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Articolo metodologico

Screening per inibitori di Pirofosofasi rilegati a Thermotoga

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DOI:

10.3791/60619

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23 novembre 2019

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1Research Program in Molecular and Integrative Biosciences, University of Helsinki, 2Drug Research Program, Division of Pharmaceutical Chemistry and Technology, Faculty of Pharmacy, University of Helsinki, 3School of Biomedical Sciences and Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un metodo di screening per gli inibitori di pyrophosphatase legati alla membrana (da Thermotoga maritima) basato sulla reazione blu molybdenum in un formato 96 pozzo piastra.

Abstract

I piifofosti legati alla membrana (mPPases) sono enzimi dimerici che si verificano nei batteri, negli arcai, nelle piante e nei parassiti protisti. Queste proteine si sciolgono il pirofosfato in due molecole di ortopofosde, che è accoppiato con protone e/o ione di sodio che pompa attraverso la membrana. Poiché non si verificano proteine omologhe negli animali e negli esseri umani, gli mPPasi e sono buoni candidati nella progettazione di potenziali bersagli farmacologici. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per lo screening per gli inibitori mPPase utilizzando la reazione blu molybdenum in un sistema di piastra 96. Usiamo mPPase dal batterio termofilo Thermotoga maritima (TmPPase) come enzima modello. Questo protocollo è semplice ed economico, producendo un risultato coerente e robusto. Ci vuole solo circa un'ora per completare il protocollo di analisi dell'attività dall'inizio del saggio fino alla misurazione dell'assorbimento. Poiché il colore blu prodotto in questo saggio è stabile per un lungo periodo di tempo, il saggio successivo può essere eseguito immediatamente dopo il lotto precedente e l'assorbimento può essere misurato in un secondo momento per tutti i lotti contemporaneamente. Lo svantaggio di questo protocollo è che è fatto manualmente e quindi può essere estenuante così come richiedono buone abilità di pipettaggio e di mantenimento del tempo. Inoltre, la soluzione arsenite-citrate utilizzata in questo saggio contiene arsenite di sodio, che è tossico e deve essere maneggiato con le precauzioni necessarie.

Introduzione

Circa il 25% del totale delle proteine cellulari sono proteine di membrana e circa il 60% di esse sono bersagli farmacologici1,2. Uno dei potenziali bersagli farmacologici3, pirofofosasi legati alla membrana (mPPases), sono enzimi dimero che pompano protone e/o ione di sodio attraverso la membrana da idrolisi di piofosfato in due ortoposfati4. mPPases può essere trovato in vari organismi5 come batteri, archea, piante e parassiti protisti, con l'eccezione di esseri umani e animali4. Nei parassiti protisti, per esempio Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii e Trypanosoma brucei, mPPases sono essenziali per la virulenza del parassita6 e knockout di questa espressione nei parassiti portano al fallimento nel mantenimento del pH intracellulare dopo l'esposizione al pH di base esterno7. A causa della loro importanza e della mancanza di proteine omologhe presenti nei vertebrati, mPPases può essere considerato come potenziali bersagli farmacologici per le malattie protische3.

Lo screening in vitro degli inibitori di mPPase in questo lavoro si basa su un sistema modello TmPPase. TmPPase è un mPPasi dipendente dagli ioni di sodio e ioscio da T. maritima e ha la sua attività ottimale a 71 gradi centigradi8. I benefici di questo enzima sono ad esempio la sua facilità di produzione e purificazione, una buona stabilità termica e un'elevata attività specifica. TmPPase mostra sia un'elevata somiglianza oltre alla completa conservazione della posizione, sia l'identità di tutti i residui catalitici al protista mPPases3,9 e la struttura risolta di Vigna radiata10 mPPase. Le strutture disponibili di TmPPase in diverse conformazioni sono utili anche per l'esperimento di progettazione di farmaci basati sulla struttura (come screening virtuale e progettazione de novo).

