Method Article

Arricchimento simultaneo dell'affinità di due modifiche post-traduzionali per la quantificazione e la localizzazione del sito

DOI:

10.3791/60780

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February 27th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Buck Institute for Research on Aging

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo flusso di lavoro descrive contemporaneamente le prestazioni dell'arricchimento in termini di tempo ed efficiente in termini di costi di più modifiche post-traslazionali proteiche (PPM) per l'analisi proteomica globale quantitativa. Il protocollo utilizza l'arricchimento PTM a livello di peptide con più anticorpi coniugati, seguito dall'analisi della spettrometria di massa di acquisizione indipendente dai dati per ottenere informazioni biologiche sul crosstalk PTM.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lo studio di più modifiche post-traduzionali (PTM) di proteine è un passo cruciale per comprendere il crosstalk PTM e ottenere informazioni più olistiche sulla funzione proteica. Nonostante l'importanza degli studi di arricchimento multi-PTM, pochi studi studiano più di un PTM alla volta, in parte a causa delle spese, del tempo e delle grandi quantità proteiche necessarie per eseguire più analisi proteomiche globali dei PTM. L'arricchimento dell'affinità "one-pot" dettagliato in questo protocollo supera queste barriere consentendo l'identificazione simultanea e la quantificazione di peptidi con residui di lisina contenenti PTM di acetilazione e succinylation con basse quantità di campione Input. Il protocollo prevede la preparazione di lesitra proteici da fegati di topo di topi knockout SIRT5, prestazioni di digestione della cipina, arricchimento per PTM e prestazioni di analisi spettrometrica di massa utilizzando un flusso di lavoro di acquisizione indipendente dai dati (DIA). Poiché questo flusso di lavoro consente l'arricchimento simultaneo di due PtM dallo stesso campione, fornisce uno strumento pratico per studiare il crosstalk PTM senza richiedere grandi quantità di campioni e riduce notevolmente il tempo necessario per la preparazione dei campioni, i dati l'acquisizione e l'analisi. Il componente DIA del flusso di lavoro fornisce informazioni complete specifiche su PTM. Ciò è particolarmente importante quando si studia la localizzazione del sito PTM, poiché DIA fornisce set completi di ioni di frammento che possono essere decifrati computazionalmente per distinguere tra diverse isoforme di localizzazione PTM.

Introduction

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Una miriade di modifiche post-traduzionali regolano dinamicamente le proteine e i percorsi attraverso gli effetti sull'attività1, segnalando2e fatturato3,4. Ad esempio, le chinasi proteiche vengono attivate o disattivate dall'aggiunta di gruppi di fosfati5, e l'acetilazione degli istoni e altre modifiche forniscono un meccanismo per modificare la struttura della cromatina e fungono da meccanismi regolatori trascrizionali6,7. Negli ultimi anni, la prova ha montato che più PTM lavorano in concerto o competono per regolare la funzione o l'attività delle proteine8,9,10,11. Pertanto, comprendere il gambo incrociato PTM è un'esigenza emergente nella ricerca PTM. Tuttavia, la maggior parte dei flussi di lavoro proteomici disponibili per identificare e quantificare i siti PTM si concentra su singole modifiche, piuttosto che sull'interazione di più modifiche. Il flusso di lavoro descritto correla la modifica di proteine specifiche "hot-spot" e residui di lisina che vengono modificati da più PTM diversi.

La comunità scientifica ha sempre più bisogno di metodi fattibili per studiare più PPM contemporaneamente12. La maggior parte dei metodi per identificare e quantificare globalmente i siti di più tipi di PTM sono impegnativi a causa degli elevati costi e della quantità di tessuto richiesti12,13. Non solo gli esperimenti di arricchimento multi-PTM richiedono molto tempo in termini di preparazione del campione, acquisizione dei dati e analisi dei dati, ma questi studi in genere richiedono grandi quantità e spesso proibitive di proteine11. Di seguito è descritto un protocollo per l'arricchimento e l'analisi simultanei di più PTM, che affronta anche diverse di queste barriere e consente la profilazione PTM su larga scala e la valutazione del crosstalk tra i vari PTM14. Questo flusso di lavoro one-pot delinea un modo pratico per i ricercatori biomedici di profilare globalmente più PTM, identificare peptidi co-modificati e studiare il crosstalk PTM in modo efficiente ed economico14,15.

Qui, questo metodo è mostrato esaminando l'acilazione delle proteine mitocondriali, che è stata studiata per la prima volta oltre 50 anni fa16. Si concentra specificamente sull'acetilazione lisina17 e sulla succinylation18, compresa la co-occorrenza di queste modifiche sulle proteine e persino la co-modifica a livello di peptide. Poiché lo studio utilizza un modello di topo knockout sirtuin 5 (SIRT5), è stato scelto per concentrarsi sull'arricchimento dei siti di acetilazione e succinylation. Questa decisione è stata presa perché i siti di succinylation sono obiettivi di SIRT5 desuccinylasi e si prevede quindi di mostrare una significativa upregulation nei topi KO, rendendoli i PTM più rilevanti in questo caso. Entrambi i PTM sono biologicamente rilevanti come recentemente riassunto da Carrico etal. In generale, l'acetilazione mostra importanti effetti sull'espressione genica e sul metabolismo, e il succinylation è stato segnalato per regolare il metabolismo cardiaco e la funzione20.

Il protocollo descritto può essere eseguito con una bassa quantità di materiale di input proteico (ad esempio, 1 mg di lisato proteico) e riduce la durata totale dell'esperimento riducendo il tempo impiegato per l'elaborazione del campione, l'acquisizione di MS e l'analisi dei dati. Nella Figura 1viene fornito uno schema del flusso di lavoro . Abbiamo anche usato quantità ancora più basse di materiale di partenza (fino a 100 g di lisato proteico, riducendo le quantità di perline utilizzate di conseguenza), che, come previsto, riduce la resa complessiva dei peptidi acilati identificati; tuttavia, fornisce ancora risultati di grande valore e peptidi acilati quantificabili.

Mentre i cosiddetti flussi di lavoro dall'alto verso il basso o medio-verso il basso in genere non utilizzano approcci di digestione proteolitica (e quindi mantenere la connettività di più PTM all'interno di una proteina), questo protocollo si concentra su un approccio di arricchimento dell'affinità basato su peptidi per ottenere maggiore profondità e sensibilità per l'identificazione e la sensibilità del PTM (Figura 1). Inoltre, questo flusso di lavoro incentrato sui peptidi utilizza moderni metodi di spettrometria di massa, tra cui 1) una combinazione di acquisizione dipendente dai dati (DDA) per generare librerie spettrali e 2) acquisizioni indipendenti dai dati (DIA) per una quantificazione PTM accurata in un flusso di lavoro privo di etichette.

