Questo protocollo dimostra la misurazione accurata e riproducibile del consumo di ossigeno nelle isole pancreatiche dei primati non umani. Le tecniche di caricamento dell'isolotto e il rivestimento della micropiastra forniscono un quadro per la misurazione efficiente della respirazione in altri tipi di sferoidi coltivati.
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Articolo metodologico
Analisi del consumo di ossigeno dell'isola pancreatica del primate non umano
In questo articolo
Sommario
Abstract
La misurazione del consumo di ossigeno in gruppi di sferoidi di cellule, come le isole pancreatiche ex vivo, è stata storicamente impegnativa. Dimostriamo la misurazione del consumo di ossigeno alle irate utilizzando una micropiastra da 96 pozzetto progettata per la misurazione del consumo di ossigeno negli sferoidi. In questo analisi, le microplacche sferoidi sono rivestite con un adesivo per cellule e tessuti il giorno prima del saggio. Utilizziamo un piccolo volume di soluzione adesiva per incoraggiare l'aderenza alle alteienze solo sul fondo del pozzo. Il giorno del saggio, 15 isolotti vengono caricati direttamente nella base di ogni pozzo utilizzando una tecnica che garantisce un posizionamento ottimale delle isole e una misurazione accurata del consumo di ossigeno. Vari aspetti della respirazione mitocondriale sono sondati farmacologicamente in isolotti di primati non umani, tra cui la respirazione dipendente dall'ATP, la respirazione massima e la perdita di protoni. Questo metodo consente risultati coerenti e riproducibili utilizzando solo un piccolo numero di isolotti per pozzo. Teoricamente può essere applicato a qualsiasi sferoide coltivato di dimensioni simili.
Introduzione
Al fine di mantenere i normali livelli di glucosio nel sangue, la cellula pancreatica deve rilevare le elevazioni nel glucosio e secernere insulina di conseguenza. L'accoppiamento della secrezione di insulina con i livelli di glucosio è direttamente collegato al metabolismo del glucosio e alla produzione di ATP attraverso il fosforonte ossidativo mitocondriale. Così, i mitocondri svolgono un ruolo fondamentale nell'accoppiamento stimolo-secrezione1. La valutazione della funzione mitocondriale a cellule z può rivelare difetti che portano a una compromissione della secrezione di insulina. Anche la secrezione di cellule glucagoniche è strettamente....
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Protocollo
1. Preparazione della cartuccia di micropiastra e sensore il giorno prima dell'esecuzione del saggio
Le isole sono state isolate dai macachi giapponesi di tre anni, come descritto in precedenza13. Questo metodo è molto simile a quello utilizzato per isolare le isole umane dai donatori di cadaveri, ma differisce dai topi, in cui la pancreata è spesso gonfiata con soluzione di collagenasi mentre l'animale è sotto sedazione e prima della rimozione dell'organo. Il recupero dell'Islet è stato condotto in conformità con le linee guida dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Oregon National Primate Resea....
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Risultati
Per caricare le isole in microplacca, 15 isolotti devono essere aspirati in 15 - L di supporto, come mostrato Figura 1A. Le isole si stabiliranno naturalmente verso il fondo della punta del tubo in pochi secondi. Quindi, la punta del pipet viene abbassata sul fondo del pozzo. La punta è molto leggermente sollevata, e un piccolo volume (circa 5 ) viene convogliato insieme alle isole. Questa tecnica si traduce in un posizionamento coerente dell.......
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Discussione
Lo studio del consumo di ossigeno alle isole è stato in precedenza ostacolato dalla forma sferica delle isole, dalla loro mancanza di aderenza alle superfici di coltura e dal numero di isolotti necessari per ogni pozzo. In questo protocollo, mettiamo in evidenza l'efficacia della micropiastra sferoide da 96 pozzetto per misurare il consumo di ossigeno nelle isole su un piccolo numero di isolotti e dimostriamo una tecnica per la movimentazione e il caricamento delle isole tecnicamente fattibile e che produce Risultati.
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano riconoscere il Vanderbilt High Throughput Screening Core per l'uso delle loro strutture, Agilent Biotechnologies, Dr. Paul Kievit (Oregon Health and Science University) per isolazioni di isolotti di primati non umani, e Eric Donahue (Vanderbilt University) per l'assistenza con Figura 1. J.M.E. è stato sostenuto dal NIGMS del National Institutes of Health con il numero di premio T32GM007347. M.G. è stato supportato dal NIH/NIDDK (R24DK090964-06) e dal Department of Veterans Affairs (BX003744).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piatto per colture cellulari, 60 mm X 15 mm Corning | 430166 | ||
| Adesivo per cellule e tessuti Cell-Tak | Corning | 354240 | |
| Provetta conica, 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Destrosio anidro | Fisher Scientific | BP350-1 | Per soluzione di glucosio, 200 mg/ml, sterile filettato |
| Serbatoi monouso (sterili), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | per il caricamento di pipette multicanale |
| EZFlow Sterile 0,45 &; m Filtro per siringa PES, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutammina | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Puntali per pipette multicanale | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| Pipetta multicanale, 15-1250 μ L | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Pipette |
| P20, P200 e P1000 | Eppendorf | 2231000602 | |
| Sonda di pH | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| Puntali per pipette, 20 &; L, 200 μ L, 1000 μ L | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Include oligomicina, FCCP e Rotenone/Antimicina A |
| Seahorse XFe96 Analizzatore | Agilent | S7800B | Inclusa stazione di preparazione con 37 ° Incubatore C senza CO2 |
| Seahorse XFe96 Sferoide Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Include cartuccia sensore, micropiastra sferoidale e calibrante |
| Bicarbonato di sodio | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Piruvato di sodio | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Stereomicroscopio | Olympus | SZX9 | |
| Siringa (sterile), 5 mL | BD | 309603 | Per filtrazione sterile |
| Acqua (sterile) | Sigma | W3500-500mL |
Riferimenti
- Mulder, H. Transcribing β-cell mitochondria in health and disease. Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).
- Maechler, P., Wollheim, C. B. Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell. The Journal of Physiology
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Ristampe e permessi
Tag
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