Qui segnaliamo un protocollo dettagliato per lo screening degli inibitori di TmPPase in un formato 96 ben piatto (Figura 1). Il protocollo si basa sul metodo colorimetrico della reazione blu molybdenum, che è stato sviluppato per la prima volta da Fiske e Subbarow11. Questo metodo comporta la formazione di 12-ciclomolistici da ortopofosfato e molybdate in condizioni acide, che viene poi ridotto per dare caratteristiche specie di fosfomilybdenum di colore blu12.

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Protocollo

1. Preparazione delle proteine

NOTA: l'espressione e la purificazione di TmPPase è stata descritta altrove13.

  1. Preparare 10 mL della soluzione di buffer di riattivazione contenente 20 mM 2-(N-morpholino)ethanesulfonico acid (MES) pH 6.5, 3,5% (v/v) glicerol, 2 mM dithiothreitol (DTT) e 0,05% dodecyl maltoside (DDM).
  2. Preparare 10 mL della miscela di reazione contenente 200 mM Tris-Cl pH 8.0, 8,0 mM MgCl2, 333 mM KCl e 67 mM NaCl.
    NOTA: È necessario che il mg2 per masticare il pirofafato, poiché il substrato di mPPase, Kè necessario per aumentare l'attività degli enzimi poiché TmPPase è un mPPase dipendente dal potassio, e Naè necessaria per l'attività enzimatica durante la traslocazione di ioni di sodio da parte di TmPPase.
  3. Preparare 30 liposomi mg/mL per la riattivazione degli enzimi.
    1. Aggiungere 10 mL di 20 mM Tris-HCl pH 8.0 con 1 mM DTT a 0,3 g di L-z-phosphatidylcolina da soia a 10 mL di 20 mM Tris-HCl pH 8.0 con 1 mM-DTT.
    2. Mettere il liposoma sul ghiaccio e sonicare con intervallo di impulso di 1 secondo per 1 minuto, mettere in pausa per 1 minuto e ripetere fino a quando la soluzione diventa giallo trasparente.
    3. Aliquota i liposomi, congelare in azoto liquido e conservare a -80 gradi centigradi fino a quando non viene utilizzato.
  4. Riattivare l'enzima.
    1. Mescolare 40 l della soluzione liposomi con 22,5 litri di 20% DDM.
    2. Riscaldare il composto a 55 gradi centigradi per 15 minuti e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente.
    3. Aggiungere 36,5 l della soluzione tampone di riattivazione, mescolare e aggiungere 1 l di proteine concentrate (13 mg/mL) per ottenere una concentrazione totale di 0,13 mg/mL.
      NOTA: Le proteine sono solitamente congelate in 10 gradiNI dopo la purificazione e scongelate sul ghiaccio prima dell'uso.
  5. Prendere 20 l dell'enzima riattivato e aggiungere a 1.480 l della miscela di reazione, quindi mescolare delicatamente.
    NOTA: L'aggiunta dell'enzima riattivato alla miscela di reazione deve essere eseguita appena prima che venga utilizzata.

2. Preparazione composta

  1. Sciogliere i composti in zolfo dimetilo (DMSO) per fare soluzioni di magazzino di 25-100 mM in 50-200 l, in base alla disponibilità dei composti.
    NOTA: tutti i composti utilizzati qui (Figura 2A) sono stati pubblicati in precedenza9. Se la solubilità composto è bassa, la concentrazione di stock può essere regolata di conseguenza.
  2. Preparare tre diverse concentrazioni di ogni composto in acqua.
    NOTA: Le concentrazioni finali nella miscela di reazione saranno rispettivamente 1, 5 e 50 micromolar o 1, 5 e 20 micromolar per composti solubili e sobri, solubili.
    1. Diluislo la soluzione di riserva con acqua a 1 mL in microtubi per dare 2 M, 10 M e 100 M per composti solubili, o in alternativa 2 M, 10 M e 40 M per composti spietatamente solubili.
    2. Vorticare la soluzione composta istantaneamente dopo la diluizione della soluzione di riserva per una corretta miscelazione.
  3. Verificare l'aggregazione composta utilizzando un nephelometro.
    NOTA: Questo è stato studiato come triplicati in tre concentrazioni (1 M, 5 M e 20 M) e normalizzato nello spazio vuoto in un pozzo 96.
    1. Distribuisci 75 -L della miscela di reazione in ogni pozzo utilizzando una pipetta multicanale.
    2. Aggiungere 75 l di ogni composto (per lo spazio vuoto, utilizzare invece 75 l'acqua) e mescolare convogliando su e giù per 5o.
    3. Misurare ogni pozzo a 300 V utilizzando un nephelometro a microplacca.

3. Reagenti per la preparazione del saggio

  1. Preparare la soluzione arsenite-citrate.
    1. Pesare 5 g di arsenite di sodio e 5 g di diidrato trisofato.
      AVVISO: L'arsenite di sodio è tossica, quindi utilizzare attrezzature protettive adeguate e maneggiare con particolare cura. Per precauzione, non maneggiare prima che tutte le precauzioni di sicurezza necessarie siano state lette e comprese. Maneggiare solo in un cofano di fumi per non inalare polvere/vapori del composto o delle sue soluzioni. Se inalato, passare all'aria aperta e ottenere cure mediche. Indossare occhiali di sicurezza chimica, guanti protettivi e indumenti appropriati per evitare l'ingestione e il contatto con gli occhi e la pelle. Se ingerito, chiamare immediatamente un centro antiveleni o un medico/medico. Se arriva sulla pelle o negli occhi, lavare con molta acqua e ottenere cure mediche.
    2. Sciogliere in 100 mL di acqua.
    3. Aggiungere 5 mL di acido acetico glaciale, mescolare e aggiungere acqua a 250 mL.
    4. Conservare a temperatura ambiente protetto dalla luce.
      NOTA: La soluzione è stabile per più di un anno.
  2. Preparare la soluzione A e la soluzione B.
    1. Per la soluzione A, aggiungere 10 mL di ghiaccio freddo 0,5 M HCl a 0,3 g di acido ascorbico. Sciogliere l'acido ascorbico vortice.
    2. Per la soluzione B, aggiungere 1 mL di acqua fredda di ghiaccio a 70 mg di tetraidratte e vortice di ammonio eptamolybdate per sciogliere.
      NOTA: Conservare entrambe le soluzioni su ghiaccio fino all'uso. Per la consistenza del risultato del saggio, entrambe le soluzioni possono essere conservate sul ghiaccio per un massimo di una settimana.
  3. Preparare lo standard fosfato (Pi)con la concentrazione di 0 M, 62,5 M, 250 M e 500 M per la calibrazione.
    1. Aggiungete 0 , 25 l, 50 l, e 100 ll di 5 mM Na2HPO4 disiscaricano a quattro microtubi contenenti 370 l della miscela di reazione.
    2. Top fino a 1 mL con acqua.

4. Anale di attività per una piastra da 96 pozzetto

NOTA: vedere la figura 1 per il flusso di lavoro schematico del saggio.

  1. Aggiungere 1 mL di soluzione B a 10 mL della soluzione A, mescolare vortice e conservare la soluzione sul ghiaccio.
    NOTA: questa soluzione deve essere trasparente e gialla. Mantenere la soluzione A e B sul ghiaccio per almeno 30 minuti prima dell'uso. Tuttavia, utilizzare la soluzione entro 3 h in quanto andrà male dopo l'archiviazione a lungo termine.
  2. Aggiungete alle strisce dei tubi in triplice le strisce in triplice copia utilizzando una pipetta multicanale.
    NOTA: La miscela di reazione senza Pi aggiunto verrà utilizzata come vuoto.
  3. Aggiungere 25 - L di soluzione composta alle strisce del tubo utilizzando una pipetta multicanale.
    NOTA: Ogni composto ha tre diverse concentrazioni in triplice copia, il che è sufficiente per la stima iniziale della concentrazione inibitoria massima (IC50). Per una determinazione più accurata di IC50, è possibile utilizzare otto diverse concentrazioni composte. Per l'enzima disinibito la soluzione composta viene sostituita con la stessa quantità di acqua. Come controlli positivi 2,5 M, 25 M, e 250 M di imidodiphosfato (IDP) sale sono stati utilizzati.
  4. Aggiungere 15 l-L di miscela di soluzione mPPase alle strisce del tubo (ad eccezione dei tubi contenenti Pi standard) utilizzando una pipetta multicanale.
  5. Sigillare le strisce del tubo con un foglio di sigillazione adesiva. Tagliare il foglio di saltellaggio per separare ogni striscia del tubo.
  6. Pre-incubare i campioni per 5 min a 71 gradi centigradi. Posizionare i campioni sul blocco di riscaldamento con intervallo di 20 s tra ogni striscia al fine di ridurre al minimo il consumo di tempo durante le fasi successive.
  7. Per ogni striscia, aprire la guarizione adesiva. Aggiungete 10 l of 2 mM di pirofosfato di sodio utilizzando una pipetta multicanale e mescolate con pipistrato su e giù per 5o. Sigillare nuovamente la striscia del tubo utilizzando la stessa guaritura.
    NOTA: questo passaggio potrebbe essere inizialmente difficile da eseguire in 20 s; tuttavia, diventerà più facile dopo alcuni saggi.
  8. Incubare a 71 gradi centigradi per 5 min.
  9. Posizionare i campioni sull'apparato di raffreddamento con un intervallo di 20 s tra ogni striscia. Lasciarli raffreddare per 10 min ma centrificare ogni striscia brevemente dopo 5 min di raffreddamento, per decantare le gocce d'acqua sotto il foglio di tenuta, quindi rimetterlo all'apparato di raffreddamento e rimuovere la tenuta.
    NOTA: L'apparato di raffreddamento può essere semplicemente realizzato posizionando una piastra PCR da 96 pozzetti su una piastra Petri in polistirolo (dimensioni 150 mm x 15 mm) riempita con acqua e congelata per almeno 1 ora. L'apparecchio deve essere estratto dal congelatore circa 5 minuti prima dell'inizio del saggio. Non estrarre l'apparato di raffreddamento subito prima del raffreddamento del campione in quanto congela la miscela di reazione e ostacola lo sviluppo del colore.
  10. Dopo 10 min di raffreddamento, aggiungere 60 -L di soluzione A e B, mescolare convogliando su e giù per 5 o più e mantenere le strisce del tubo sull'apparato di raffreddamento per 10 min.
  11. Aggiungere 90 l l della soluzione arsenite-citrate e mantenere a temperatura ambiente per almeno 30 min per produrre un colore blu stabile.
    AVVISO: A causa della sua tossicità tutte le soluzioni contenenti arsenite al sodio devono essere gestite con particolare attenzione in ogni momento. Pertanto, l'aggiunta di soluzione arsenite-citrato dovrebbe essere fatta in una cappa di fumi.
  12. Distribuisci 180 l di ogni miscela di reazione in una chiara microplacca di polistirolo 96 bene.
  13. Misurare l'assorbimento di ogni pozzo a 860 nm utilizzando uno spettrofotometro a microplacca.

5. Analisi dei risultati

  1. Media i triplicati di ogni campione e gli standard Pi. Quindi sottrarre con lo spazio vuoto per eliminare il segnale di sfondo.
  2. Effettuare una curva di calibrazione tracciando i valori di assorbimento (A860) rispetto alla quantità di standard Pi (nmol) ed eseguire una regressione lineare per ottenere la funzione di linea di tendenza utilizzando la seguente formula:
    figure-protocol-1
  3. Calcolare la quantità di fosfato (nmol) rilasciata dalla reazione ezimatica in base alla formula di regressione lineare di cui sopra.
  4. Calcolare l'attività specifica utilizzando la formula seguente:
    figure-protocol-2
    dove nPi è la quantità di fosfato rilasciato dalla reazione (nmol), t è il tempo di reazione (min), e mTmPPase è la quantità del MoPPase puro utilizzato nel saggio (mg).
  5. Calcolare l'attività percentuale per ogni concentrazione di inibitore utilizzando la seguente formula:
    figure-protocol-3
    dove SAiis l'attività specifica di un campione con inibitore e SAun è l'attività specifica del campione disinibito.
  6. Calcolare il logIC50 (stima) e IC50 (stima) con una regressione non lineare adatta dalla curva dose-risposta a quattro parametri utilizzando la seguente formula:
    figure-protocol-4
    dove X è il registro di concentrazione (M), Y è l'attività (%), Top e Bottom sono altipiani nella stessa unità di Y (rispettivamente Y (100% e 0%)), logIC50 ha le stesse unità di log di X, e HillSlope - fattore di pendenza o pendenza collinare, che è senza unità.
    NOTA: Per il raccordo viene utilizzato il software (Table of Materials). Utilizzare la concentrazione di 0,01 M (invece di 0,00 M) per il campione senza inibitore poiché il logaritmo di zero non è definito.

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Risultati

In questo protocollo, sono stati testati otto composti (Figura 2A) insieme a IDP, un inibitore comune di pirofofosofasi, come controllo positivo. Ogni composto è stato testato in triplice copia a tre diverse concentrazioni (1 M, 5 M e 20 M) in triplice copia. Il flusso di lavoro dello screening è illustrato nella Figura 1, a partire dalla preparazione del campione e del reagente fino alla misurazione dell'assorbimento a 860 nm.

Alla f...

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Discussione

Qui riportiamo un protocollo dettagliato per lo screening semplice degli inibitori per la pirofosasi legata alla membrana da T. maritima in un formato 96 pozzo basato su Vidilaseris et al.14. Questo protocollo è poco costoso e basato su 12-acido fosforolismibdico, che è formato da ortopofosfato e molybdate in condizioni acide e ridotto a specie di fosfomilybdenum con un colore blu distinto12. Questo metodo è preferito rispetto ad altri protocolli, come il più sensi...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni della Jane and Aatos Erkko Foundation e della BBSRC (BB/M021610) ad Adrian Goldman, l'Accademia di Finlandia (n. 308105) a Keni Vidilaseris, (n. 310297) a Henri Xhaard, e (n. 265481) a Jari Yli-Kauhaluoma, e l'Università di Helsinki Fondi di Ricerca a Gustav Boije af Gennàs. Gli autori ringraziano Bernadette Gehl per il suo aiuto tecnico durante il progetto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Foglio sigillante adesivoThermo ScientificAB0558
Ammonio eptamolibdato tetraidratoMerckF1412481 636
Acido ascorbicoSigma-Aldrich95212-250G
BioLite 96Well MultidishThermo Scientific130188
Dimetil solfossido (DMSO)Merck1167431000
Strisce per provette PCR a 8 pozzetti, 0,2 ml senza tappi (120)Genetica NipponFG-028
Dodecil maltoside (DDM)MelfordB2010-100G
EtanoloMerck1009901001
Acido acetico glacialeMerck1000631011
Acido cloridricoSigma-Aldrich,258148-500ML
Imidodifosfato di sodio saleSigma-AldrichI0631-1G
L-&alfa;-Fosfatidilcolina da lecitina di soiaSigma429415-100GM
Cloruro di magnesioSigma-Aldrich8147330500
Multipiastra 96 pozzetti Piastre PCRBio-RadMLL9651
MultiSkan GoThermo Scientific10680879
Nepheloskan Ascent (Tipo 750)Labsystems
Piastra di Petri in polistirene (dimensioni 150 mm x 15 mm)Sigma-AldrichP5981-100EA
Cloruro di potassioMerck104936
Prism 6 softwareGraphPad
QBT2 Blocco riscaldanteGrant Instruments
Meta-arsenito di sodioFisher Chemical
Sodio fosfato bibasico (Pi)SigmaS0876-1KG
Sodio pirofosfato bibasicoFluka71501-100G
Citrato trisodico diidratoFluka71404-1KG
, , ,, , , , , 12897692

Riferimenti

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