I flussi di lavoro DIA superano la stocasicità di campionamento dei tipici schemi di scansione DDA frammentando in modo completo tutti i segnali peptidici all'interno dell'intervallo m/z campionato21. Questa caratteristica è anche estremamente utile in termini di localizzazione del sito, perché è più facile ottenere informazioni riguardanti quali ioni di frammento specifici sono modificati all'interno del peptide. Inoltre, i flussi di lavoro DIA consentono l'identificazione e la quantificazione di isoformi PTM-peptidi minori con ioni precursori identici. I metodi DIA possono anche determinare una localizzazione specifica del sito PTM all'interno di un peptide sulla base di specifici ioni di frammento corrispondenti che vengono misurati in modo completo in ogni momento. Tuttavia, gli approcci DDA spesso utilizzano funzionalità di "esclusione dinamica" che escludono più campionamenti di MS/MS per lo stesso ione precursore, mancando quindi le isoforme PTM minori.

La strategia di arricchimento simultaneo qui descritta è ideale per studi che beneficeranno della profilazione e della quantificazione globali di più PTM, esaminando il crosstalk PTM e comprendendo le interazioni dinamiche delle modifiche post-traduzionali. L'identificazione di più PTM arricchiti in un unico flusso di lavoro combinato è stata descritta da: arricchimento globale, seriale o parallelo di PTM contenente peptidi proteolitici, o in alternativa dall'analisi di proteine intatte. Nel confronto diretto con l'arricchimento seriale dell'acetilazione e della succinylazione, l'efficienza della metodologia monocanta è stata stabilita come molto simile14. Questi protocolli alternativi richiedono quantità significative di materiale e tempo di partenza e possono essere proibitivi. Al contrario, il protocollo one-pot fornisce un metodo economico ed efficiente per l'arricchimento di più di un PTM con analisi e identificazione successive.

Tessuti epatici del topo sono ottenuti da topi KNOCKout SIRT5 e sono utilizzati qui come materiale di partenza. Questo protocollo può essere eseguito anche per le talità proteiche da diversi tessuti o esperimenti di coltura cellulare. Questo protocollo può essere applicato a lismi proteici ottenuti da tessuti o pellet di coltura cellulare.

Protocol

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Tutti gli esperimenti descritti nel protocollo seguono le linee guida del Buck Institute Institutional Animal Research Committee.

1. Estrazione di proteine da tessuto omogeneizzato e digestione con proteasi

  1. Preparare il buffer di lisi ad una concentrazione finale di 8 M di urea, 50 m m di triethylammonium bicarbonato (TEAB), 1 trichostatina A (TSA), 20 mm di nicotina, 75 mM di cloruro di sodio (NaCl), 1x cocktail inibitore di protease/phosphatase (PIC) con acqua HPLC-grade.
  2. Aggiungere un tallone sterile in acciaio a un tubo da 2 mL compatibile con un omogeneizzatore perpale, quindi posizionare il pezzo di tessuto (dimensioni di pisello) nel tubo. Aggiungere brevemente il buffer di lisi (500 gradi centigradi) e il vortice per assicurarsi che il tampone copra il pezzo di tessuto (aggiungere più buffer di lisi, se necessario). Posizionare i tubi su set di adattatori pre-raffreddati, assicurando che i tubi siano bilanciati tra i due adattatori dell'omogeneizzatore.
  3. Campioni di omogeneizzazione 2x a 25 Hz per 3 min ciascuno a 4 gradi centigradi. Se il tessuto non è completamente omogeneizzato, ruotare brevemente i tubi e trasferire il lisato omogeneizzato in un tubo appena etichettato da 1,5 mL. Quindi, aggiungere ulteriore buffer di lisi al pezzo di tessuto rimanente e ripetere l'omogeneizzazione 2x a 25 Hz per 3 min ciascuno. Due cicli di omogeneizzazione sono in genere sufficienti per rompere il tessuto.
  4. Rimuovere il tallone di metallo con una pinzetta. Tra ogni campione, risciacquare la pinzetta con acqua di qualità HPLC, metanolo di grado HPLC e acqua di grado HPLC di nuovo.
  5. Combinare i lisati omogeneizzati se sono stati applicati due cicli di omogeneizzazione e sonicare campioni con un ultrasuoniatore per 10 cicli a 30 s su / 30 s off e 4s C su alta potenza.
  6. Centrifugare i lisati omogeneizzati a 14.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi per cancellare il lisato. Trasferire il supernatante (lisato eliminato) in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml, evitando qualsiasi strato di grasso che possa trovarsi sopra il supernatante e gli eventuali detriti nella parte inferiore del tubo.
  7. Eseguire un saggio di acido bicinchoninico (BCA) per misurare la concentrazione proteica del lisato eliminato con una diluizione adeguata (ad esempio, 1:20 e/o 1:200). Secondo i risultati BCA, aliquota 1 mg di proteine da ogni campione.
  8. Ridurre le proteine in dithiothreitol (DTT) da 4,5 mm a 37 gradi centigradi per 30 min con agitazione a 1.400 rpm. Successivamente, proteine alkylate in iodoacetamide da 10 mM (IAA) con incubazione al buio (posto nel cassetto o nell'armadio) a temperatura ambiente (RT) per 30 min.
    NOTA: possono essere utilizzati reagenti alternativi, come N-ethylmaleimide (NEM) anziché IAA.
  9. Aggiungere 50 mM di TEAB ai campioni per diluire la concentrazione di urea al di sotto di 2 M. Spot 1 l del campione su una carta pH per garantire che il pH del campione diluito sia compreso tra 7,0 e 8,5. Aggiungere la trypsin a ogni campione con un rapporto di 1:50 (trypsin-to-protein, wt/wt) e digerire la proteina con agitazione a 37 gradi durante la notte (circa 14-16 h).
  10. Spegnire i digest con 10% di acido formica per raggiungere l'1% di acido formico il giorno successivo. Vortice e girare brevemente. Spot 1 l del campione su strisce di pH per assicurarsi che il digest sia pH - 2-3. Centrifuga a 1.800 x g per 15 min a RT per pellet qualsiasi materiale insolubile.

2. Dealando di peptidi proteolitici non arricchiti attraverso l'estrazione in fase solida su larga scala

  1. Ottenere cartucce contenenti resina C18 che può legare fino a 10 mg di proteine. Montare queste cartucce in un apparato sottovuoto per utilizzare l'aspirazione a vuoto che può tirare il liquido attraverso la cartuccia durante ciascuna delle seguenti fasi. Designare una cartuccia per ogni campione di peptide.
  2. Aggiungere 800 luna dell'80% di acetonitrile (ACN) in 0,2% di acido formico alle cartucce con il 19,8% di acqua e utilizzare l'aspirazione del vuoto per tirare attraverso il liquido. Ripetere questo passaggio 1x, evitando completamente l'essiccazione delle cartucce.
  3. Cartucce Equilibrat aggiungendo 800 litri di acido formica dello 0,2% in acqua con aspirazione a vuoto per estrarre l'intero volume attraverso il filtro. Ripeti questo 2x. Caricare i peptidi sulle cartucce con aspirazione sottovuoto. Lavare i peptidi 2x con 800 l un'unità di acido formica dello 0,2% nell'acqua sotto aspirazione sotto vuoto.
  4. Disporre i tubi di microcentrismo da 1,5 ml sotto ogni cartuccia per raccogliere l'eluizione dei peptidi nella fase finale. Sotto aspirazione sottovuoto elicono peptidi da cartucce, prima con 800 - L di 80% ACN in 0,2% acido formica e 19,8% di acqua, poi con 400 l della stessa soluzione. Asciugare completamente i campioni di peptidi dissalati in un concentratore sottovuoto (2-3 h).

3. Arricchimento simultaneo di peptidi K-acetylated e K-succinylato con perline immunoaffinità

  1. Risospendere i peptidi secchi in 1,4 mL di tampone di purificazione dell'immuno-affinità fredda 1x (IAP). Vortice per mescolare e garantire un pH di 7 dollari. Centrifuga a 10.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi. Può apparire un piccolo pellet.
  2. Mettere da parte i peptidi sul ghiaccio durante la preparazione di perle anticorpo. Ad un tubo di K-acetil e tubo di licche anticorpo K-succinyl (volume: 100 L di liquami per tubo), aggiungere 1 mL di fredda 1x fosfato-buffered salina (PBS) e mescolare da pipettaggio. Trasferire l'intera soluzione su un nuovo tubo da 1,5 mL e ruotare in miniatura per 30 s a RT.
  3. Aspirate il PBS, avendo cura di evitare di aspirare eventuali perline. Ripetere il lavaggio 3x lavando di nuovo con 1 mL di 1x PBS freddo, centrifugeno per 30 s a RT e aspirando al PBS.
  4. Sospendere nuovamente le perline in circa 440 gradi di PBS. Un quarto del numero di perline in ogni tubo PTM (100, fornito dal produttore) viene utilizzato per l'arricchimento di una pentola (circa 62,5 g di ogni anticorpo immobilizzato sia per le perle anticorpali K-acetyl che K-succinyl). Pipette le perline più volte per mescolare bene. Togliere 100 l' di perline anticorpo acetil-lisine e trasferirle in un tubo con punte pretagliate di 200, assicurando che il mix master rimanga costantemente ben miscelato.
  5. Fate lo stesso con le perle anticorpi succinyl-lysine rimuovendo 100 -L di perline di anticorpi succinyl-lysine al tubo per raggiungere parti uguali dell'anticorpo acetil-lysina e anticorpo succinyl-lysine in ogni tubo. Girare verso il basso per 30 s in una centrifuga in miniatura e aspirare fuori supporto con punta caricatore gel (perline diventerà bianco).
    NOTA: Ogni tubo dovrebbe avere un pellet di perline simile nella parte inferiore.
  6. Pipette il peptide risospeso direttamente sulle perline lavate. Fare attenzione a evitare eventuali pellet (aggiungere rapidamente per evitare di asciugare le perline). Incubare i peptidi con perline a 4 gradi durante la notte con agitazione.

4. Elusione dei peptidi legati a perline anticorpali

  1. Girare i campioni di peptide a 2.000 x g per 30 s a 4 gradi centigradi. Rimuovere il super-natante contenente peptidi non legati e risparmiare per esperimenti futuri, se lo si desidera. Aggiungere 1 mL di tampone iAP freddo 1x alle perline da lavare e mescolare invertendo 5x. Girare a 2.000 x g per 30 s a 4 gradi centigradi. Aspirare la soluzione IAP e ripetere il passaggio di lavaggio IAP 1x per un totale di due lavaggi.
  2. Aggiungere 1 mL di acqua fredda HPLC alle perline e mescolare invertendo 5x. Girare a 2.000 x g per 30 s a 4 gradi centigradi. Aspirate fuori dall'acqua. Ripetere il passaggio di lavaggio dell'acqua due volte per un totale di tre lavaggi. Girare un tempo supplementare a 2.000 x g per 30 s a 4 gradi centigradi per raccogliere l'acqua rimanente nel fondo del tubo. Aspirate fuori qualsiasi acqua in più che può avere raccolto con punte di caricamento gel a punta piatta. Fare attenzione a evitare di aspirare le perline.
  3. Aggiungere 55 - L di 0,15% di acido trifluoroacetico in acqua alle perline. Incubare le perline per 10 min a RT mentre di tanto in tanto toccando il fondo del tubo per mescolare. Girare le perline a RT per 30 s in una centrifuga in miniatura. Rimuovere i peptidi eluiti e mettere da parte utilizzando una punta di caricamento gel con punta piatta.
  4. Aggiungere 45 ldi dello 0,15% di acido trifluoroacetico nell'acqua alle perline. Incubare per 10 min a RT mentre si tocca il fondo del tubo di tanto in tanto per mescolare. Girare le perline a RT per 30 s in una centrifuga in miniatura. Rimuovere la seconda eluizione utilizzando una punta di carico gel a punta piatta e combinarla con la prima eluizione.
  5. Girare i peptidi eluiti combinati a 12.000 x g per 5 min a RT per pellet eventuali perline che portano oltre. Trasferire la soluzione campione di peptidi in un nuovo tubo da 500.
    NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.

5. Dealando di peptidi arricchiti

NOTA: il pH dei campioni deve essere inferiore a 4 per un legame ottimale alla punta contenente resina C18. Per controllare la punta della punta, utilizzare una punta da 10 pipette contenente 0,6 l litri di resina C18 e una pipetta da 10 l.

  1. Pre-bagnare la punta C18 convogliando 10 - L di acetonitrile nella punta. Distribuisci l'acetonitricle nei rifiuti. Ripetere questo passaggio altre due volte.
  2. Evitala con la mancia 3x con 10-l di 0,2% di acido formica nell'acqua. Distribuisci la soluzione nei rifiuti dopo ogni equilibratura.
  3. Caricare i peptidi dal campione sulla punta per pipettando e erogando continuamente il campione arricchito di peptidi con la punta. Pipetta su e giù ripetutamente almeno 20x e dispensare la soluzione rimanente dalla punta.
  4. Lavare la punta contenente il peptide legato con 10 ,l di 0,2% di acido formico in acqua. Distribuisci la soluzione in rifiuti. Ripetere questo passaggio 9x.
  5. Elute peptidi in un nuovo tubo utilizzando 10 L di un tampone di eluizione contenente lo 0,2% di acido formico, 50% acetonitrile e 49,8% acqua. Ripetutamente pipetta e erogare i 10 l di soluzione all'interno del nuovo tubo 15x. Ripetere questo passaggio con un ulteriore buffer di 10 gradi, che si inserisce ripetutamente nello stesso tubo dell'eluizione precedente.
  6. Peptidi secchi completamente in concentratore di vuoto (circa 20 min). Risospendere i peptidi secchi in un volume appropriato dello 0,2% dell'acido formica nell'acqua.
    NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.

6. Acquisizione di dati con DDA e DIA

NOTA: Analizzare i campioni con i metodi DDA e DIA LC-MS/MS, che possono essere regolati in base allo strumento spettrometrico di massa disponibile. Qui, i campioni sono stati analizzati utilizzando un sistema HPLC nano-LC 2D accoppiato a uno spettrometro di massa ad alta risoluzione.

  1. Utilizzare un sistema HPLC combinato con un sistema HPLC a piattaforma basata su chip collegato direttamente a uno spettrometro di massa (molte configurazioni e sistemi LC-MS possono essere utilizzati).
  2. Analisi dei campioni utilizzando HPLC-ESI-MS/MS in fase inversa
    1. Dopo l'iniezione, trasferire le miscele di peptidi su un chip precolonna C18 e dissalare i peptidi lavando con fase mobile A a 2 l/min per 10 min. Quindi, trasferire i peptidi in una colonna analitica ed eluire ad una portata di 300 nL/min con un gradiente di 2-3 h utilizzando le fasi mobili A e B. In particolare, utilizzare un gradiente lineare dal 5% di fase mobile B al 35% di fase mobile B su 80 min.
    2. Successivamente, scalare la fase mobile B all'80% oltre i 5 min, quindi tenere all'80% B per 8 min prima di tornare al 5% B per un riconquilicimento di 25 min.
  3. Costruire un metodo di strumento MS per DDA e definire i seguenti esperimenti di scansione dello strumento
    1. Esperimento 1: scansione ione precursore MS1 da m/z 400-1,500 (tempo di accumulo di 250 ms). Impostare la soglia di intensità per attivare le scansioni MS/MS per gli stati di carica da 2-5 a 200. Impostare l'esclusione dinamica degli ioni precursori su 60 s.
    2. Esperimento 2: scansione ioscosa prodotto MS/MS con una gamma di scansione MS2 100-1.500 (tempo di accumulo di 100 ms per ogni scansione iolotta di 30 prodotti per ciclo). Impostare la diffusione dell'energia di collisione su CES 5, quindi selezionare la " modalità discansione ioscio prodotto ad alta sensibilità".
      NOTA: Il metodo DDA acquisirà gli spettri MS/MS per i 30 ioni precursori più abbondanti dopo ogni indagine MS1 scan per ciclo, e il tempo totale del ciclo sarà di 3,3 s. le acquisizioni DDA saranno utilizzate per costruire librerie spettrali come descritto nella sezione 7.
  4. Creazione di un metodo di strumento MS per DIA e definizione dei seguenti esperimenti di scansione dello strumento.
    1. Esperimento 1: eseguire la scansione ione precursore di MS1 da m/z 400-1,250 (tempo di accumulo di 250 ms).
    2. Esperimento 2: eseguire scansioni ioniche di prodotto MS/MS per 64 segmenti SWATH variabili con un intervallo di scansione MS2 da m/z 100-1.500 (tempo di accumulo di 45 ms per ogni scansione iolotta di 64 prodotti per ciclo). Impostare la diffusione dell'energia di collisione su CES 10, quindi selezionare la " modalità discansione iosciata del prodotto ad alta sensibilità".
    3. Utilizzare la strategia di acquisizione DIA/SWATH della finestra variabile 64 come descritto da Schilling et al.22 per ottenere la quantificazione senza etichette con un tempo di ciclo totale di 3,2 s. In breve, in questa acquisizione, invece del quadrupolo Q1 che trasmette un intervallo di massa ristretto attraverso la cella di collisione, una finestra più ampia di larghezza variabile della finestra (5 -90 m/z) viene passata in passaggi incrementali sull'intero intervallo di massa (m/z 400 -1,250 con 64 segmenti SWATH, ciascuno con un tempo di 45 ms, producendo un tempo di ciclo di 3,2 s, che include una scansione MS11, che include una scansione MS11, che include una scansione MS1, che include una scansione MS1, che include una scansione MS1, che include una scansione MS1, che include una scansione MS11, che include una scansione MS1, che include una scansione MS1 con un tempo di accumulo di 250 ms).
      NOTA: La larghezza variabile della finestra viene regolata in base alla complessità della corrente tipica degli ioni MS1 osservata all'interno di un determinato intervallo m/z utilizzando un algoritmo di calcolatrice della finestra variabile22 (le finestre più strette vengono scelte negli intervalli "occupato" m/z, le finestre ampie in intervalli m/z con pochi ioni precursori di eluizione). Su altre piattaforme di strumenti MS, altre strategie di finestra DIA possono essere implementate.

7. Analisi dei dati

NOTA: alcune impostazioni di analisi dei dati devono essere modificate e adattate all'esperimento specifico. Ad esempio, il database delle proteine (file FASTA) selezionato dipende dalla specie da cui è stato preparato il campione (qui Mus musculus). Di seguito è descritta l'analisi dei dati per i campioni di topi arricchiti per peptidi acetilati e succinylati.

  1. Utilizzare un motore di ricerca di database MS per analizzare le acquisizioni DDA. Creare un metodo del motore di ricerca di database come indicato di seguito:Create a database search engine method as follows:
    1. Per i parametri di descrizione del campione: selezionare " Identificazione" in Tipo di campione, selezionare " Acidoiodoacetico" sotto "Cysteine Alkylation", selezionare "Trypsin" in "Digestione" (supponendo che la scissione del terminale C in lisina e arginina), selezionare "TripleTOF 6600" sotto Strumento, sotto Fattori speciali, controllare l'enfasi dell'acetatura e Succinylation enrichment.
    2. Per i parametri di elaborazione specifici: selezionare "Modifiche biologiche" in ID Focus, selezionare "SwissProt" in Database, selezionare "Thorough ID" in Search Effort, selezionare "0.05 (10%)" in "Soglia proteina rilevata" e selezionare "Esegui False Discovery Rate Analysis" in "Qualità risultati". Salvare il metodo del motore di ricerca e inviare i file non elaborati spettrometrici di massa per l'elaborazione da parte del motore di ricerca del database utilizzando il metodo generato.
      NOTA: In un processo iterativo, tutte le scansioni MS e MS/MS vengono automaticamente ricalibrate dal motore di ricerca in base alle annotazioni e ai risultati iniziali.
  2. Fare clic su "Esporta Peptide Summary" al termine della ricerca e filtrare tutti i risultati di identificazione dei peptidi da una "soglia di confidenza" di 99 in un software per fogli di calcolo (ad esempio, Excel; falso tasso di scoperta [FDR] dell'1%).
  3. Nel file del foglio di calcolo "Peptide Summary", filtra tutti i peptidi che contengono l'annotazione PTM "acetila "e "succinylation" nella colonna di modifica per generare un rapporto sui risultati per presentare esclusivamente i peptidi aclati e le loro proteine corrispondenti.
  4. Per creare librerie spettrali MS/MS per un'ulteriore elaborazione del file NON elaborato DIA e un'ulteriore quantificazione relativa, aprire il software di analisi quantitativa DIA. Selezionare la scheda "Libreria", quindi (nella parte inferiore della pagina) fare clic su "Genera libreria spettrale" da "Motore di ricerca database" e aprire un report FDR del motore di ricerca di database (il file FDR.xlsx), che è stato generato automaticamente come parte del processo di ricerca di database raw DDA. Quindi, fare clic su "next" e selezionare "LibrarySettings Schema" e "next". Selezionare "Uniprot_mouse_proteome" come database, quindi fare clic su "next" e "goa_mouse" come file di annotazione genica (ontologia). Infine, fare clic su "fine" e verrà generata la libreria spettrale.
    NOTA: le informazioni sui peptidi acetilati e succinylati provenienti dai file di dati grezzi DDA, le scansioni ioniche precursori di MS1 e le scansioni a ioni di frammento di MS2 saranno incluse nelle librerie spettrali (inclusi il tempo di conservazione, il modello di frammentazione MS/MS, ecc.).
  5. Utilizzare il software di analisi proteomica quantitativa DIA per eseguire la quantificazione relativa dei livelli di acetilazione e succinylazione e creare fogli di calcolo di peptidi corrispondenti contenenti PTM che possono essere utilizzati per un'ulteriore analisi dei dati.
    1. Per analizzare e quantificare i peptidi contenenti PTM aprire il SOFTWARE di analisi quantitativa DIA, utilizzare lo schema di analisi del modello. Lo schema del modello è disponibile nel software selezionando l'opzione "Prospettiva delle impostazioni" "Analisi DIA" "PTM BGS" (significativi o sparsi, a seconda dell'esperimento).
      NOTA: invece di utilizzare il modello di analisi PTM BGS nel SOFTWARE di analisi quantitativa DIA, tutte le impostazioni specifiche di PTM possono anche essere configurate manualmente seguendo queste istruzioni: 1) in "identificazione", selezionare "Localizzazione PTM" (taglio di probabilità - 0,75); 2) in "quantificazione", selezionare "raggruppamento peptide minore" "sequenza modificata"; e 3) sotto "post-analisi", selezionare "raggruppamento di abbondanza differenziale" "gruppo minore" (impostazioni di quantificazione). Queste impostazioni attiveranno la funzione di localizzazione PTM in modo che i peptidi modificati siano elencati come singole voci e l'analisi differenziale viene eseguita a livello di peptide.
    2. Per avviare l'analisi della quantificazione, selezionare la scheda "Pipeline", quindi fare clic su "Imposta un'analisi DIA da file", aprire i file non elaborati DIA di interesse per la quantificazione relativa. Selezionare "Assegna libreria spettrale" e selezionare la libreria creata sopra, fare clic su "carica" . "next". Selezionare lo schema di analisi "BGS PTMs" e fare clic su "Avanti". Selezionare il file FASTA di database appropriato "Uniprot_mouse_proteome" "next". Definire il set-up della condizione, che assegna le diverse condizioni agli esempi, e fare clic su "Avanti". Selezionare "goa_mouse" come file di annotazione genica (ontologia) e fare clic su "avanti". Rivedere la panoramica dell'analisi (riepilogo della configurazione dell'esperimento) e selezionare " directory dioutput" . "finitura". Infine, fare clic su "Esegui pipeline" per eseguire l'analisi quantitativa senza etichette.
      NOTA: I moduli statistici del SOFTWARE di analisi quantitativa DIA eseguono automaticamente analisi FDR, generano mappe di calore e grafici vulcanici confrontando le diverse condizioni, generano elenchi di peptidi e proteine identificati e quantificati e forniscono Q-valori insieme a variazioni di piegatura relative confrontando condizioni diverse.
  6. In alternativa, utilizzare un software per la rimozione delle interferenze dei set di dati DIA per l'elaborazione dei dati e l'esecuzione di analisi statistiche dopo l'esportazione delle aree di picco estratte per i siti di acetilazione e succinylation.

8. Visualizzazione dei dati dei peptidi modificati e valutazione della localizzazione del sito PTM

  1. Per aprire un'analisi quantitativa DIA generata, selezionare la scheda "Analisi" seguita da "caricare l'esperimento software di analisi quantitativa" (da un esperimento salvato che apre un file . SNE). Passare al . SNE risultati e selezionare "apri".
  2. Nel pannello a sinistra, fare clic sulla freccia a sinistra del terzo file .wiff di dati non elaborati dall'alto per espandere e visualizzare tutti i 64 segmenti SWATH. Fare clic sulla freccia a sinistra del segmento [428.7-437.3] per espandere il segmento specifico e visualizzare i peptidi modificati identificati per questa gamma di massa. Clicca sul peptide triplo KQYGEAFEK[Acetyl]R.
    NOTA: per impostazione predefinita, il pannello superiore destro visualizza in genere MS2 XIC, mentre il pannello inferiore visualizza MS1 Isotope Envelope XIC
    1. Nel pannello superiore, selezionare "PTM Localization Plot". Nel pannello inferiore, selezionare "PTM Localization Plot".
    2. Nel grafico di localizzazione PTM, selezionare la sequenza superiore di peptidi "KQYGEAFEK[Acetyl]R", con un punteggio di localizzazione PTM totale di 18,32. Fare clic sulla freccia a sinistra per espandere la vista e visualizzare gli ioni di conferma e confutazione. Fare clic sulla freccia accanto a "Conferma ioni", quindi selezionare lo ione "y3 [-42]" per evidenziare quel particolare ione, che conferma che il sito di acetilazione si trova sul K2 della sequenza peptide.
    3. Nel ptM Localization Plot selezionare la seconda sequenza di peptidi "K[Acetyl]QYGEAFEKR" con un punteggio di localizzazione PTM totale (molto basso) pari a 1. Fare clic sulla freccia a sinistra per espandere la vista e visualizzare gli ioni di conferma e confutazione. Fare clic sulla freccia accanto a "Conferma ioni", quindi sulla freccia accanto a "Confutando Ioni", quindi selezionare alcuni ioni di frammento per visualizzare e valutare il cromatogramma iostrato e spettrale MS/MS (Figura 5).
      NOTA: il punteggio di localizzazione PTM assegnato e l'ispezione visiva indicano che il isomer PTM corretto è KQYGEAFEK[Acetyl]R, mentre non esistono prove o minime per l'altro possibile isomer PTM K[Acetyl]QYGEAFEKR.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La figura 1 mostra un diagramma generale del flusso di lavoro, tra cui la raccolta del tessuto dai fegati di topo, l'utilizzo di 1 mg di proteine per digerire la proteina lisata con la trypsina, l'incubazione di peptidi con perline anticorpo coniugate, l'acquisizione dei campioni sulla SM e infine l'analisi DIA/SWATH dei dati utilizzando vari pacchetti software proteomica quantitativa (accademico e commerciale).

Figura 2A mostra come la tempistica del flusso di lavoro e la quantità di campione e proteine necessarie, rispetto ai metodi alternativi attualmente utilizzati per gli studi di arricchimento multi-PTM. Il metodo one-pot può essere eseguito in altrettanto tempo e con la metà del numero di campioni come questi metodi alternativi. Rispetto ai due metodi di arricchimento single-PTM, il protocollo one-pot richiede anche la metà della quantità di proteine.

Questo protocollo si è dimostrato un'alternativa fattibile ed economica. La figura 2B mostra che il coefficiente mediano di variazione (CV) per le aree peptidiche modificate era inferiore nel metodo one-pot rispetto agli arricchimenti single-PTM e serial-PTM. La figura 2C,D mostra che, mentre si confrontano i metodi di arricchimento PTM one-pot e single-PTM, non sono emerse differenze degne di nota tra le correlazioni delle quantificazioni a livello di sito per le due modifiche. Ciò valeva anche per le correlazioni a livello di peptide e frammento. La stessa osservazione ha tenuto per tutte e tre le correlazioni quando si confrontano gli arricchimenti monovaso e seriale-PTM. Tutti i dati grezzi MS sottostanti e i fogli dei risultati di Excel elaborati associati a un recente report di Basisty et al.14 sono disponibili e possono essere scaricati da MassIVE (MSV00081906) e ProteomeXchange (PXD008640).

In generale, mentre le strategie di arricchimento degli anticorpi possono mostrare alcune limitazioni, come la potenziale occlusione epitope o la specificità limitata, gli anticorpi utilizzati in questo studio sono miscele di cloni generati in modo indipendente e quindi forniscono ampie gamme di Specificità.

I risultati sperimentali documentano la possibilità di rilevare e valutare il crosstalk PTM. Nella figura 3 vengono visualizzati i dati di un arricchimento riuscito e viene illustrato un esempio per un peptide contenente modifiche acilimultiple e diverse che visualizzano il crosstalk PTM. Figura 3A mostra un peptide che è acetilato su un residuo di lisina e succinylato sull'altro, e Figura 3B mostra lo stesso peptide succinylato a entrambe le lisine. Ciò dimostra che lo stesso residuo di lisina può essere modificato con entrambi i gruppi di aclazione, e c'è la possibilità che si verifichino trasversali in quel sito. Nella figura 4 viene visualizzato il numero di residui di lisina identificati come descritto nelle sezioni 7.1-7.3 per trasportare entrambe le modifiche, indicando anche il possibile crosstalk PTM.

Come dimostra la Figura 5, l'elaborazione di set di dati DIA PTM con software proteomico quantitativo ci consente di individuare quali residui di lisina specifici vengono modificati. Questo è un concetto noto come localizzazione del sito, che è un passo essenziale per qualsiasi analisi per la determinazione di possibili crosstalk PTM. Nella figura 5 sono illustrate due isoformi potenziali insieme agli ioni di conferma e confutazione per ciascuno che possono essere visualizzati e valutati come descritto nelle sezioni 8.1-8.3 (in particolare i passaggi 8.3.2 e 8.3.3). Sulla base di queste informazioni, siamo stati in grado di identificare con sicurezza quale dei due isoformi era presente nel campione originale. Lo spettro MS/MS dell'isoforme confermato KQYGEAFEKacR dimostra chiaramente che gli ioni y (y2-y5) contenenti il residuo di lisina acetilata, che si è spostato di 42 m/z (la massa di incremento di un gruppo di acetil), ha confermato il residuo di lisina specifico nel pep che è stato modificato.

figure-results-1
Figura 1: flusso di lavoro tipico per l'arricchimento di PTM. Tessuti (qui, fegati) vengono raccolti da SIRT5 KO e topi selvatici (WT), e le proteine sono lised, rompin-digerito in peptidi, e dissalato. I peptidi vengono poi arricchiti dall'immunoaffinità con combinazioni di perline di succnyl e acetil-anticorpo. I flussi di lavoro di SM paralleli misurano sia 1) piccole variazioni dell'espressione di proteina lisata (per la normalizzazione delle proteine) che 2) peptidi contenenti acitali per l'identificazione del sito di acilazione (DDA-MS) e la localizzazione del sito, seguiti dalla quantificazione (DIA-MS). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Confronto del flusso di lavoro con un solo piatto con metodi alternativi. (A) Confronto di tempo, costi e materiali necessari per il flusso di lavoro di un piatto, l'arricchimento seriale-PTM e due arricchimenti monoptM. (B) Confronto dei CV tra il flusso di lavoro un vaso, l'arricchimento di PTM ad acetil singolo e l'arricchimento di PTM con succino unico. Analisi di correlazione Diearman confrontando le aree di picco del peptide acyl ottenute dal flusso di lavoro one-pot e gli arricchimenti single-PTM: i grafici corrispondenti dei risultati dell'area di picco log2 per i siti di acetilazione (C)e i siti di succinylazione(D). Le pendenze di regressione e i fattori di correlazione sono indicati nei singoli pannelli14. Sono state elaborate due repliche biologiche indipendenti per ciascuna delle condizioni. Questa cifra è stata modificata da Basisty etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Crosstalk tra acetilazione e succinylation modifiche dei residui di lisina. SS/MS spectra di peptidi triptici da mitocondriali 3-ketoacyl-CoA tiolasi che mostrano la stessa sequenza di amminoacidi, ma sono stati modificati a due residui di lisina con PPM diversi. (A) MS/MS del peptide AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKacK e(B)MS/MS del peptide AANEAGYFNEEMAPIEPIEPIEVKsuccK. Questa cifra è stata modificata da Basisty etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Sovrapposizione e crosstalk tra i residui di lisina acetilati e succinylati-esempi specifici nei complessi proteici. (A) Diagramma di Venn che mostra la sovrapposizione tra 2.235 acetilazione e 2.173 siti di succinylation. Di questi, 943 siti erano entrambi acetilati e succinylati. Il fegato di un topo da urlo SIRT5 (de-succinylase) è stato analizzato e sono stati identificati molti siti di succinylazione. Infatti, erano più abbondanti del normale osservato nel fegato di topo (i peptidi modificati sono stati filtrati ad un valore Q di <0.05). (B) Complessi proteici che mostrano la percentuale delle loro sottounità contenenti sia siti acetilati che succinylati (linea rossa audace rappresenta il significato determinato dal test esatto di Fisher). (C) Diagramma del complesso synthase ATP: le sottounità proteiche in rosso raffigurano le sottounità che contengono sia siti acetilati che succinylati. Questa cifra è stata modificata da Basisty etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-5
Figura 5: Il software proteomico quantitativo decifra la localizzazione del sito di peptidi delle PTM. Sulla base della frammentazione MS/MS del peptide, è possibile fornire informazioni sul residuo specifico di lisina che il gruppo di acetil sta modificando. Questo mette in mostra la capacità del software di offrire informazioni preziose sulla localizzazione del sito di PTM. (A) Due possibilità di modifica dei residui di lisina e localizzazione del sito PTM: KQYGEAFEKacR (a sinistra) e KacQYGEAFEKR (destra). Per ciascuna delle potenziali isoforme di localizzazione del peptide vengono mostrati gli ioni di frammentazione "Conferma" e "confutante". Sulla base di queste informazioni, confermando i punteggi e confutando i punteggi, confermando la presenza diKacR isoforme KQYGEAFE nel campione. (( B) lo spettro MS/MS corrispondente all'isoforma confermata KQYGEAFEKacR indica che tutti gli ioni, compresi i residui di lisina acetilata (y2 e superiori) hanno una massa di incremento di 42 m/z, che corrisponde alla modifica dell'acetil. Gli ioni b osservati non contengono la modifica. (C) Estraendo il cromatogramma iostico (XIC) con abbondanti aree di picco risultanti da y2 e y3 ioni, entrambi i quali costituiscono il sito di acetilazione nel confermato isoforme KQYGEAFEKacR. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive una nuova tecnica per l'arricchimento simultaneo di più PTM per comprendere in modo più efficace il crosstalk PTM. I metodi alternativi per raggiungere questo obiettivo tendono ad essere proibitivi in termini di tempo e costosi, e richiedono grandi quantità di proteine per avere successo11,13. Questo protocollo presenta un flusso di lavoro di arricchimento multi-PTM che prevede l'incubazione in perline coniugate agli anticorpi per due PPM contemporaneamente per migliorare l'efficienza complessiva dell'esperimento. Questo metodo prevede anche l'uso di DDA per la generazione di librerie spettrali e acquisizioni DIA MS per rilevare e quantificare i peptidi presenti con le interferenze ridotte da ioni di frammento22,23. I programmi software, come i motori di ricerca di database MS, vengono utilizzati per analizzare e quantificare i dati delle acquisizioni DDA, mentre Quantitative Proteomics Software24 e specifico DIA Quantitative Analysis Software25 sono necessari per interpretare i complessi spettri prodotti dalle acquisizioni DIA.

Ci sono diversi passaggi critici all'interno di questo protocollo che devono essere seguiti con attenzione. Poiché l'obiettivo principale del protocollo è quello di arricchire simultaneamente per più PTM, la fase di arricchimento dell'affinità anticorpale (sezione 2) è fondamentale per il successo dell'esperimento. Quando si eseguono fusa sulle perline, è necessario assicurarsi che nessuna delle perline sia aspirata accidentalmente. È necessario anche garantire che la concentrazione di urea sia stata diluita a 1 M prima della digestione con la trypsin (passaggio 1.8). Anche se 8 M di urea è richiesto all'inizio del protocollo per la solubilità delle proteine, le concentrazioni di urea superiori a 1 M inibiranno l'attività enzimatica di trypsin. Inoltre, è importante controllare costantemente il pH del campione durante tutto il protocollo. Questo è particolarmente importante prima della digestione. Se il pH del campione e la soluzione di trypsin non vengono neutralizzati in modo appropriato prima dell'incubazione, può provocare una digestione inefficiente in cui molti siti di scissione possono essere persi, con conseguente minor identificazione dei peptidi.

Alcune modifiche al protocollo possono essere utili durante la preparazione dei campioni. Per una proteina lisato procurato da 1 mg di materiale di partenza, un quarto delle perle anticorpali fornite in ogni tubo di scansione PTM può essere utilizzato come alternativa conveniente. Una maggiore quantità di materiale di partenza può essere utilizzato per risultati migliori, purché la quantità di perline anticorpali utilizzate siano aumentate proporzionalmente. Un'altra modifica che può migliorare il flusso di lavoro consiste nel digerire i campioni con un'altra proteasi oltre alla trypsin. Questa modifica comporterebbe una maggiore variabilità nei peptidi scissi, fornendo una maggiore copertura dei residui proteici. Anche se non è necessario, si raccomanda che la trypsin sia uno degli enzimi utilizzati per l'analisi PTM a causa della sua elevata specificità di scissione26.

Una limitazione di questo protocollo è che le PTM studiate devono avere prodotti chimici simili per essere arricchiti contemporaneamente14. Le procedure per le diverse perle coniugate anticorpi devono essere simili, utilizzando solventi e soluzioni simili, comprese condizioni di eluizione simili, e preferibilmente dallo stesso fornitore. Per questo motivo, il metodo qui descritto utilizza costantemente l'acetilazione e la succinylazione come esempio, entrambi utilizzano perline coniugate anticorpi (Cell Signaling Technology, Inc). Anche se questo metodo può teoricamente essere applicato a un numero qualsiasi di PTM, sarebbero necessari ulteriori studi per valutare l'esatta limitazione del protocollo a questo proposito. Inoltre, poiché si tratta di un metodo di arricchimento basato su anticorpi, il metodo può fornire solo una quantificazione relativa dei siti PTM.

Rispetto ai metodi di arricchimento multi-PTM esistenti, questo flusso di lavoro è un'alternativa più fattibile ed economica. Da questo esperimento, è stato osservato che l'efficacia di questo metodo si confronta molto bene con metodi alternativi, come gli arricchimenti individuali o seriali. La figura 2B mostra che il CV mediano per le aree di picco peptidiche modificate è stato effettivamente diminuito nel metodo one-pot rispetto agli arricchimenti a PTM singolo e agli arricchimenti seriali-PTM13. Abbiamo analizzato ulteriormente i risultati sperimentali valutando le quantificazioni a livello di sito per l'acetilazione o la succinylazione. Inoltre, l'analisi di correlazione di Spearman (Figura 2C,D) ha dimostrato che l'arricchimento PTM con un solo vaso ha eseguito in modo simile ai flussi di lavoro di arricchimento a PTM singolo. Ciò valeva anche per le correlazioni a livello di peptide e di frammento. La stessa osservazione ha tenuto per tutte e tre le correlazioni quando si confronta un vaso con l'arricchimento seriale-PTM.

Questo protocollo consente ai ricercatori di fare affascinanti intuizioni biologiche sul crosstalk PTM in modo rapido ed economico. La componente DIA del flusso di lavoro consente ai ricercatori di comprendere meglio i PTM, in quanto fornisce informazioni sulla localizzazione del sito e supera sfide come la bassa occupazione del sito di PTM. Gli ioni precursori tendono ad essere esclusi con La DDA, che è particolarmente importante quando studiano i PTM, poiché l'occupazione del sito è spesso bassa al punto che questi peptidi non vengono selezionati per MS/MS ma contengono ancora informazioni cruciali. È possibile eseguire esperimenti di follow-up per valutare il limite superiore di quanti PTM possono essere arricchiti contemporaneamente utilizzando questo metodo. Un miglioramento futuro di questo flusso di lavoro può includere lo sviluppo di piattaforme software più avanzate per automatizzare ulteriormente l'analisi della localizzazione del sito e l'occupazione del sito PTM.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Riconosciamo il sostegno della sovvenzione di strumentazione condivisa NIH per il sistema TripleTOF presso il Buck Institute (1S10 OD016281). Questo lavoro è stato sostenuto anche dall'Istituto Nazionale di Allergia e Malattie Infettive (da R01 AI108255 a B.S.) e dall'Istituto Nazionale di Diabete e Malattie Digestive e Renali (da R24 DK085610 a Eric Verdin; R01 DK090242 a Eric Goetzman). X.X. è stato sostenuto da una sovvenzione del National Institutes of Health (NIH grant T32GM8806, a Judith Campisi e Lisa Ellerby), N.B. è stata sostenuta da una borsa di studio post-dottorato della Glenn Foundation for Medical Research.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 M Tampone di biocarbonato di trietilammonio (TEAB)Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USAT7408
Acetonitrile, Burdick e Jackson Grado LC-MS Burdicke Jackson, Muskegon, MI, USA36XL66
Sonicatore BioruptorDiagenode, Denville, NJ, USAB01020001
C18 chip pre-colonna (200 µ m x 6 mm Chip ChromXP C18-CL, 3 um, 120 A)SCIEX, Framingham, MA, USA5015841
chip C18-CL (75 &; micro; m x 15 cm ChromXP, 3 &; m, 300 Å)SCIEX, Framingham, MA, USA804-00001
Ditiotreitolo (DTT)Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USAD9779-5G
Eppendorf Thermomixer CompactEppendorf AG, Amburgo, GermaniaT1317-1EA
Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock)Eppendorf AG, Amburgo, Germania22363352
Acido formicoSigma Aldrich, St. Louis, MO, USAF0507-500ML
Standard del peptide di normalizzazione del tempo di ritenzione indicizzato (iRT)Biognosys AG, Schlieren, Zurigo, SvizzeraKi-3002-2
Iodoacetamide (IAA)Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USAI1149-25G
mapDIAweb linksoftware per la rimozione delle interferenze dei set di dati DIA
Metanolo, Burdick e Jackson grado LC-MS Burdicke Jackson, Muskegon, MI, USABJLC230-4
Dispenser di acqua ultrapura PURELAB flex 1VWR International, Radnor, PA, USA89204-088
mProphet in Skylineincorporato in Skylinealgoritmi statistici integrati per le valutazioni FDR
Oasis HLB SPE cartucce WatersCorp., Milford, MA, USAWAT094225cartucce per la desalinizzazione di lisati proteici, fino a 50 mg di materiale
Soluzione salina tamponata con fosfatoLife Technologies10010023
Pierce BCA AssayThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA23225
ProteinPilot 5.0 - 'MS database search engine'SCIEX, Framingham, MA, USAdownload del software SCIEXMS database motore di ricerca
PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764Cell Signaling Tecnologia13764perle di anticorpi per l'arricchimento di affinità
PTMScan Acetil-Lisina Motif [Ac-K] Kit #13416Tecnologia di segnalazione cellulare13416perle di anticorpi per l'arricchimento di affinità
Tripsina liofilizzata di grado sequenziamentoLife Technologies23225
Skyline - 'Quantitative Proteomics Software'MacCosslab (accademico)softwareopen sourceSoftware di proteomica quantitativa (accademico)
Spectronaut - 'DIA Quantitative AnalysisSoftware'Biognosys AG, Schlieren, Zurigo, SvizzeraSw-3001DIA Software di analisi quantitativa / Localizzazione del sito PTM
Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac ConcentratoreThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USASPD131DDA-115strumento per concentrare il volume liquido dei campioni
TissueLyser IIQiagen, Hilden, Germania85300strumento per la lisi efficiente dei tessuti
Acido trifluoroacetico (TFA)Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USAT6508-1L
TripleTOF 6600: spettrometro di massa a tempo di volo a quadrupolo ortoganolo (QqTOF)SCIEX, Framingham, MA, USASpettrometro dimassa ad alta risoluzione
Ultra Plus nano-LC 2D HPLCSCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USASistema di separazione cromatograficamodello #845
UreaThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAPI29700
Water, Burdick and Jackson LC-MSBurdick and Jackson, Muskegon, MI, USA600-30-76
ZipTip C18 Pipette Tips, P10Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRLZTC18S096Punte caricate con resina C-18 per la desalinizzazione di miscele di peptidi

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