Articolo metodologico

Uso di embrioni congelati per la produzione ad alta efficienza di topi geneticamente modificati

DOI:

10.3791/60808

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2 aprile 2020

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1Max Planck Florida Institute for Neuroscience, 2Life Science Research Center, University of Toyama, 3Department of Biochemical Engineering, Graduate School of Science and Engineering, Yamagata University, 4Graduate School of Innovative Life Science, University of Toyama, 5Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Cairo University, 6Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 7Division of Stem Cell Research and Drug Development, Center for Development of Advanced Medical Technology, Jichi Medical University, 8Synthetic Biology Division, Research Center for Advanced Science and Technology, University of Tokyo, 9Institute for Advanced Biosciences, Keio University, 10Graduate School of Media and Governance, Keio University, 11Department of Molecular Oncology, Graduate School of Medicine, Chiba University, 12Department of Biological Sciences, School of Science, University of Tokyo, 13College of Arts and Sciences, University of Tokyo

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Qui presentiamo un metodo modificato per la crioconservazione di embrioni unicellulari, nonché un protocollo che afcoppia l'uso di embrioni congelato ed elettroporazione per la generazione efficiente di topi geneticamente modificati.

Abstract

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L'uso di topi geneticamente modificati (GM) è diventato cruciale per comprendere la funzione genica e decifrare i meccanismi alla base delle malattie umane. Il sistema CRISPR/Cas9 consente ai ricercatori di modificare il genoma con efficienza, fedeltà e semplicità senza precedenti. Sfruttando questa tecnologia, i ricercatori sono alla ricerca di un protocollo rapido, efficiente e facile per la generazione di topi GM. Qui introduciamo un metodo migliorato per la crioconservazione degli embrioni unicellulari che porta ad un più alto tasso di sviluppo degli embrioni congelato. Combinandolo con condizioni di elettroporazione ottimizzate, questo protocollo consente la generazione di topi knockout e knock-in con alta efficienza e bassi tassi di mosaico in breve tempo. Inoltre, mostriamo una spiegazione passo-passo del nostro protocollo ottimizzato, che copre la preparazione del reagente CRISPR, la fecondazione in vitro, la crioconservazione e lo scongelamento degli embrioni unicellulari, l'elettroporazione dei reagenti CRISPR, la generazione di topi e la genotipizzazione dei fondatori. Utilizzando questo protocollo, i ricercatori dovrebbero essere in grado di preparare i topi GM con facilità, velocità ed efficienza senza pari.

Introduzione

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Il sistema di proteina palindromica corta (CRISPR)/proteina 9 (Cas9) associata a cluster regolarmente interspazioe è una svolta scientifica che fornisce una modifica mirata senza precedenti nel genoma1. Il sistema CRISPR/Cas9 è composto da proteine Cas9 e guidaRNA (gRNA) con due componenti molecolari: un RNA CRISPR (crRNA) specifico del bersaglio e un RNA CRISPR (tracrRNA)2 che attiva la transattivazione. Un gRNA indirizza la proteina Cas9 al locus specifico nel genoma, 20 nucleotidi complementari al crRNA e adiacenti al motivo adiacente al protospaziale adiacente (PAM). La proteina Cas9 si lega alla sequenza bersaglio e....

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Protocollo

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Tutte le cure e le procedure adottate in questo studio sono state effettuate secondo le regole e i regolamenti della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Il protocollo sperimentale è stato approvato dal Comitato per la cura degli animali di laboratorio degli animali dell'Università di Toyama, dell'Università di Tokyo, della Jichi University e del Max Planck Florida Institute for Neuroscience. Le informazioni su tutti i reagenti sono riportate nella Tabella dei Materiali.

1. Progettazione di reagenti CRISPR

  1. progettazione crRNA
    1. Visita CRISPR direct19 (https://crispr....

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Risultati

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Il nostro metodo modificato per la crioconservazione degli embrioni a una cellula, compresa l'incubazione in HTF contenente il 20% di FBS per 10 min seguita dalla crioconservazione in 1 M Soluzione DMSO e DAP213, ha migliorato il tasso di sviluppo degli embrioni con gelo nello stadio a due cellule (Figura 1, p , 0,009, test t di Student). Gli embrioni con congelamento sono stati utilizzati per la produzione di topi GM e le condizioni di elettroporazione sono state ottimizzate: cinque ripetiz.......

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Discussione

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Il protocollo descritto consente la generazione di topi GM ad alta efficienza e bassi tassi di mosaico (Tabella 1). Consente ai ricercatori privi di avanzate capacità di manipolazione degli embrioni di creare facilmente topi mutanti perché sfruttano i progressi più recenti e più utili nelle tecnologie di ingegneria riproduttiva e di editing del genoma: ribonucleoproteina CRISPR/Cas9 (RNP) ed elettroporazione in embrioni concongelamento. Questi progressi hanno facilitato e accelerato la generazione dei to.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno informazioni finanziarie rilevanti.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Hitomi Sawada ed Elizabeth Garcia per la cura degli animali. Questo lavoro è stato supportato da KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 e 16K01946) e Hokugin Research Grant (a H.N.), e dal Jichi Medical University Young Investigator Award (per H.U.). La Otsuka Toshimi Scholarship Foundation ha sostenuto M.D.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0.25 M SucroseARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Giappone)SUCROSE
1 M DMSOARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Giappone)1M DMSO
ButorphanolMeiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Giappone)Vetorphale 5mg
Cas9 proteina: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLSIntegrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)1081060
C57BL/6J miceJapan SLC (Hamamatsu, Giappone)N/A
DAP213ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Giappone)DAP213
FBSSigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO)ES-009-C
hCGMOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Giappone)HCG Mochida 3000
HTFARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Giappone)HTF
ICR topiGiappone SLC (Hamamatsu, Giappone)N/A
IsofluranePetterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO)07-893-1389
KSOMARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Giappone)KSOM
LN2 TankChart Industries (Ball Ground, GA)XC 34/18
M2ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Giappone)M2
MedetomidinaNippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Giappone)1124401A1060
MicroscopioNikon Co. (Tokyo, Giappone)SMZ745T
MidazolamSandoz K.K. (Tokyo, Giappone)1124401A1060
Tampone privo di nucleasiIntegrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)1072570
Kitdi estrazione del DNA NucleospinTakara Bio Inc (Kusatsu, Giappone)740952 .5
Vetro scorrevole monoforoMatsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Giappone)S339929
Elettroporatore a un passaggioBEX Co., Ltd. (Tokyo, Giappone)CUY21EDIT II
Paraffina liquidaNACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Giappone)SP 26137-85
Elettrodo a piastra in platinoBEX Co., Ltd. (Tokyo, Giappone)LF501PT1-10, GE-101
PMSGASKA Animal Health Co., Ltd (Tokyo, Giappone)SEROTROPIN 1000
Povidone ioduroProfessional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY)C12400
Ridotto a siero Minimo Essenziale Medium: OptiMEM ISigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO)22600134
Elettroporatore a due fasi NepaGene Co., Ltd. ( Ichikawa, Giappone)NEPA21

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  2. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA - guided DNA endonuclease ....

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CRISPR Cas9elettroporazione dell embrioneembrioni allo stadio di una cellulaprotocollo di crioconservazionefecondazione in vitrotopi knockouttopi knock inriduzione del mosaicismo

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