Screening per inibitori di Pirofosofasi rilegati a Thermotoga

Keni Vidilaseris; Niklas G. Johansson; Ainoleena Turku; Alexandros Kiriazis; Gustav Boije af Gennäs; Jari Yli-Kauhaluoma; Henri Xhaard; Adrian Goldman

doi:10.3791/60619

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Articolo metodologico

Screening per inibitori di Pirofosofasi rilegati a Thermotoga

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DOI:

10.3791/60619

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23 novembre 2019

Keni Vidilaseris^*¹ , Niklas G. Johansson^*² , Ainoleena Turku² , Alexandros Kiriazis² , Gustav Boije af Gennäs² , Jari Yli-Kauhaluoma² , Henri Xhaard² , Adrian Goldman¹^,³

¹Research Program in Molecular and Integrative Biosciences, University of Helsinki, ²Drug Research Program, Division of Pharmaceutical Chemistry and Technology, Faculty of Pharmacy, University of Helsinki, ³School of Biomedical Sciences and Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un metodo di screening per gli inibitori di pyrophosphatase legati alla membrana (da Thermotoga maritima) basato sulla reazione blu molybdenum in un formato 96 pozzo piastra.

Abstract

I piifofosti legati alla membrana (mPPases) sono enzimi dimerici che si verificano nei batteri, negli arcai, nelle piante e nei parassiti protisti. Queste proteine si sciolgono il pirofosfato in due molecole di ortopofosde, che è accoppiato con protone e/o ione di sodio che pompa attraverso la membrana. Poiché non si verificano proteine omologhe negli animali e negli esseri umani, gli mPPasi e sono buoni candidati nella progettazione di potenziali bersagli farmacologici. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per lo screening per gli inibitori mPPase utilizzando la reazione blu molybdenum in un sistema di piastra 96. Usiamo mPPase dal batterio termofilo Thermotoga maritima (TmPPase) come enzima modello. Questo protocollo è semplice ed economico, producendo un risultato coerente e robusto. Ci vuole solo circa un'ora per completare il protocollo di analisi dell'attività dall'inizio del saggio fino alla misurazione dell'assorbimento. Poiché il colore blu prodotto in questo saggio è stabile per un lungo periodo di tempo, il saggio successivo può essere eseguito immediatamente dopo il lotto precedente e l'assorbimento può essere misurato in un secondo momento per tutti i lotti contemporaneamente. Lo svantaggio di questo protocollo è che è fatto manualmente e quindi può essere estenuante così come richiedono buone abilità di pipettaggio e di mantenimento del tempo. Inoltre, la soluzione arsenite-citrate utilizzata in questo saggio contiene arsenite di sodio, che è tossico e deve essere maneggiato con le precauzioni necessarie.

Introduzione

Circa il 25% del totale delle proteine cellulari sono proteine di membrana e circa il 60% di esse sono bersagli farmacologici¹^,². Uno dei potenziali bersagli farmacologici³, pirofofosasi legati alla membrana (mPPases), sono enzimi dimero che pompano protone e/o ione di sodio attraverso la membrana da idrolisi di piofosfato in due ortoposfati⁴. mPPases può essere trovato in vari organismi⁵ come batteri, archea, piante e parassiti protisti, con l'eccezione di esseri umani e animali⁴. Nei parassiti protisti, per esempi....