Articolo metodologico

Etichettatura di prossimità basata su turboid per in Planta identificazione di reti di interazione proteina-proteina

DOI:

10.3791/60728

⸱

17 maggio 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Agro-Biotechnology and Ministry of Agriculture Key Laboratory of Soil Microbiology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Descritto qui è un metodo di etichettatura di prossimità per l'identificazione dei partner di interazione del dominio TIR del recettore immunitario NLR nel tessuto fogliare di Nicotiana benthamiana. Viene inoltre fornito un protocollo dettagliato per l'identificazione delle interazioni tra altre proteine di interesse utilizzando questa tecnica nella Nicotiana e in altre specie vegetali.

Abstract

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Le tecniche di etichettatura di prossimità (PL) che utilizzano l'aossidasi ascorbate (APEX) ingegnerizzata o l'Escherichia coli biotini ligase ligase BirA (noto come BioID) sono state utilizzate con successo per l'identificazione delle interazioni proteina-proteina (IPP) nelle cellule dei mammiferi. Tuttavia, i requisiti di perossido di idrogeno tossico (H2O2) in PL basato su APEX, tempi di incubazione più lunghi con biotina (16-24 h) e una temperatura di incubazione più elevata (37 gradi centigradi) nel PL basato sul bioID limitano gravemente le loro applicazioni nelle piante. Il PL basato su TurboID recentemente descritto affronta molte limitazioni di BioID e APEX. TurboID consente una rapida etichettatura di prossimità delle proteine in soli 10 min in condizioni di temperatura ambiente (RT). Anche se l'utilità di TurboID è stata dimostrata in modelli animali, abbiamo recentemente dimostrato che PL a base di TurboID offre prestazioni migliori nelle piante rispetto al BioID per l'etichettatura delle proteine che sono propimali a una proteina di interesse. A questo proposito è fornito un protocollo passo-passo per l'identificazione dei partner di interazione proteica utilizzando il dominio del recettore N-terminale Toll/interleukin-1 (TIR) della famiglia di proteine leucina-ricca (NLR) legante-legame nucleotide come modello. Il metodo descrive la costruzione vettoriale, l'agroinfiltrazione dei costrutti di espressione proteica, il trattamento della biotina, l'estrazione e la dissalazione delle proteine, la quantificazione e l'arricchimento delle proteine biotinylate per purificazione dell'affinità. Il protocollo qui descritto può essere facilmente adattato per studiare altre proteine di interesse per Nicotiana e altre specie vegetali.

Introduzione

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Gli IPP sono alla base di vari processi cellulari. I metodi tradizionali per identificare gli IPP includono lo screening del lievito-due-ibrido (Y2H) e l'immunoprecipitazioni accoppiati con la spettrometria di massa (IP-MS)1. Tuttavia, entrambi soffrono di alcuni svantaggi. Ad esempio, lo screening Y2H richiede la disponibilità della libreria Y2H delle specie vegetali o animali bersaglio. La costruzione di queste biblioteche è laboriosa e costosa. Inoltre, l'approccio Y2H viene eseguito nel lievito eterologo dell'organismo eucatotico unidestro, che potrebbe non rappresentare lo stato cellulare delle cellule eucariotiche superiori.

Al contrario, IP-MS mostra una bassa efficienza nell'acquisizione di IPP transitori o deboli, ed è anche inadatto per quelle proteine con bassa abbondanza o alta idrofobicità. Molte importanti proteine coinvolte nei percorsi di segnalazione delle piante, come le chinasi recettoriali (RLK) o la famiglia NLR di recettori immunitari, sono espresse a bassi livelli e spesso interagiscono con altre proteine in modo transitorio. Pertanto, limita notevolmente la comprensione dei meccanismi alla base della regolazione di queste proteine.

Recentemente, sono stati sviluppati e utilizzati per lo studio degli Escherichia coli biotin ligase Ligase R118G (noto come BioID) metodi basati su ascorbate perossidasi ingegnerizzati (APEX) e un mutante Escherichia coli biotinli ligaseBirA R118G (noto come BioID) e utilizzati per lo studio degli IPP2,,3,4. Il principio di PL è che una proteina bersaglio di interesse è fusa con un enzima, che catalizza la formazione di labile biotinyl-AMP (bio-AMP). Questi bio-AMP gratuiti vengono rilasciati dagli enzimi PL e si diffondono in prossimità della proteina bersaglio, permettendo la biotinyalazione delle proteine prossimali nelle ammine primarie entro un raggio stimato di 10 nm5.

Questo approccio presenta vantaggi significativi rispetto agli approcci tradizionali Y2H e IP-MS, ad esempio la capacità di acquisire IPP temporanei o deboli. Inoltre, PL consente l'etichettatura delle proteine prossimali della proteina bersaglio nei loro ambienti cellulari nativi. Diversi enzimi PL hanno svantaggi unici quando li applicano a sistemi diversi. Ad esempio, sebbene APEX offra una cinetica di tagging più elevata rispetto al BioID e venga applicato con successo nei sistemi di mammiferi, il fabbisogno di perossido di idrogeno tossico (H2O2) in questo approccio lo rende inadatto per gli studi PL negli impianti.

Al contrario, PL basato su BioID evita l'uso del tossico H2O2, ma il tasso di etichettatura è lento (che richiede 18-24 h per completare la biotinylation), rendendo così meno efficiente la cattura di PpI transitori. Inoltre, la temperatura di incubazione più elevata (37 gradi centigradi) necessaria per un PL efficiente da parte di BioID introduce lo stress esterno ad alcuni organismi, come le piante4. Pertanto, è stato segnalatoun,7,8,9impiego limitato di PL a base di BioID in impianti (ad esempio protoplasti di riso, Arabidopsis e N. benthamiana) . L'enzima TurboID recentemente descritto supera le carenze di APEX e PL.10 PL basato su turboidi è stato applicato con successo nelle cellule dei mammiferi, mosche e vermi10. Recentemente, noi e altri gruppi di ricerca indipendenteottimizzato ed esteso l'uso di TurboID-based PL per studiare IPP in diversi sistemi vegetali, tra cui N. benthamiana e arabidopsis piante e pomodoro radici pelose11,12,13,14. Analisi comparative hanno indicato che TurboID offre prestazioni migliori per PL nelle piante rispetto al BioID11,14. Ha anche dimostrato la robustezza di PL a base di TurboID in planta identificando una serie di nuove interazioni con un recettore immunitario NLR11, una proteina i cui partner di interazione sono solitamente difficili da ottenere utilizzando metodi tradizionali.

Questo protocollo illustra il PL basato su TurboID in planta descrivendo l'identificazione delle proteine di interazione del dominio TIR N-terminale del recettore immunitario NLR nelle piante Di N. benthamiana. Il metodo può essere esteso a qualsiasi proteina di interesse in N. benthamiana. Ancora più importante, fornisce un importante riferimento per lo studio degli IPP in altre specie vegetali come l'Arabidopsis,il pomodoro e altri.

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Protocollo

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NOTA: una panoramica del metodo è illustrata nella Figura 1.

1. Preparazione del materiale vegetale

  1. Coltiva i semi di N. benthamiana in terreno umido ad alta densità e mantenerli in una camera climatica con una luce di 16 h (circa 75 mol/m2s) e un fotoperiodo scuro di 8 h a 23–25 gradi centigradi.
  2. Circa 1 settimana dopo, trasferire attentamente ogni giovane piantine a pentole da 4' x 4' e tenere le piantine nella stessa camera.
  3. Mantenere le piante nella camera per circa 4 settimane fino a quando crescono ad uno stadio foglia di 4-8 per la successiva agroinfiltrazione15.

