with Peroxidase/ Glucose Oxidase |
p-hydroxymercuribenzoate sodium | Sigma-Aldrich | 55540 | |
Rspondin-conditioned media | Homemade | ||
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T5251 | D-Trehalose dihydrate |
Tris-HCl Buffer | Homemade | ||
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |