Method Article

Indurre radici pelose di Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum)

DOI:

10.3791/60828

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March 11th, 2020

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1Key Laboratory of Beijing for Identification and Safety Evaluation of Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, 2Artemisinin Research Center, China Academy of Chinese Medical Sciences, 3College of Life Science, Huaibei Normal University, 4Economic Crop Research Institute Sichuan Academy of Agriculture Sciences, 5Research Center of Buckwheat Industry Technology, Guizhou Normal University

In This Article

Summary

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Descriviamo un metodo per indurre radici pelose da Agrobacterium rhizogenes- trasformazione mediata in grano saraceno tartario (Fagopyrum tataricum). Questo può essere utilizzato per studiare le funzioni geniche e la produzione di metaboliti secondari nel grano saraceno tartario, essere adottato per qualsiasi trasformazione genetica, o utilizzato per altre piante medicinali dopo il miglioramento.

Abstract

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Il grano saraceno tartario (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possiede varie attività biologiche e farmacologiche perché contiene abbondanti metaboliti secondari come i flavonoidi, in particolare la rutina. Agrobacterium rhizogenes sono stati gradualmente utilizzati in tutto il mondo per indurre le radici pelose nelle piante medicinali per studiare le funzioni geniche e aumentare la resa dei metaboliti secondari. In questo studio, abbiamo descritto un metodo dettagliato per generare A. rhizogenes-mediato radici pelose nella TB. I cotiledonti e l'asse ipocotiledonario a 7-10 giorni furono selezionati come espianti e infettati da A. rhizogenes con un vettore binario, che indusse radici pelose avventurose che apparivano dopo 1 settimana. La trasformazione della radice pelosa generata è stata identificata sulla base della morfologia, della selezione della resistenza (kanamycin) e dell'espressione genica del reporter (proteina fluorescente verde). Successivamente, le radici pelose trasformate si sono propagate come richiesto. Nel frattempo, un fattore di trascrizione della mieloblastosi (MYB), FtMYB116, è stato trasformato nel genoma della TB utilizzando le radici pelose mediate da A. rhizogenesper verificare il ruolo del FtMYB116 nel sintetizzare i flavonoidi. I risultati hanno mostrato che l'espressione dei geni correlati ai flavonoidi e la resa di composti pelosi (rutina e quercetina) sono stati significativamente (p < 0,01) promossi da FtMYB116, indicando che le radici pelose mediate da A. rhizogenespossono essere utilizzate come strumento alternativo efficace per studiare le funzioni genetiche e la produzione di metaboliti secondari. Il protocollo dettagliato passo-passo descritto in questo studio per la generazione di radici pelose può essere adottato per qualsiasi trasformazione genetica o altre piante medicinali dopo l'adattamento.

Introduction

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Il grano saraceno tartario (TB)(Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) è un tipo di dicoledone appartenente al genere Fagopyrum e alla famiglia Polygonaceae1. Come tipo di cibo omologato medicina levato, la TB ha ricevuto un notevole interesse a causa della sua composizione chimica distintiva e delle diverse bioattività contro le malattie. La tubercolosi è principalmente ricca di carboidrati, proteine, vitamine e carotenoidi, nonché in polifenoli come fenolici e flavonoidi1. Varie attività biologiche e farmacologiche dei flavonoidi, tra cui antiossidanti, antiipertensive2e anti-infiamm....

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Protocol

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La TB utilizzata in questo studio è stata chiamata BT18, che ha avuto origine dalla razza di "JinQiao No.2" coltivata dal Centro di ricerca di piccolo grano varie della Shanxi Academy of Agricultural Science. I passaggi principali di questo protocollo sono illustrati nella Figura 1.

NOTA: Utilizzare rapidamente la manipolazione relativa agli espianti e, quando possibile, tenere i piatti Petri chiusi per evitare appassimento e contaminazione. Se non diversamente specificato, tutte le incubazioni di espiantazioni sono state condotte sotto la condizione di una luce di 14 ore e di un fotoperiodo scuro di 10-h a 25 ....

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Results

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Agrobacterium rhizogenes-mediato TB trasformazione della radice pelosa
Questo studio descrive il protocollo passo-passo che è stato stabilito per ottenere radici pelose geneticamente trasformate utilizzando A. rhizogenes. Ci sono volute circa 5-6 settimane dall'inoculazione dei semi di TB alla raccolta delle radici pelose identificate, e alcuni passaggi chiave sono raffigurati nella Figura 1 (A-H). In breve, i semi sgusciati sterilizzati.......

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Discussion

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La TB è stata utilizzata in diversi studi relativi ai metaboliti secondari a livelli genetici e metabolici1,2,5,27,28. La coltura delle radici hairy, come fonte unica per la produzione di metaboliti, svolge un ruolo fondamentale nell'ingegneria metabolica29 e può essere utilizzata per alterare le vie metaboliche inserendo i geni correla.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato sostenuto dai Fondi fondamentali di ricerca per gli istituti centrali di ricerca sul welfare pubblico, XKT17002.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2 * Taq PCR MasterMixAidlab, CinaPC0901
Agar polvereSolarbio Life Science, Pechino, CinaA8190
Applied Biosystems 2720 termociclatoreThermoFisher Scientific, USA37834
ASSolarbio Life Science, Pechino, CinaA8110Diluito in DMSO, 100 mM
vettori binariThermoFisher Scientifico (invitrogeno), US/pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)
Cefotaxima, sodioSolarbio Life Science, Pechino, CinaC8240diluito in acqua, 200 mg/mL
CF15RXII micro ad alta velocitàHitachi, GiapponeNo. 90560201
Fabbrica di strumenti medici Guanghuacon piastra di Petri monouso/
Apparecchioper elettroforesi DYY-6CBjliuyi, Pechino CinaECS002301
Kit di RNA vegetale EASYspin PlusAidlab, CinaRN38
ELGA purelab untra bioscienceELGA LabWater, Regno Unito82665JK1819
Spettrofotometro per micropiastre Epochbiotek, enzima di
GatewayThermoFisher Scientific (invitrogen),11789100/11791110
Agitatore multifunzionale HYG-CSuzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. Cina/
KanSolarbio Life Science, Pechino, CinaK8020Diluito in acqua, 100 mg/mL
MLS-3750 Sterilizzatore per autoclaveSanyo, Giappone/
MS sali con vitamineSolarbio Life Science, Pechino, CinaM8521
NaClSolarbio Life Scienza, Pechino, CinaS8210
Altri prodotti chimici non dichiaratiBeijing Chemical Works, Cinaetanolo, bicloruro di mercurio, ecc.
PHS-3C Misuratore di pHShanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, Cinaa008
Kit DNA genomico vegetaleTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTDDP305
RifampicinaSolarbio Life Science, Pechino, CinaR8010Diluito in DMSO, 50 mg/mL
SpectinomicinaSolarbio Life Science, Pechino, CinaS8040Diluito in acqua, 100 mg/mL
SaccarosioSolarbio Life Science, Pechino, CinaS8270
Trans2K DNA MarkerTransGen Biotech, Pechino, CinaBM101-01
TriptoneSolarbio Life Science, Pechino, CinaLP0042
Whatman diametro 9 cm Carta da filtroHangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd/
Estratto di lievito in polvereSolarbio Life Science, Pechino, CinaLP0021
, Yangzhou, Cina reazione BP/LR USA/ USA

References

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  1. Fabjan, N., et al. Tartary Buckwheat ( Fagopyrum tataricum Gaertn .) as a Source of Dietary Rutin and Quercitrin. Agricultural and Food Chemistry. 51, 6452-6455 (2003).
  2. Kim, Y. K., et al.

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Hairy Root InductionAgrobacterium RhizogenesTartary BuckwheatFtMYB116 TransformationFlavonoid BiosynthesisRutin Quercetin AnalysisGenetic TransformationReporter Gene ExpressionSecondary Metabolite YieldPlant Tissue Culture

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