2. Costruzione di fusioni TurboID

  1. Utilizzare la tecnica di clonazione molecolare standard per generare la fusione della proteina bersaglio con TurboID (PCR TurboID di Addgene plasmid #107177). Qui, abbiamo usato il dominio TIR N-terminale del recettore immunitario NLR come proteina bersaglio di interesse e costruito TIR fuso a TurboID sotto il controllo del virus del mosaico di Cavolfiore 35S promotore (p35S::TIR-TurboID).
    NOTA: La fusione dell'enzima TurboID al carboxyl-terminus o all'ammino-terminus della proteina bersaglio dipenderà dalla proteina di interesse. Di solito, per una proteina citoplasmatica, entrambi i termini dovrebbero essere accettabili, purché la fusione TurboID non influisca sulla funzione della proteina bersaglio. Tuttavia, per una proteina localizzata in membrana, la topologia proteica deve essere caratterizzata in anticipo prima di determinare quale capolinea è meglio per la fusione TurboID.
  2. Costruisci un citrino fuso turboide sotto lo stesso promotore per fungere da controllo per la successiva analisi proteomica quantitativa.
    NOTA: è importante costruire un controllo TurboID per identificare il proteoma proximal alla proteina bersaglio. Il controllo di fusione TurboID dovrebbe mostrare un livello di espressione simile a quello della proteina bersaglio fusa turboID. Questo può essere determinato empiricamente regolando la concentrazione di Agrobacterium durante l'agroinfiltrazione. Inoltre, è importante che la proteina di controllo abbia un modello di localizzazione subcellulare simile a quello della proteina bersaglio di interesse.

3. Agroinfiltrazione

  1. Trasformazione dei plasmidi in agrobatterio
    1. Aggiungete 0,5 g di plasmidi generati dai passi 2.1 e da 2,2 a 50 -L di Agrobacterium tumefaciens ceppo GV3101 cellule competenti, preparate come descritto in precedenza16.
      NOTA: Possono essere utilizzati anche altri ceppi di Agrobacterium, come GV2260.
    2. Incubare sul ghiaccio per 30 min.
    3. Scossa di calore in un bagno d'acqua a 42 gradi centigradi per 60 s.
    4. Aggiungete all'Agrobacterium 400 l di LB medio (10 g/L di tryptone, 5 g/L di lievito e 10 g/L NaCl; pH 7,0) e incubate a 28 gradi centigradi per 90 min.
    5. Piastrare l'intero contenuto nel tubo su LB agar integrato con antibiotici appropriati per selezionare il plasmide, così come per l'Agrobacterium (per GV3101: 50 mg/L gentamicin e 50 mg/L rifampicina).
    6. Incubare le piastre a 28 gradi centigradi per 36-48 h fino a quando le singole colonie non sono visibili.
  2. Raccogliere e strisciare diverse colonie individuali su un piatto fresco di agar LB con antibiotici (vedi passo 3.1.5) e crescere a 28 gradi durante la notte.
    NOTA: È più ottimale eseguire la colonia PCR per confermare la presenza del costrutto binario specifico nell'Agrobacterium. Nella nostra esperienza, oltre il 95% delle colonie contiene i costrutti binari introdotti.
  3. Inoculare 3 mL di LB medio più antibiotici appropriati (vedi passo 3.1.4) con colonia di Agrobacterium che ospita il costrutto di interesse, e incubare agitando durante la notte a 28 s fino a quando l'OD600 della coltura Agrobacterium raggiunge 2.0.
  4. Centrifugare le cellule a 3.000 x g e risospendere a OD600 x 1,0 nel buffer di agroinfiltrazione (10 mM MgCl2, 10 mM MES [pH - 5,6], 250 s acetosyringone).
    NOTA: Anche se è ottimale incubare l'inoculum per 2 h a RT prima dell'agroinfiltrazione, nella nostra esperienza con il ceppo GV3101, non c'è stata una grande differenza tra l'espressione proteica bersaglio con vs senza incubazione.
  5. Utilizzare una siringa senza ago da 1 mL per infiltrarsi nell'inoculo nell'epidermide (abassiale) delle foglie di N. benthamiana completamente mature.
    NOTA: Per preparare una quantità sufficiente di materiali foglia per tre repliche biologiche: di solito un'intera foglia viene infiltrata, tre foglie vengono infiltrate per pianta e per ogni costrutto vengono utilizzate da tre a quattro piante. Per ogni foglia è sufficiente 1,5-2,0 mL di agrobatteri risospesi.
  6. Dopo 36 h post-infiltrazione (hpi), infiltrati con biotina da 200 m (in 10 m soluzione MgCl2) nelle foglie preinfiltrate con i costrutti TurboID.
  7. Mantenere la pianta per ulteriori 3-12 h prima di raccogliere il tessuto fogliare come descritto nella sezione 4.
    NOTA: La ragione per la scelta del 36 hpi per l'infiltrazione di biotina è che l'espressione proteica bersaglio raggiunge il picco in questo punto temporale secondo studi precedenti11. Si consiglia di determinare il tempo necessario per l'espressione ottimale della proteina bersaglio di interesse. Il tempo di incubazione post-biotina dipende dalla progettazione sperimentale e dalla proteina bersaglio in esame. Di solito, 3-12 h di trattamento della biotina consente l'etichettatura della maggior parte delle proteine prossimati alla proteina bersaglio da parte delle fusioni TurboID.

4. Raccolta di campioni di foglie

NOTA: Per la successiva elaborazione dei campioni di foglie, indossare guanti sterili per evitare la contaminazione da cheratina dei campioni. Tutti i reagenti dovrebbero anche essere il più possibile privi di cheratina.

  1. Tagliare le foglie infiltrate alla base del picciolo, rimuovere la vena foglia, quindi congelare il tessuto fogliare in azoto liquido.
  2. Macinare il tessuto fogliare utilizzando un pestello e malta e conservare la polvere di foglia in 15 mL o 50 mL tubi falco a -80 gradi centigradi per un uso successivo.
    NOTA: Prendere tre o quattro pezzi di foglie per ciascuno dei tre replica biologici da piante diverse. Il protocollo può essere messo in pausa qui. Prima delle fasi successive, si raccomanda di valutare l'espressione proteica e la biotinylazione della proteina bersaglio mediante analisi immunoblot. Le tipiche macchie occidentali sono mostrate nella Figura 2.

5. Estrazione della proteina totale delle foglie

  1. Trasferire circa 0,35 g di polvere di foglia in un tubo da 2 mL. Preparare due tubi per ogni campione.
    PROCEDIMENTO: Indossare guanti quando si tocca qualsiasi oggetto raffreddato da azoto liquido.
  2. Aggiungere 700 l di buffer di lisi RIPA (50 mMM Tris-HCl [pH - 7,5], 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 [v/v], 0,1% SDS [w/v], 0.5% deoxycholate di sodio [w/v], 1 mM DTT, 1 compressa di cocktail inibitore proteasi) a 0,35 g di polvere di foglia.
  3. Vorticare i tubi per 10 min.
  4. Lasciare i campioni sul ghiaccio per 30 min.
  5. Mescolare il contenuto ogni 4-5 min capovolgendo i tubi più volte.

6. Rimozione della biotina gratuita mediante dissalatura

NOTA: questa sezione richiede circa 50 min.

  1. Equilibrate la colonna di salvie.
    1. Rimuovere il sigillante nella parte inferiore della colonna di salsalazione e mettere la colonna in un tubo da 50 mL.
    2. Rimuovere la soluzione di stoccaggio con centrifugazione a 1000 x g e 4 gradi centigradi per 2 min e assicurarsi che il tappo sia allentato.
    3. Mettere la colonna di salvieo in un tubo da 50 mL. Equilibrate la colonna 3x con 5 mL di buffer di lisi RIPA, ogni volta centrifugando a 1000 x g e 4 gradi centigradi per 2 min e scartando il flusso.
    4. Trasferire la colonna di dissalamento in un nuovo tubo da 50 mL e conservarla temporaneamente a 4 gradi centigradi per un uso successivo.
  2. Girare i tubi da passo 5.4 a 16.500 x g e 4 s per 10 min e trasferire il supernatante dai due tubi in un nuovo tubo 2 mL.
  3. Aggiungere 1.500 l di estratto proteico nella parte superiore della colonna di dissalazione equilibrata (dal punto 6.1.4). Quando l'estratto di proteina entra nella resina, aggiungere altri 100 l di lis tampone RIPA.
    NOTA: Anche se per l'estrazione di proteine dalle foglie è stato utilizzato un buffer di lisi RIPA di 1.400 gradi, il volume totale dopo l'estrazione e la dealning delle proteine è stato invariabilmente aumentato in misura rispetto al volume originale. Pertanto, una combinazione dei campioni di ogni gruppo, come descritto nei passaggi 5.1 e 5.4, può comportare almeno 1.500 l di estratto di proteine per campione.
  4. Centrifuga a 1000 x g e 4 gradi centigradi per 2 min e lasciare temporaneamente i campioni dissalati sul ghiaccio.

7. Quantificazione degli estratti di proteine dissalati utilizzando un saggio Bradford

  1. Preparare 50 l di ogni soluzione sfumata BSA: 0 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,8 mg/mL e 1 mg/mL.
  2. Diluire l'estratto di proteine dissalate mescolando un campione di 5 ll con 45 -L di ddH2O.
  3. Preparare 1 x Bradford reggente diluindo il 5x Bradford reggent (100 mg di Coomassie brillante blu G250, 47 mL di metanolo, 100 mL di 85% acido fosforico, 53 mL di ddH2O).
  4. Aggiungete 50 l di ogni soluzione bstale BSA e 50 ll di estratto di proteine diluite ai 2,5 mL di 1 x regent Bradford.
  5. Incubare a RT per 10 min.
  6. Aggiungere 200 l di soluzione di ogni campione a un pozzo di una piastra ELISA (tre repliche tecniche per campione).
  7. Misurare l'OD595 utilizzando un lettore di microplacio.
  8. Disegnare la curva standard in base al valore della soluzione BSA sfumata e calcolare la concentrazione dei campioni di proteine dissalate. Di solito, la concentrazione proteica totale ottenuta da 0,7 g di foglie varia da 3 a 6 mg/mL.
  9. Preparare 6-8 mg di estratto di proteine dissalate per la successiva purificazione dell'affinità.

8. Arricchimento delle proteine biomutate

  1. Prendere 200 l di perline magnetiche coniugate streptavidn-C1 in un tubo da 2 mL.
  2. E le perline magnetiche coniugate streptavidn-C1 con 1 mL di tampone di lisi RIPA per 1 min a RT.
  3. Dopo ogni lavaggio, utilizzare il rack magnetico per adsornerare le perline per 3 min e rimuovere delicatamente la soluzione pipetting.
  4. Ripetere i passaggi 8.2 e 8.3.
  5. Trasferire l'estratto di proteine dissalate nelle perle magnetiche coniugate streptavidn-C1 bilanciate.
  6. Incubare il tubo a 4 gradi centigradi per 12 h (o durante la notte) su un rotatore per purificare l'affinità delle proteine biotinylate.
  7. Catturare le perline su un rack magnetico per 4 minuti a RT fino a quando le perline raccolgono su un lato del tubo, quindi rimuovere delicatamente il supernatant da pipetta.
  8. Aggiungere 1,7 mL di tampone di lavaggio I (2% SDS in acqua) al tubo e tenerlo sul rotatore a RT per 8 min. Ripetere il passaggio 8.3.
  9. Aggiungere 1,7 mL di buffer di lavaggio II (50 mHe: pH - 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% acido deossilicico [w/v], 1% Triton X-100) al tubo e tenerlo sul rotatore a RT per 8 min. Step Repeat 8.3.
  10. Aggiungere 1,7 mL di buffer di lavaggio III (10 mM Tris-HCl: pH : 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0.1% acido deoxycholic [w/v], 1% NP40 [v/v]) al tubo e tenerlo sul rotatore a RT per 8 min.
  11. Aggiungere 1,7 mL di 50 mM Tris-HCl (pH - 7,5) per rimuovere il detergente, quindi ripetere il passaggio 8.3.
  12. Trasferire le perline in un nuovo tubo da 1,5 mL e ripetere i passaggi 8.11 e 8.3.
  13. Lavare le perline 6x per 5 min ciascuna con 50 mM di tampone di bicarbonato di ammonio a RT.
  14. Aggiungere 1 mL di 50 mm di batampo di bicarbonato di ammonio alle perline magnetiche e mescolare bene.
  15. Rimuovere 100 l di perline per l'analisi dell'immunoblot per confermare l'arricchimento delle proteine biotinylate. Una tipica macchia occidentale è mostrata figura 3.
  16. Congelano in flash il resto dei campioni di proteine e conservati a -80 gradi o li inviano immediatamente per l'analisi LC-MS/MS sul ghiaccio secco.
    NOTA: I risultati tipici degli Stati membri sono visualizzati in una pubblicazione precedente (shang et al. Figura 2, Dati supplementari 1 e Dati supplementari 2)11. Gli interi set di dati sono disponibili in MassIVE (disponibile all'indirizzo ) utilizzando l'identificatore: MSV000083018 e MSV000083019.

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Risultati

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I dati rappresentativi, che illustrano i risultati attesi in base al protocollo descritto, sono adattati da .hang et al11. Figura 1 riepiloga le procedure per l'esecuzione di TurboID-based PL in N. benthamiana. La figura 2 mostra l'espressione proteica e la biotinylazione nelle foglie di N. benthamiana infiltrate. La figura 3 mostra che le proteine biotinylate nelle foglie infiltrate sono st...

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Discussione

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Il turboID biotina lega è generato dall'evoluzione diretta del BioID10basato sul display di lievito. Ha molti vantaggi rispetto ad altri enzimi PL. TurboID consente l'applicazione di PL ad altri sistemi di modello, tra cui mosche e vermi, la cui temperatura di crescita ottimale è di circa 25 c10. Anche se l'approccio PL è stato ampiamente utilizzato nei sistemi animali, la sua applicazione nelle piante è limitata. Il protocollo qui descritto fornisce una procedura passo-pas...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Transgenic Science and Technology Program (2019-X08010-003 a Y.z.), della National Natural Science Foundation of China (31872637 a Y.z.) e dei Fondi di Ricerca Fondamentali per le Università Centrali (da 2019TC028 a Y.E.) e della NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185 e NIH-GM132582-01 a S.P.D.K.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Spettrofotometro 721Metash, prodotto in CinaQ/SXFZ6Per la misurazione di OD600
Bicarbonato di ammonioSigmaA6141-500G
BiotinaSigmaB4639-1G50 mM Stock
CentrifugeEppendorfCentrifuge 5702
CentrifugaEppendorfCentrifuge 5417R
Cocktail di inibitori della proteasi cOmplete Roche11697489001
Acido desossicolicoSigmaD2510-100G
DL-Ditiotreitolo (DTT)VWR Life Science0281-25G
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Invitrogen65001Per purificazione di affinità
EDTASigmaE6758-500G
Piastra ELISACorningCostar 3590
HEPESSigmaH3375-1KG
Acido cloridrico (HCl)Fisher ScientificA144S-212
Immobilon-P Membrana PVDFMilliporeIPVH00010Per analisi Western blot
Soluzione di cloruro di litio (LiCl), 8MSigmaL7026-500ML
Refrigerato a bassa velocità centrifugaZonkia, made in ChinaKDC-2046Per la desalinizzazione
del cloruro di magnesio, esaidrato (MgCl2· 6H2O)SigmaM9272-500G
Cremagliera magneticaInvitrogen123.21DPer adsorbimento a microsfere
Multiskan FC Fotometro per micropiastreThermo Fisher ScientificN07710Per OD595
misurazione NP-40 (IGEPAL CA-630)SigmaI8896-100ML
Rat anti-HARoche11867423001
Miscelatore rotazionaleKylin-Bell Lab InstrumentWH-986per
incubatriceShock Labotery, made in ChinaZQPZ-228
Cloruro di sodio (NaCl)Fisher ScientificS271-3
Sodio desossicolatoSigmaD2510-100G
Sodio dodecil solfato (SDS)SigmaL4390-1KG
Streptavidina-HRPAbcamab7403
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Trizma baseSigmaT1503-1KG
VortexScientific IndustriesG-560E
Incubatrice a camicia d'acquaBlue pard, made in ChinaGHP-9080Per Agrobacterium incubazione
Colonna di desalinizzazione Zeba SpinThermo Fisher Scientific89893Per la rimozione della biotina
IP

Riferimenti

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