Articolo metodologico

Analisi del trasporto mitocondriale e della morfologia nei neuroni derivati dalle cellule staminali indotte dall'uomo in paraplegia ereditaria

DOI:

10.3791/60548

⸱

9 febbraio 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, University of Illinois College of Medicine Rockford, 2Department of Bioengineering, University of Illinois at Chicago, 3MD Program, University of Illinois College of Medicine Rockford

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il trasporto mitocondriale alterato e la morfologia sono coinvolti in varie malattie neurodegenerative. Il protocollo presentato utilizza neuroni del prosencefalo derivati da cellule staminali pluripotenti indotte per valutare il trasporto mitocondriale e la morfologia nella paraplegia spastica ereditaria. Questo protocollo consente la caratterizzazione del traffico mitocondriale lungo gli assoni e l'analisi della loro morfologia, che faciliterà lo studio delle malattie neurodegenerative.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I neuroni hanno richieste intense di alta energia al fine di sostenere le loro funzioni. Trasporto mitocondriale alterato lungo gli assoni è stato osservato nei neuroni umani, che possono contribuire alla neurodegenerazione in vari stati di malattia. Anche se è difficile esaminare le dinamiche mitocondriali nei nervi umani vivi, tali paradigmi sono fondamentali per studiare il ruolo dei mitocondri nella neurodegenerazione. Descritto qui è un protocollo per l'analisi del trasporto mitocondriale e della morfologia mitocondriale negli assoni neuronali del prosencefalo derivati dalle cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC). Gli iPSC sono differenziati in neuroni glutamatergici telencefali utilizzando metodi consolidati. I mitocondri dei neuroni sono macchiati con MitoTracker CMXRos, e il movimento mitocondriale all'interno degli assoni viene catturato utilizzando un microscopio di imaging a cellule vive dotato di un'incubatrice per la coltura cellulare. Le immagini time-lapse vengono analizzate utilizzando un software con plugin "MultiKymograph", "Bioformat importer" e "Macros". Kymographs di trasporto mitocondriale sono generati, e la velocità mitocondriale media nelle direzioni anterograde e retrogrado è letto dal kymografo. Per quanto riguarda l'analisi morfologia mitocondriale, lunghezza mitocondriale, area, e proporzioni sono ottenuti utilizzando l'ImmagineJ. In sintesi, questo protocollo consente la caratterizzazione del traffico mitocondriale lungo gli assoni e l'analisi della loro morfologia per facilitare gli studi sulle malattie neurodegenerative.

Introduzione

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La motilità e la distribuzione mitocondriali svolgono un ruolo vitale nel soddisfare le richieste energetiche variabili e specializzate nei neuroni polarizzati. I neuroni possono estendere gli assoni estremamente lunghi per connettersi con gli obiettivi attraverso la formazione di sinapsi, che richiedono alti livelli di energia per il buffering di Ca2 o più. Il trasporto di mitocondri da soma ad assone è fondamentale per supportare la funzione assonale e sinaptica dei neuroni. Il movimento mitocondriale a livello spaziale e temporale è condotto dal trasporto assonale veloce a velocità di diversi micrometri al secondo1.

In particolare, le proteine motorie o adattatori, come la cinesina e la dineina, partecipano al trasporto rapido di orgelli lungo i microtubuli per controllare il movimento dei mitocondri2,3. L'attività neuronale normale richiede un corretto trasporto dei mitocondri appena assemblati dal soma neuronale all'assone distale (trasporto assonale anterogrado) e il trasporto inverso dei mitocondri dall'assone distale al corpo cellulare (trasporto retrogrado). Recenti studi hanno indicato che l'allocazione mitocondriale impropria è fortemente associata a difetti neuronali e malattie degenerative del motoneurone4,5. Pertanto, per sezionare il ruolo dei mitocondri nella neurodegenerazione, è importante stabilire metodi per esaminare il movimento mitocondriale lungo gli assoni nelle culture vive.

Ci sono due sfide principali nell'esaminare e analizzare il tracciamento dei mitocondri: (1) identificare i mitocondri dallo sfondo in ogni fotogramma e (2) analizzare e generare le connessioni tra ogni fotogramma. Nel risolvere la prima sfida, un approccio di etichettatura a fluorescenza è ampiamente usato per distinguere i mitocondri dallo sfondo, come la tintura MitoTracker o la trasfezione di proteine bersaglio mitocondriali fusa di fluorescenza (ad esempio, mito-GFP)6,7,8. Per analizzare l'associazione tra i frame, diversi algoritmi e strumenti software sono stati descritti negli studi precedenti9. In un recente articolo, i ricercatori hanno confrontato quattro diversi strumenti automatizzati (ad esempio, Volocity, Imaris, wrMTrck e Difference Tracker) per quantificare il trasporto mitocondriale. I risultati hanno mostrato che, nonostante le discrepanze nella lunghezza della pista, nello spostamento mitocondriale, nella durata del movimento e nella velocità, questi strumenti automatizzati sono adatti per valutare la differenza di trasporto dopo il trattamento10. Oltre a questi strumenti, un plugin integrato "Macros" per ImageJ (scritto da Rietdorf e Seitz) è stato ampiamente utilizzato per l'analisi del trasporto mitocondriale11. Questo metodo genera kymografi che possono essere utilizzati per analizzare il movimento mitocondriale, compresa la velocità sia in direzione anterograda che retrogrado.

I mitocondri sono organelli altamente dinamici che cambiano costantemente in numero e morfologia in risposta sia a condizioni fisiologiche che patologiche. La fissione mitocondriale e la fusione regolano strettamente la morfologia mitocondriale e l'omeostasi. Lo squilibrio tra fissione mitocondriale e fusione può indurre reti mitocondriali estremamente brevi o lunghe, che possono alterare la funzione mitocondriale e provocare attività neuronali anormali e neurodegenerazione. Il trasporto mitocondriale alterato e la morfologia sono coinvolti in varie malattie neurodegenerative, come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la malattia di Huntington e la paraplegia spastica ereditaria (HSP)12,13,14,15. HSP è un gruppo eterogeneo di disturbi neurologici ereditari caratterizzati dalla degenerazione del tratto corticospinale e dalla conseguente incapacità di controllare i muscoli degli arti inferiori16,17. In questo studio, i neuroni del prosencefalo derivati da iPSC vengono utilizzati per valutare il trasporto mitocondriale e la morfologia nell'HSP. Questo metodo fornisce un paradigma unico per esaminare le dinamiche mitocondriali degli assoni neuronali nelle culture vive.

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Protocollo

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1. Generazione di neuroni glutamatergici telencefali da iPSC

NOTA: Il protocollo dettagliato per il mantenimento degli iPSC e la loro differenziazione nei neuroni glutamatergici telencefali sono simili a quelli descritti in precedenza18. In questo caso, il processo critico durante la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane viene introdotto ed evidenziato.

  1. Coltura iPSCs su alimentatori fibroblasti embrionali murini (MEF) in cellule staminali embrionali umane (hESC) con integrazione con fattore di crescita del fibroblasto (bFGF, 4 ng/mL).
  2. Dopo l'incubazione con dispase (1 mg/mL) per 3 min, dissociare gli iPSC in piccoli grumi. Quindi, la coltura l'iPSC aggrega in sospensione nel supporto hESC per 4 giorni. Fare riferimento a questo punto di riferimento, quando gli iPSC iniziano come coltura di sospensione, come giorno 1 (D1). Cambiare il mezzo giornaliero per 4 giorni.
  3. A D5, raccogliere gli aggregati iPSC dopo la centrifugazione a 200 x g per 2 min e la coltura in mezzi di induzione neurale (NIM) per 3 giorni. Coltura della cella aggrega in sospensione per 3 giorni cambiando metà dei media ogni 2 giorni. Aggiungere DMH-1 (2 m) e SB431542 (2 m) al mezzo NIM per aumentare l'efficienza di induzione neurale.
  4. A D8, raccogliere gli aggregati iPSC dopo la centrifugazione a 200 x g per 2 min e lasciarli aderire a 6 piastre di pozzo (circa 20-30 aggregati per pozzo del pozzo) culcolando in NIM con 10% FBS (o con piastre rivestite di laminaina) durante la notte. Il giorno successivo, rimuovere il vecchio supporto e passare a NIM ogni 2 giorni fino a D17.
    NOTA: La generazione di cellule neuroepiteliali, che è indicata dalla formazione di cellule colonnari con strutture di rosette, è osservata in questo periodo.
  5. A D17, isolare meccanicamente le cellule neuroepiteliali al centro delle colonie (sollevandosi direttamente applicando una piccola pressione al centro delle colonie) o enzimaticamente (trattata con dispase). Trasferire le cellule neuroepiteliali isolate in fiaschetta T25 con una coltura di 8 mL di NIM con aggiunta di B27 (1x), cAMP (1 m) e IGF (10 ng/mL).
    NOTA: La coltura delle sospensioni consente alle cellule di formare neurosfere arricchite con progenitori neurali di proiezione corticale.
  6. Dopo D35, piastra le neurosfere sulla poliorite e LDEV-free ridotto matrice della membrana seminterrato fattore di crescita (Tabella dei materiali)-rivestito 35 mm piatti di fondo in vetro per generare neuroni glutamanogici telencefali (neuroni di proiezione corticale). Prima della placcatura, dissociare le neurosfere in piccoli ammassi incubando con 1 soluzione di distacco cellulare mg/mL per 2 min a 37 gradi centigradi.
  7. Rimuovere la soluzione di distacco cellulare con centricazione e resospensione in 1 mL di mezzo di differenziazione neurale (NDM). Piatto di cellule sul piatto inferiore di vetro (circa cinque grappoli in 100 - L di media per piatto) per farli attaccare. Quindi, aggiungere NDM (1 mL per piatto) e la coltura delle cellule in NDM contenente B27 (1x), cAMP (1 -M), IGF (10 ng/mL), hBDNF (10 ng/mL) e GDNF (10 ng/mL).
    NOTA: Piccoli ammassi sono placcati perché sopravvivono bene e danno origine a lunghi neuroni di proiezione. In alternativa, le cellule possono essere dissociate e placcate ad una densità di circa 20.000 cellule per piatto per una migliore separazione.
  8. Caratterizzare i neuroni glutamanogici telencefali sfruttando i marcatori Tbr1 e tubulina.

2. Esame del trasporto mitocondriale lungo gli assoni di neuroni glutamatergici telencefali

  1. Riscaldare il NDM e accendere l'incubatrice per il microscopio a fluorescenza fissato a 37 e 5% di CO2.
  2. Per visualizzare i mitocondri lungo gli assoni dei neuroni prosencefalo, incubare i neuroni con 50 nN colorante fluorescente rosso per macchiare i mitocondri nelle cellule vive (ad esempio, MitoTracker CMXRos) in NDM per 3 min a 37 gradi centigradi. Successivamente, lavare le celle 2x con NDM riscaldato. I neuroni sono incubati in NDM.
  3. Per registrare il trasporto mitocondriale lungo gli assoni, scattare immagini time-lapse del movimento mitocondriale utilizzando l'obiettivo 40x con un microscopio a fluorescenza.
    NOTA: Per stabilizzare la coltura, eseguire l'imaging delle cellule vive quando le cellule vengono incubate nell'incubatrice per 20 min a seguito di colorazione mitocondriale.
  4. Sotto il campo di fase, identificare gli assoni in base alle caratteristiche morfologiche (emergono direttamente dal corpo cellulare neuronale, costanti neuriti lunghi sottili senza ramificazione). I mitocondri si muovono in direzioni anterogrado (dal corpo cellulare all'assone distale) e retrogrado (dal terminale assonale al corpo cellulare). Per distinguere la direzione del movimento mitocondriale lungo gli assoni, identificare chiaramente i corpi cellulari dei neuroni. In questo passaggio, mettere a fuoco gli assoni sotto il campo di fase per ridurre il fotosbiancamento.
  5. Dopo aver distinto il corpo cellulare e l'assone, regolare il tempo di esposizione e la messa a fuoco dei mitocondri negli assoni. Quindi, catturare il trasporto di mitocondri all'interno di assoni ogni 5 s per una durata totale di 5 min, producendo 60 fotogrammi. Cattura in modo casuale almeno cinque posizioni per ogni piatto e ripeti 3 volte per ogni gruppo.

3. Analisi dei dati del trasporto mitocondriale e morfologia nei neuroni corticali

NOTA: analizzare i dati raccolti sul trasporto mitocondriale utilizzando un software di analisi delle immagini (ad esempio ImageJ o MetaMorph19). Poiché ImageJ è prontamente disponibile, eseguire l'analisi del trasporto mitocondriale e morfologia utilizzando ImageJ con il MultiKymograph, Macros, e Analizzare le particelle plugin.

  1. Analisi del trasporto mitocondriale tramite ImageJAnalyzing mitocondrial transport using ImageJ
    1. Dopo aver catturato le immagini time-lapse della motilità mitocondriale, analizzare la velocità e il movimento dei mitocondri utilizzando il plugin MultiKymograph. Le immagini vengono salvate come file in formato .tiff, che vengono analizzati dal software Fiji seguendo un metodo precedentemente riportato20.
    2. Scarica il software Fiji. Scarica i plugin che saranno necessari per analizzare la velocità di movimento mitocondriale dai kymographs. Scaricare il pacchetto Bio-formati e Kymograph Plugin insieme a questi quattro plugin .class, tra cui: MultipleKymograph.class, MultipleOverlay.class, StackDifference.class e WalkingAverage.class (Tabella dei materiali). Spostare questi file nella cartella dei plugin Fiji. Scaricare i plug-in "tsp050706.txt" nella cartella plugins. Riavviare il software Fiji quando i file vengono spostati nella cartella plugins.
    3. Apri il software Fiji. Scegli plugin, quindi importa le immagini della serie .tiff tramite Bio-Formats Importer in Bio-Formats. Assicurarsi di scegliere Immagine standardJ in Visualizzazione pila, scegliere Apri tutte le serie, selezionare Scala automatica, quindi fare clic su OK. Prendere nota del numero di fotogramma e delle dimensioni delle immagini in pixel, che vengono visualizzate nella parte superiore dell'immagine.
      NOTA: prendi 60 fotogrammi per immagine.
    4. È consigliabile rendere le immagini più chiare regolando la luminosità/contrasto nel menu Immagine per tutti i 60 fotogrammi.
    5. Fare clic con il pulsante destro del mouse sullo strumento linea per scegliere la linea segmentata e disegnare una linea segmentata a partire dal corpo della cella e terminando in corrispondenza dell'assone terminale. Generare il kymograph scegliendo MultipleKymograph in Plugins. La selezione della larghezza della linea viene richiesta dopo aver scelto il multipleKymograph. Assicurarsi che si tratti di un numero dispari. Scegliere 1 per lo spessore della linea. Un kymografo viene generato dopo questo passaggio.
      NOTA: Diverse informazioni importanti possono essere lette dal kymograph. L'asse y del kymografo è il tempo di durata (5 min) per i 60 fotogrammi. L'asse x rappresenta la posizione degli assoni selezionati.
    6. Utilizzare una linea diagonale nel kymografo per determinare la direzione di movimento dei mitocondri (anterograda, retrogrado o stabile). Ad esempio, una linea che scende a destra lungo l'asse y indica il movimento anterogrado, mentre una linea che scende verso sinistra lungo l'asse y indica il movimento retrogrado. Una linea verticale indica che non c'era alcun movimento nel mitocondrio.
    7. Misurare la distanza, i valori di tempo e la velocità per i mitocondri in movimento utilizzando il plugin Macro nel software Fiji. Vai a Plugins Macros Proprietà Install . tsp050607.txt. Disegnare una linea segmentata sulla traccia del movimento mitocondriale sul kymograph e disegnare sempre la linea dalla regione superiore a quella inferiore (asse y).
    8. Dopo aver disegnato la linea, vai a Plugins . Macros velocità di lettura da tsp. Poiché viene disegnata una linea segmentata lungo la traccia, il plugin legge le velocità segmentate corrispondenti alla linea.
      NOTA: l'unità per tutti i dati è pixel. somma dy è il tempo consumato dal punto iniziale, e dx somma indica la distanza del mitocondrio in movimento nell'asse x. dy now e dx ora mostra il tempo del periodo e la distanza di movimento per ogni segmento, rispettivamente. velocità effettiva mostra la velocità per ogni segmento (dx ora / dy ora). la velocità media indica la velocità media per il movimento mitocondriale (somma dx/dy).
    9. Modificare l'unità di dx ora da pixel a m come rapporto di pixel in m misurando la barra della scala. Convertire l'unità per la distanza da pixel a m misurando le barre della scala nelle immagini. Utilizzare lo strumento linea per disegnare una linea lungo la barra della scala e misurare la lunghezza della linea scegliendo Misura' in "Analizza. Modifica il tempo da pixel a secondi, come 1 pixel e 5 secondi in questo esperimento.
    10. Nel file del foglio di calcolo, calcolare la velocità media e il movimento di retrogrado o anterogrado dell'etichetta corrispondente. Calcolare la media della velocità di movimento anterogrado o retrogrado.
    11. Determinare la percentuale di mitocondri stazionari e motile dal kymograph. I mitocondri in movimento anterogrado o retrogrado sono definiti come in movimento di 5 m in avanti o indietro rispetto all'origine durante l'intero periodo21. I mitocondri sono considerati stazionari se non si sono mossi più di 5 m durante i 5 min.
  2. Analisi della morfologia mitocondriale utilizzando ImageJ
    NOTA: determinare la morfologia mitocondriale misurando la lunghezza mitocondriale, l'area e le proporzioni utilizzando ImageJ. A tale scopo, attenersi alla seguente procedura.
    1. Per analizzare la lunghezza mitocondriale e l'area all'interno degli assoni, scaricare il plug-in Straighten_.jar dal sito ImageJ (vedere Tabella dei materiali)e spostarlo nella cartella dei plugin. Riavviare il software ImageJ.
    2. Aprire l'immagine tramite la funzione open in File e convertire l'immagine a 32 bit in 8 bit utilizzando Tipo in Immagine.
    3. Disegnare una linea segmentata lungo gli assoni. Scegliere Raddrizza in Plugin e impostare 50 pixel per Larghezza linea di filamento/linea larga. Questo genererà un assone raddrizzato.
    4. Regolare la soglia sotto Immagine e impostare la misura in Analizza scegliendo "Area Proprietà Perimetro di proprietà . Adatta l'ellisse Descrittori di forma.
    5. Misurare la barra della scala utilizzando la funzione linea e impostare la scala in Analizza riempiendo la distanza in pixel, conoscerela distanza e l'unità di lunghezza. Quindi, scegliere Globale per impostare questa impostazione di scala.
    6. Utilizzare Analizza particelle in Analizza per determinare l'area. I parametri di prompt sono size (pixel -2) : 0,20–infinity, circularity - 0,00–1,00, e mostrano i puntini di sospensione. Scegliere Visualizza risultati.
      NOTA: La misurazione produrrà i risultati di più parametri di morfologia mitocondriale, tra cui area, perimetri, lunghezza (maggiore), larghezza (minore) e proporzioni (AR). Viene elencato anche il numero mitocondriale corrispondente.
    7. Calcolare il numero mitocondriale per assonale utilizzando il numero mitocondriale diviso per la lunghezza assonale.

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Risultati

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In questo caso, gli iPSC umani sono stati differenziati in neuroni glutamanogici telencefali, che sono stati caratterizzati dall'immunostaining con i marcatori di tubulina Tbr1 e .III (Figura 1A). Per esaminare il trasporto assonale dei mitocondri, queste cellule sono state macchiate di colorante fluorescente rosso ed è stata eseguita l'imaging time-lapse. Dal momento che ImageJ è prontamente disponibile e più facile da ottenere, il trasporto mitocondriale è stato ulteriorme...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo descrive un metodo per analizzare il trasporto mitocondriale e la morfologia negli assoni neuronali utilizzando il tinrito fluorescente rosso e il software ImageJ, entrambi che forniscono una piattaforma unica per studiare la degenerazione assonale e la morfologia mitocondriale nella malattia neurodegenerativa. Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo, tra cui la colorazione dei mitocondri, l'imaging delle cellule vive e l'analisi delle immagini. In questo metodo, un coloranti fluorescente è stato ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Spastic Paraplegia, dalla Blazer Foundation e dal NIH (R21NS109837).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione per il distacco cellulare AccutaseTecnologie cellulari innovativeAT104
Cappa di biosicurezzaThermo Scientific1300 SERIE A2
Albumina sierica bovina (BSA)SigmaA-7906
Fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF)Peprotech450-02
CentrifugaThermo ScientificSorvall Legend X1R/
Vetrini coprioggettiChemiglass Life Sciences1760-012
AMP ciclico (cAMP)Sigma-AldrichD0627
DispaseGibco17105-041
DorsomorfinaSelleckchemS7146
Eagle medium modificato di Dulbecco con miscela di nutrienti F12 (DMEM/F12)Corning10-092-CV
FBSGibco16141-002
Fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2, bFGF)Peprotech100-18B
Geltrex LDEV-Free Fattore di crescita ridotto Matrice della membrana basaleGibcoA1413201
Gem21 NeuroPlex Integratore senza sieroGemini400-160
Piatti con fondo in vetroMatTekP35G-0.170-14-C
Pipette in vetro da 9''VWR14673-043
Fattore neurotrofico derivato gliale (BDNF)Sigma-AldrichD0627
GlutaMAX-IGibco35050-061
EparinaSigmaH3149
Fattore di crescita dell'insulina 1 (IGF1)InvitrogenM7512
Knockout Serum ReplacerGibcoA31815
LamininSigmaL-6274
2-MercaptoetanoloSigmaM3148-100ML
MitoTracker CMXRosInvitrogenM7512
Medium neurobasaleGibco21103-049
Aminoacidi non essenzialiGibco11140-050
N2 Senza siero NeuroPle SupplementoGemini400-163
Microscopio Olympus IX83OlympusIX83-ZDC2
PBSCorning21-031-CV
Microscopio a contrasto di faseOlympusCKX41/ IX2-SLP
Piastre a 6 pozzettiCorning353046
Piastre a 24 pozzettiCorning353047
Po-L-ornitina bromidrato (poliornitina))Sigma-AldrichP3655
SB431542Stemgent04-0010
Sistema di filtrazione sottovuoto monouso sterile da 50 ml 0,22 μ m Millipore Express® Plus MembranaMilliporeSCGP00525
Stericup 500/1000 ml Durapore 0,22 μ M PVDFMilliporeSCGVU10RE
Anticorpo Tbr1 (1:2000)ChemiconAB9616
Inibitore della tripsinaGibco17075029
Tubi da 50 mlPhenixSS-PH50R
Tubi da 15 mlPhenixSS-PH15R
T25 palloni (non trattati)VWR10861-572
Plugin per software
Bio-formats Packagehttp://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/
Fiji softwarehttps://fiji.sc/
Kymograph Pluginhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleKymograph.class<a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleOverlay.class<a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
WalkingAverage.class<a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
StackDifference.class<a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
Straighten_.jarhttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html
tsp050706.txthttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
75004261

Riferimenti

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